山羊流產(chǎn)衣原體ompA和CPAF基因的序列分析及原核表達

徐海玲，楊 萍，張金生，王滿定，劉廣闊，李夢磊，張 琪*，許信剛*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.咸陽市動物疫病預(yù)防控制中心，陜西咸陽712000；3.甘肅元生農(nóng)牧科技有限公司，甘肅永昌 737200)

羊流產(chǎn)衣原體(Chlamydophilaabortus)屬于衣原體科衣原體屬成員，是一種嚴(yán)格寄生在細(xì)胞內(nèi)的革蘭氏陰性微生物，是引發(fā)羊地方性流產(chǎn)(Enzootic abortion of ewes,EAE)的主要病原[1]。C.abortus能夠通過胎盤感染山羊、綿羊、奶牛等多種動物而引發(fā)母畜流產(chǎn)和死胎，孕婦與患流產(chǎn)衣原體病的家畜直接接觸也可發(fā)生感染，導(dǎo)致流產(chǎn)[2]。C.abortus感染動物造成流產(chǎn)的現(xiàn)象在全世界范圍內(nèi)廣泛分布，在我國也比較多發(fā)，而且感染率呈逐年上升趨勢[3]，造成的經(jīng)濟損失非常嚴(yán)重。由于流產(chǎn)衣原體感染的動物在初期癥狀不明顯，所以常常被忽視或容易造成誤診，目前臨床廣泛應(yīng)用的檢測方法也僅有操作復(fù)雜的補體結(jié)合試驗和敏感性差的間接血凝試驗，對該病的早期診斷有一定程度的局限性，而且尚無針對性的流產(chǎn)衣原體商品化疫苗，從而導(dǎo)致了疾病的傳播[4-5]。C.abortus編碼的外膜蛋白(outer membrane protein，ompA)是一種具有血清型、亞種、種和屬特異性抗原決定簇的基因。作為存在于衣原體外表面的基因，不僅在維持衣原體結(jié)構(gòu)完整性中起重要作用，還具有黏附宿主細(xì)胞，輔助衣原體侵染的功能，也是衣原體從宿主細(xì)胞攝取ATP等物質(zhì)的離子通道[6]，所以在衣原體研究中ompA是最受關(guān)注的組分，也常被用作診斷C.abortus的主要研究基因和研制疫苗的主要候選抗原。C.abortus蛋白酶樣活性因子(chlamydial protease like activity factor，CPAF)是由衣原體合成進而分泌到宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白。研究表明CPAF可中和補體，降解細(xì)胞外抗菌肽，增加感染力和致病性。C.abortus的CPAF作為衣原體和宿主之間相互作用的一個重要分子，具有很強的免疫原性，而且在不同種菌株之間高度保守，可以作為衣原體診斷和疫苗的候選抗原[7-9]。2020年3月陜西省某奶山羊養(yǎng)殖場發(fā)生群發(fā)性流產(chǎn)，經(jīng)過檢測證明是羊流產(chǎn)衣原體感染引起。本試驗分別進行山羊流產(chǎn)衣原體陜西分離株ompA基因和CPAF基因的克隆、序列分析及原核表達，為建立山羊流產(chǎn)衣原體抗體ELISA快速診斷方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 陽性病料 無菌采集陜西某奶山羊場發(fā)生流產(chǎn)母羊的血液以及流產(chǎn)胎兒的肺臟、脾臟、羊水和胎盤，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 山羊流產(chǎn)衣原體陽性血清由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)微生物實驗室保存[5]。pGM-T克隆試劑盒和感受態(tài)細(xì)胞Trans5α、BL21(DE3)為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；pET-28a(+)質(zhì)粒由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院微生物實驗室保存。

1.1.3 主要試劑 DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，天根生化科技有限公司產(chǎn)品；EcoR1、XhoⅠ、BamHⅠ內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶，NEB(北京)有限公司產(chǎn)品；HPR標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體，上海翊圣生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 儀器設(shè)備 PCR儀(K960)，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司產(chǎn)品；核酸電泳儀(DYCP-31DHDYY-6C)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；蛋白電泳儀(LF-2000)，北京龍方科技有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺(SJ-CJ-1FD)，蘇潔醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；超聲波破碎儀(JY92-IIN)，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀(AMR-100)，杭州奧盛儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 參照NCBI上公布的C.abortus的ompA(M73036.1)和CPAF(CR848038.1)基因序列，結(jié)合特異性酶切位點，應(yīng)用Primer 5.0軟件，設(shè)計ompA和CPAF基因的2對特異性擴增引物。ompA的特異性擴增引物為ompA-F：5′-CCGGAATTCATGTGGGAAGGTGCTTCAGGTGA-TC-3′ (下劃線為EcoRⅠ酶切位點)ompA-R：5′-CCGCTCGAGTGAATCTGAATTGAGCATTCA-TGTGA-3′ (下劃線為XhoⅠ酶切位點)，擴增出ompA基因的大小為1 053 bp；CPAF的特異性擴增引物為：CPAF-F：5′-CGCGGATCCATGGTCCCGTATTTCTGGAGCGAAT-3′ (下劃線為BamHⅠ酶切位點)；CPAF-R：5′-CCGCTCGAGTCGACTCAGTGATTTTGTCTGCACTT-3′ (下劃線為XhoⅠ酶切位點)，擴增出CPAF基因的大小為1 056 bp，引物由西安熱默爾生物公司合成。

1.2.2ompA基因和CPAF基因的擴增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用DNA提取試劑盒提取的C.abortus陽性病料DNA作為模板，應(yīng)用2對引物PCR擴增ompA和CPAF基因?；厥占兓康幕蚱魏蠓謩e連接至pET-28a原核表達質(zhì)粒中，對重組載體進行PCR和雙酶切鑒定，將陽性質(zhì)粒命名為pET-28a-ompA和pET-28a-CPAF。

1.2.3ompA基因和CPAF基因的序列分析 通過NCBI上的Blast功能和DNAStar軟件將山羊流產(chǎn)衣原體ompA基因與GenBank已收錄的其他C.abortus基因組DNA序列(AJ440239.1、AF272945.1、EF202609.1、DQ478954.1、DQ227703.1、X51859.1、AF269256.1、KC879303.1、KP984478.1、AJ005617.1、MH542160.1、HQ622433.1、M37040.1、KY399850.1、DQ435300.1、M37036.1)進行比對并進行核苷酸遺傳進化分析，繪制系統(tǒng)進化樹。將C.abortus的CPAF基因與GenBank已收錄的其他C.abortus基因組DNA序列(CR848038.1、CP041038.1、CP047319.1、CP041038.1、LN554882.1、CP18296.1、CP003795.1、CP031646.1、LN554883.1、CP021996.1、CP002744.1、CP033059.1、CP003791.1、CP024084.1)進行比對并進行核苷酸遺傳進化分析，繪制系統(tǒng)進化樹。

1.2.4ompA基因和CPAF基因的原核表達 將測序鑒定的重組質(zhì)粒pET-28a-ompA和pET-28a-CPAF以及空載體分別轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)表達感受態(tài)細(xì)胞中，分別涂布到帶有卡那霉素抗性的LB平板上于恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)后挑取單菌落，37℃、220 r/min培養(yǎng)12 h，次日按1∶100的比例轉(zhuǎn)接到500 mL LB液體培養(yǎng)基后，培養(yǎng)至對數(shù)期(約1 h～3.5 h)后加入1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)7 h，4 200 r/min離心10 min收集菌體沉淀，20 mL PBS洗滌1次后用24 mL PBS重懸，超聲裂解30 min。分別取菌液上清和超聲裂解過的菌體上清以及菌體沉淀進行SDS-PAGE，分析蛋白表達形式。

1.2.5 重組ompA蛋白和CPAF蛋白的Western blot分析 將表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后，在150 mA條件下恒流轉(zhuǎn)膜90 min。室溫封閉1 h后用山羊流產(chǎn)衣原體陽性血清(1∶200倍稀釋)作為一抗在4℃條件下進行過夜孵育，用HPR標(biāo)記的兔抗山羊IgG(1∶10 000倍稀釋)作為二抗孵育1 h，ECL避光顯色，顯影分析。

2 結(jié)果

2.1 ompA基因和CPAF基因擴增結(jié)果

用DNA 提取試劑盒提取的C.abortus陽性病料DNA作為模板，以ompA-F、ompA-R、CPAF-F、CPAF-R為引物進行常規(guī)PCR擴增，用10 g/L凝膠電泳檢測可見與預(yù)期擴增產(chǎn)物大小一致的1 053 bp的ompA基因和1 056 bp的CPAF基因擴增條帶(圖1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.ompA基因擴增產(chǎn)物；2.CPAF基因擴增產(chǎn)物M.DNA Marker DL 2 000;1.ompA gene amplification products;2.CPAF gene amplification products圖1 ompA基因和CPAF基因擴增Fig.1 Amplification of ompA gene and CPAF gene

2.2 重組表達質(zhì)粒pET-28a-ompA和pET-28a-CPAF的雙酶切鑒定結(jié)果

以EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切重組表達質(zhì)粒pET-28a-ompA，經(jīng)10 g/L凝膠電泳鑒定，出現(xiàn)一條大小為1 053 bp的目的條帶和一條約5 360 bp的載體條帶，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功；以BamHⅠ和XhoⅠ兩個限制性內(nèi)切酶雙酶切重組表達質(zhì)粒pET-28a-CPAF，經(jīng)10 g/L凝膠電泳鑒定，出現(xiàn)一條大小為1 056 bp的目的條帶和一條約5 360 bp的載體條帶(圖2)，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1：pET-28a-ompA經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切；2.pET-28a-CPAF經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切M.DNA Marker DL 5 000;1.pET-a-28 ompA digested with EcoRⅠand XhoⅠ;2.pET-a-28 CPAF digested with BamHⅠand XhoⅠ圖2 重組表達質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2 Double enzyme digestion identification of recombinant expression plasmids

2.3 ompA基因和CPAF基因生物信息學(xué)分析

將重組質(zhì)粒測序，通過NCBI Blast比較分析，ompA基因與GenBank已收錄的其他C.abortus基因組DNA序列(M73036.1、AJ440239.1、AF272945.1、EF202609.1、DQ478954.1、DQ227703.1、X51859.1、AF269256.1、KC879303.1、KP984478.1、AJ005617.1、MH542160.1、HQ622433.1、M37040.1、KY399850.1、DQ435300.1)進行比對，同源性為99.54%～99.91%。CPAF基因與GenBank已收錄的其他C.abortus基因組DNA序列(CP041038.1、CP047319.1、CP041038.1、LN554882.1、CP18296.1、CP003795.1、CP031646.1、LN554883.1、CP021996.1、CP002744.1、CP033059.1、CP003791.1、CP024084.1)同源性為91%～100%。在分析ompA基因和CPAF基因同源性的基礎(chǔ)上，繪制ompA基因(圖3)和CPAF基因(圖4)核苷酸系統(tǒng)進化樹進行分析，C.abortus的ompA基因與NCBI已公布的荷蘭分離株DQ435300.1在同一個分支上，表明親緣關(guān)系最近。CPAF基因與NCBI已公布英國分離株CR848038.1在同一個分支上，表明親緣關(guān)系最近。

圖3 ompA基因核苷酸序列進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of nucleotide sequences of ompA gene

圖4 CPAF基因核苷酸序列進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of nucleotide sequences of CPAF gene

2.4 重組ompA蛋白和CPAF蛋白的原核表達

在1 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)表達ompA蛋白和CPAF蛋白7 h后分別取菌液上清，超聲裂解菌體上清和菌體沉淀進行SDS-PAGE。結(jié)果顯示，重組蛋白ompA的菌體裂解沉淀在38 ku處有明顯條帶，重組蛋白CPAF的菌體裂解沉淀在在38 ku(圖5)處有明顯條帶，蛋白大小與預(yù)期結(jié)果一致，ompA蛋白和CPAF蛋白均存在于超聲裂解菌體沉淀中，表明主要是以包涵體形式存在于感受態(tài)細(xì)胞中。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.ompA菌液上清；2.ompA菌液裂解上清；3.ompA菌液裂解沉淀；4.CPAF菌液上清；5.CPAF菌液裂解上清；6.CPAF菌液裂解沉淀M.Protein molecular weight Marker;1.ompA bacterial liquid supernatant;2.ompA bacterial liquid cracking supernatant;3.ompA bacteria liquid cracking precipitate;4.CPAF bacterial liquid supernatant;5.CPAF bacterial liquid cracking supernatant;6.CPAF bacterial fluid cracking precipitate圖5 重組蛋白ompA和CPAF表達形式分析圖Fig.5 Expression analysis diagram of recombinant protein ompA and CPAF

2.5 重組ompA蛋白和CPAF蛋白的Western blot鑒定

Western blot結(jié)果顯示，ompA蛋白能與山羊流產(chǎn)衣原體陽性血清特異性反應(yīng)在并在38 ku處出現(xiàn)條帶；CPAF蛋白能和山羊流產(chǎn)衣原體陽性血清特異性反應(yīng)并在38 ku處出現(xiàn)條帶(圖6)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～2.ompA重組蛋白；3～4.CPAF重組蛋白M.Protein molecular weight Marker;1-2.ompA recombinant protein;3-4.CPAF recombinant protein圖6 ompA和CPAF重組蛋白的Western blot鑒定結(jié)果Fig.6 Western blot identification of ompA and CPAF recombinant proteins

3 討論

C.abortus作為一種嚴(yán)重的人獸共患病病原，在全世界流行，不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，嚴(yán)重阻礙養(yǎng)羊業(yè)和養(yǎng)牛業(yè)的進一步發(fā)展，而且對相關(guān)從業(yè)人員的健康問題也造成了威脅[10-11]。通過流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國部分地區(qū)的衣原體陽性率高達56%[12-14]，而在臨床中單靠癥狀又很難診斷出流產(chǎn)衣原體，所以經(jīng)常出現(xiàn)誤診而錯過最佳治療時機[15]。因此，建立一種成本較低、操作簡便以及特異性高的臨床檢測方法對流產(chǎn)衣原體的診斷尤為重要。ompA基因具有血清型、亞種、種和屬特異性抗原決定簇，而CPAF基因作為衣原體和宿主之間相互作用的一個重要分子具有很強的抗原性，兩個基因在不同菌株之間高度保守，所以ompA基因和CPAF基因有望成為研制C.abortus亞單位疫苗和ELISA檢測試劑盒的首選基因。

本試驗對來自臨床病料分離的C.abortus進行了研究，成功克隆了ompA基因(1 053 bp)和CPAF基因(1 056 bp)，與NCBI上已經(jīng)收錄的國內(nèi)外流產(chǎn)衣原體核酸序列對比發(fā)現(xiàn)，在陜西奶山羊場分離的C.abortusompA基因與國內(nèi)外其他分離株的同源性在99.54%～99.91%。C.abortus的CPAF基因與國內(nèi)外其他分離株的同源性在91%～100%，說明這兩種基因發(fā)生突變的概率低，具備功能性研究價值，通過繪制的遺傳進化樹結(jié)果分析，陜西分離的C.abortusompA基因與NCBI已公布的荷蘭分離株DQ435300.1在同一個小分支上，而與荷蘭、美國、伊拉克、希臘等地區(qū)分離株位于同一個大分支上呈交叉分布狀態(tài)。陜西羊場感染的C.abortusCPAF基因與NCBI已公布英國分離株CR848038.1在同一個小分支上，與瑞典、美國等國家分離株位于一個大分支上呈交叉分布狀態(tài)。說明陜西羊場C.abortus分離株ompA基因和CPAF基因在進化過程中沒有明顯的進化差異，分離株的兩種基因保守程度都比較高。因此,深入研究C.abortus的ompA基因和CPAF基因的分子生物學(xué)功能對研制亞單位疫苗和快速檢測方法的建立以及研究C.abortus的感染和發(fā)病機制有重要意義。

本試驗成功誘導(dǎo)表達了C.abortus的ompA(38 ku)蛋白和CPAF(38 ku)蛋白，利用 Western blot進行檢測，兩種靶蛋白都能與山羊流產(chǎn)衣原體陽性血清特異性識別并結(jié)合，說明兩種蛋白均有良好的反應(yīng)原性，提示這兩個基因都可以作為動物流產(chǎn)衣原體病的血清學(xué)檢測抗原。本試驗為進一步建立山羊流產(chǎn)衣原體的血清學(xué)快速檢測方法和基因工程疫苗研制奠定了基礎(chǔ)。