響應(yīng)面法優(yōu)化抗氧化劑復(fù)配組合

石艷賓，梁山，李文靜，黃登禹*

1.天津天獅學(xué)院（天津 301700）；2.天津嘉匯捷瑞醫(yī)藥科技有限公司（天津 301800）

為增強(qiáng)抗氧化效果，在抗氧化劑中添加一種或幾種其他抗氧化劑，使復(fù)配抗氧化劑各組分間特性互補(bǔ)、協(xié)調(diào)增效，從而大大提高抗氧化能力[1-3]。沒(méi)食子酸丙酯（propyl gallate，PG）亦稱棓酸丙酯，屬于酚類化合物，具有顯著的藥理活性和生物活性，是一種常見(jiàn)的脂溶性抗氧化劑[4-5]，主要用于抗氧化和抗微生物等方面。茶多酚（tea polyphenol，TP）是茶葉中多羥基酚類化合物的總稱[6]，是一種具有高抗氧化性和強(qiáng)抑菌性的天然提取物，易溶于水和有機(jī)溶劑，其抗氧化能力是維生素C的100倍，是維生素E的20倍，安全無(wú)毒、耐熱性好，被廣泛應(yīng)用于植物蛋白飲料、蛋白固體飲料等制品中[7]。D-異抗壞血酸鈉（D-sodium erythorbate）又名赤藻糖酸鈉，是一種安全性高、性能優(yōu)良的新型生物型抗氧化劑和護(hù)色劑，其防腐抗氧的效果優(yōu)于VC，易溶于水，被廣泛用于濃縮果蔬汁、飲料、葡萄酒、果醬等食品中[8]。Romano等[9]研究指出，迷迭香酸提取物和BHT等量混合后具有協(xié)同抗氧化作用以及抗菌活性的增效性。唐煜括等[10]研究發(fā)現(xiàn)漢中仙毫茶多酚與維生素C以特定比例混合后，自由基清除活性和抑菌性均有顯著提高。王鵬等[11]研究黑木耳中多糖和類黃酮的協(xié)同抗氧化作用，自由基清除能力隨著復(fù)配液質(zhì)量濃度增大而增強(qiáng)。Hait-Darshan等[12]從菠菜葉中分離提取了一種天然抗氧化物質(zhì)（NAO），結(jié)果發(fā)現(xiàn)咖啡酸和兒茶素與NAO復(fù)配具有更好的抗氧化協(xié)同效果。Jaswir等[13]將響應(yīng)曲面法應(yīng)用于抗氧化協(xié)同作用分析，為復(fù)配抗氧化劑的配比篩選提供了依據(jù)。Zhang等[14]從扁豆中提取出類胡蘿卜素和生育酚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者之間具有協(xié)同抗氧化作用。隨著食品種類的不斷豐富，單一抗氧化劑不能滿足食品行業(yè)的發(fā)展要求，因此復(fù)配抗氧化劑是已逐漸成為時(shí)代抗氧化劑發(fā)展的必然趨勢(shì)。依據(jù)GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，篩選出用于糖果包衣中的抗氧化劑沒(méi)食子酸丙酯、茶多酚，并輔以一定量兼具抗氧化與護(hù)色作用的D-異抗壞血酸鈉，利用響應(yīng)面法優(yōu)化出復(fù)配抗氧化劑組合，為復(fù)配食品抗氧化劑在食品抗氧化防護(hù)應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-抗壞血酸（純度≥99）、沒(méi)食子酸丙酯（純度≥98%）、茶多酚（純度≥97）、D-異抗壞血酸鈉（純度≥98%），上海麥克林生化科技有限公司；DPPH（純度≥99.99%），梯希愛(ài)上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司；無(wú)水乙醇（分析純），天津市匯杭化工科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器有限公司；AL204分析天平，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；SB-3200DTDN超聲波清洗機(jī)，廣州譜立奇儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

將VC、茶多酚、PG、D-異抗壞血酸鈉配制成5，10，20，30，40，50，60，70，80，90和100 μg/mL系列樣品溶液，以VC為對(duì)照，采用DDPH法測(cè)定抗氧劑樣品自由基清除率，分析3種抗氧化劑的抗氧化性能。分別移取0.5 mL待測(cè)樣品溶液、70%乙醇溶液，加入5 mL濃度為0.06 mmol/L DPPH溶液，混合混勻后靜置反應(yīng)30 min，在吸收波長(zhǎng)515 nm處測(cè)定系列樣品溶液反應(yīng)后Ar、空白對(duì)照Ac；移取0.5 mL待測(cè)樣品溶液和5 mL 70%乙醇溶液，混合混勻后靜置反應(yīng)，測(cè)定樣品底液Ax[15-16]。根據(jù)式（1）計(jì)算VC、PG、茶多酚、D-異抗壞血酸鈉樣品的DPPH自由基清除率SR值，制作抗氧化劑濃度與自由基清除率SR值曲線圖，計(jì)算半數(shù)清除率IC50值。

1.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)茶多酚、沒(méi)食子酸丙酯、D-異抗壞血酸鈉DPPH自由基半數(shù)清除率IC50值及食品添加劑使用控制要求[17-18]，3種抗氧化劑的優(yōu)水平分別為10，15和35 μg/mL。采用Design Expert 10軟件，設(shè)計(jì)Box-Behnken因素水平編碼表1，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，分析3種抗氧化劑對(duì)DPPH自由基清除率SR值的影響。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼表單位：μg/mL

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 茶多酚、PG、D-異抗壞血酸鈉DPPH自由基清除能力分析

依據(jù)試驗(yàn)方法1.3.1小節(jié)，測(cè)定TP、PG、D-異抗壞血酸鈉系列濃度樣品溶液SR值，繪制抗氧化劑質(zhì)量濃度與自由基清除率SR間的曲線圖，得到抗氧化劑回歸方程與R2，計(jì)算TP、PG、D-異抗壞血酸鈉半數(shù)清除率IC50值，詳見(jiàn)圖1和表2。由圖1和表2可知，抗氧化劑TP、PG、D-異抗壞血酸鈉對(duì)DPPH自由基均有較強(qiáng)的清除作用，清除率SR值隨著樣品濃度的增大而增強(qiáng)，但達(dá)到60 μg/mL，DPPH自由基清除率能力增長(zhǎng)緩慢。將TP、PG、D-異抗壞血酸鈉清除能力與對(duì)照VC進(jìn)行比較分析可知，抗氧化劑在60 μg/mL以下質(zhì)量濃度下茶多酚TP、PG對(duì)DPPH自由基的清除作用強(qiáng)于VC，D-異抗壞血酸鈉弱清除能力弱于VC。

表2 TP、PG、D-異抗壞血酸鈉和VC回歸方程與半數(shù)清除率

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在分析TP、PG、D-異抗壞血酸鈉清除自由基能力作用的基礎(chǔ)上，依據(jù)因素水平編碼表1進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分析TP、PG、D-異抗壞血酸鈉對(duì)DPPH自由基清除率的影響，Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析

應(yīng)用Design Exper 10對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果表3中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，方差分析結(jié)果詳見(jiàn)表4。沒(méi)食子酸丙酯（A）、茶多酚（B）、D-異抗壞血酸鈉（C）的p值均小于0.01，表明這3個(gè)因素對(duì)DPPH自由基清除率的影響非常顯著。A、B、C三個(gè)因素間存在一定的交互作用，但只有A與C間交互作用對(duì)DPPH自由基清除率的影響顯著，A與B、B與C間交互作用較小。

表4 回歸模型方差與分析

2.2.3 回歸模型的建立及抗氧化性分析

對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，建立全變量二次回歸模型：

由表4可知：模型p＜0.01，表明回歸模型非常顯著；失擬項(xiàng)p=0.508 8＞0.05，即失擬項(xiàng)不顯著，表明該模型是適合沒(méi)食子酸丙酯、茶多酚、D-異抗壞血酸鈉協(xié)同抗氧化分析的數(shù)學(xué)模型。試驗(yàn)的校正R2值為0.950 9，表明回歸方程的擬合度較好?；貧w方程系數(shù)的顯著性結(jié)果表明：A、B、C對(duì)DPPH自由基清除率的影響非常顯著，對(duì)DPPH自由基清除率影響依次B、A、C；AC、C2對(duì)DPPH自由基清除率的影響顯著。因素A、B一次項(xiàng)系數(shù)為正值，表明A、B對(duì)DPPH自由基清除率有正相關(guān)性，因素C一次項(xiàng)系數(shù)為負(fù)值，表明C對(duì)DPPH自由基清除率有負(fù)相關(guān)性；A與B交互項(xiàng)系數(shù)為正值，表明兩因素間對(duì)DPPH自由基清除率存在正協(xié)同作用；A與C、B與C的交互作用系數(shù)為負(fù)值，表明兩因素間對(duì)DPPH自由基清除率存在負(fù)協(xié)同作用。

2.2.4 響應(yīng)面交互作用分析

應(yīng)用Design Expert 10對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并繪制出響應(yīng)曲面圖2~圖4。隨著抗氧化劑質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基清除率SR值也隨著增大。同時(shí)，響應(yīng)曲面坡度比較陡峭，說(shuō)明抗氧化物質(zhì)對(duì)DPPH自由基清除率的影響顯著，茶多酚的清除效果明顯強(qiáng)于沒(méi)食子酸丙酯。從3個(gè)響應(yīng)曲面圖也可以看出，雖然沒(méi)食子酸丙酯、茶多酚、D-異抗壞血酸鈉間存在一定的交互作用，但因素沒(méi)食子酸丙酯與D-異抗壞血酸鈉間存在負(fù)協(xié)同作用，導(dǎo)致響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)部分復(fù)配組合隨著兩種抗氧化劑質(zhì)量濃度增大出現(xiàn)自由基清除率降低現(xiàn)象。

圖2 A和C對(duì)DPPH自由基清除率的影響

圖3 A和B對(duì)DPPH自由基清除率的影響

圖4 B和C對(duì)DPPH自由基清除率的影響

2.2.5 優(yōu)化配方驗(yàn)證試驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)確定優(yōu)化復(fù)配組合：沒(méi)食子酸丙酯14.90 μg/mL、茶多酚15.00 μg/mL、D-異抗壞血酸鈉40.00 μg/mL。為了便于實(shí)施試驗(yàn)，將配方參數(shù)修正為沒(méi)食子酸丙酯15 μg/mL、茶多酚15 μg/mL、D-異抗壞血酸鈉40 μg/mL，重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行3次驗(yàn)證，取平均值，結(jié)果為58.647%，表現(xiàn)出較好的抗氧化效果，證明該復(fù)配組合為較優(yōu)方案。

3 結(jié)論

沒(méi)食子酸丙酯、茶多酚為典型的酚型抗氧化劑，D-異抗壞血酸鈉兼具抗氧化與護(hù)色作用。經(jīng)比較，沒(méi)食子酸丙酯、茶多酚抗氧化性強(qiáng)于對(duì)照品VC，D-異抗壞血酸鈉弱于VC。利用響應(yīng)面法分析可知，沒(méi)食子酸丙酯、茶多酚、D-異抗壞血酸鈉對(duì)DPPH自由基清除作用顯著，沒(méi)食子酸丙酯與D-異抗壞血酸鈉間交互作用顯著，且為負(fù)協(xié)同作用。最佳配方為沒(méi)食子酸丙酯15 μg/mL、茶多酚15 μg/mL、D-異抗壞血酸鈉40 μg/mL，DPPH自由基清除率為58.647%，抗氧化效果較好。復(fù)配抗氧化劑是我國(guó)食品添加劑的發(fā)展方向，在今后還需要根據(jù)食品添加劑使用要求進(jìn)行大量試驗(yàn)，尋求具有典型抗氧化性并能夠?qū)Ξa(chǎn)品進(jìn)行護(hù)色作用的復(fù)合抗氧化劑。