定量核磁共振波譜測(cè)定黑果枸杞中多糖

張祝莉 郭曄紅 姜侃 馬錦緣 車曉榕

摘要 目的：建立采用1H核磁共振波譜法定量測(cè)定黑果枸杞中多糖的含量。方法：采用核磁共振波譜法，利用Bruker Advance Ⅲ 600核磁共振波譜儀，以重水為溶劑，采用弛豫時(shí)間（D1）為1 s，脈沖寬度（P1）14.90 s，樣品掃描次數(shù)（NS）32次的條件下采集核磁共振氫譜，以化學(xué)位移δ為6.40的順丁烯二酸的氫質(zhì)子作為內(nèi)標(biāo)峰，以葡萄糖化學(xué)位移δ為5.22～5.23處雙峰信號(hào)和δ 4.62～4.64的雙峰共同作為定量峰。計(jì)算葡萄糖含量。結(jié)果：以此方法測(cè)定黑果枸杞中多糖的含量在7月份含量最高為0.22 mg/g。結(jié)論：栽培黑果枸杞中溫差的提高有利于多糖成分的積累。

關(guān)鍵詞 黑果枸杞;多糖;核磁共振波譜;定量

Quantitative MRI Spectrum Determination of Polysaccharies in Lycium ruthenicum Murr.

ZHANG Zhuli，GUO Yehong，JIANG Kan，MA Jinyuan，CHE Xiaorong

（College of Agronomy，Gansu Agricultural University，Institute of Traditional Chinese Medicine，Gansu Provincial Key Laboratory of Aridland and Crop Science，Lanzhou 730070，China）

Abstract Objective：To determine the content of Polysaccharide in Lycium ruthenicum Murr.using 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy quantitively.Methods：MRI spectrometry and Bruker Advanced Ⅲ.600 MRI spectrometer were used，with deuterium oxide used as solvent.With relaxation time（D1）as 1 s，pulse width（P1）as 14.90 s，number of scans（NS）as 32，the nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum was collected.With the hydrogen proton of shunbutene acid with a chemical shift（δ）of 6.40 as the internal standard peak，and the twin peaks at glucose chemical shift（δ）at 5.22～5.23 and 4.62～4.64 as quantitative peaks，glucose content was calculated.Results：The content of polysaccharide in Lycium ruthenicum Murr.was accurate and reliable by this method.Conclusion：The analysis shows that this method can be used for quantitative analysis of polysaccharie in Lycium ruthenicum Murr.，which has the advantages of rapidness，accuracy and convenience.

Keywords Lycium ruthenicum Murr; Polysaccharide; Nuclear magnetic resonance spectroscopy; Quantitative

中圖分類號(hào)：R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.03.010

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）系茄科（Solanceae）枸杞屬（Lycium L.）其果實(shí)味甜多汁，富含紫紅色素，是中國(guó)西北地區(qū)一種特有的、亟待開(kāi)發(fā)的野生植物，分布于寧夏、甘肅、青海、新疆等地[1-2]。黑果枸杞具有良好的醫(yī)療保健功能，藏醫(yī)用于心臟病、月經(jīng)不調(diào)、停經(jīng)等病癥[3]。黑果枸杞中特有的多糖成分經(jīng)藥理學(xué)研究證明具有降血糖和抗疲勞的活性[4-6]。

目前，關(guān)于黑果枸杞多糖的研究比較粗淺，測(cè)定方法均采用苯酚—硫酸法、蒽酮—硫酸比色法測(cè)定黑果枸杞中多糖含量，但此操作方法在加入硫酸時(shí)，結(jié)果易受硫酸加入速度影響[6]。黑果枸杞隨著采收期的不同其含量也存在差異，探究甘肅武威的黑果枸杞不同采收期多糖的含量差異，可為黑果枸杞質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。不同產(chǎn)地的黑果枸杞中其多糖含量存在差異，通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地的黑果枸杞多糖含量差異，可挑選出優(yōu)質(zhì)產(chǎn)地資源，為黑果枸杞栽培奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

核磁共振波譜儀（布魯克公司，德國(guó)，型號(hào)：Bruker Advance Ⅲ 600）;萬(wàn)分之一天平（梅特勒-托利多公司，瑞士，型號(hào)：AL104型）;超純水器-優(yōu)普系列（西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)：UPT-I-5/10/20T）;恒溫水浴鍋（泰斯特公司，型號(hào)：DK-98）。

1.2 試劑

D2O（安耐吉化學(xué)有限公司，批號(hào)：MFCD00044636）;無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（北京索萊寶有限公司，批號(hào)：1122A0214，純度≥98%）;順丁烯二酸（麥克林試劑公司，批號(hào)：MFCD00005518）;石油醚（30～60 ℃分析純，天津大茂試劑公司，批號(hào)：20171632）。

1.3 分析樣品

分別于2019年6月28日、7月28日、8月28日采摘甘肅武威（平均日最高溫度6月28.86 ℃，7月29.41 ℃，8月25.20 ℃;平均日最低溫度6月15.8 ℃，7月16.80 ℃，8月12.20 ℃）;甘肅張掖;甘肅民勤;新疆和田;青海海西州的鮮果，采后的鮮果經(jīng)55 ℃烘干后粉碎過(guò)40目篩備用（經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)郭曄紅副教授鑒定為茄科黑果枸杞Lycium ruthenicum Murr.果實(shí)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 核磁共振定量條件

采用zg 30脈沖序列，譜寬（SWH）為11 904.8 Hz，弛豫時(shí)間（D1）為1 s，脈沖寬度（P1）14.90 s，樣品掃描次數(shù)（NS）32次。測(cè)定樣品的NMR譜圖。積峰時(shí)先選擇重水殘留的水峰進(jìn)行矯正，校正譜圖后選定峰積分區(qū)間，每個(gè)峰積分5次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）<1%時(shí)取平均值，用《中華人民共和國(guó)藥典2015版》中的絕對(duì)定量公式計(jì)算待測(cè)組分的重量。所有數(shù)據(jù)均使用MestReNova軟件處理核磁共振波譜、采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。Ws=Wr×（As/Ar）×（Es/Er）。其中Wr為內(nèi)標(biāo)物的重量，As和Ar分別為供試品特征峰和內(nèi)標(biāo)峰的峰面積，Es和Er分別為供試品和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)子當(dāng)量重量（質(zhì)量）（以分子量除以特征峰的質(zhì)子數(shù)計(jì)算得到），然后根據(jù)稱樣量計(jì)算組分在樣品中的含量。

2.2 氘代溶劑的選擇及葡萄糖1H-NMR譜圖的歸屬

合適的氘代溶劑對(duì)樣品溶解性能好，且譜峰不與待測(cè)峰發(fā)生重疊。氘代甲醇易揮發(fā)，樣品在氘代甲醇中溶解度差。樣品及馬來(lái)酸在重水中均有較好的溶解度，且譜峰不與樣品峰重疊，因而選用重水作為溶劑。重水空白實(shí)驗(yàn)的1H-qNMR譜圖，溶劑峰歸屬為：δ 4.79（s，H2O）。δ 5.220歸屬為α-D-吡喃葡萄糖的端基質(zhì)子1-H，受2-H的耦合而裂分為雙峰，耦合常數(shù)3JH-H=3.7 Hz。δ：4.630歸屬為β-D-吡喃葡萄糖的端基質(zhì)子1-H，受2-H的耦合而裂分為雙峰，耦合常數(shù)3JH-H=8.0 Hz[8]。無(wú)水葡萄糖結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

2.3 內(nèi)標(biāo)和定量峰的選擇

本實(shí)驗(yàn)選用重水作為溶劑，順丁烯二酸作為內(nèi)標(biāo)，順丁烯二酸具有易于識(shí)別的尖銳單峰，且不與樣品的定量峰發(fā)生重疊。順丁烯二酸與黑果枸杞樣品1H-qNMR譜見(jiàn)圖2。由圖譜可知，順丁烯二酸溶劑峰歸屬為δ 6.40（s，D2O），不干擾葡萄糖的譜峰，專屬性較高。因此，選擇順丁烯二酸作為內(nèi)標(biāo)。由于葡萄糖δ 5.22-5.23（d，D2O）處是一獨(dú)立雙峰，完全與其他信號(hào)分離，且與內(nèi)標(biāo)物的定量峰化學(xué)環(huán)境相近。因此，選擇葡萄糖δ 5.22-5.23處雙峰信號(hào)作為定量峰和δ 4.62-4.64的雙峰共同作為定量峰。

2.4 對(duì)照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取50.00 mg無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶解至5 mL容量瓶?jī)?nèi)，重水定容至刻度，制得11.00 mg/mL無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液。

2.5 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取黑果枸杞粉末12.000 0 g，加入180 mL石油醚，置于索氏提取器中，索氏提取2.5 h，至提取溶液無(wú)色，取出，揮干溶劑備用，得揮去石油醚得到黑果枸杞脫脂粉末。準(zhǔn)確稱取脫脂后粉末1.000 0 g，加入25 mL超純水至于50 mL三角瓶?jī)?nèi)，置于90 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)提取1.5 h，提取2次，合并濾液，于90 ℃水浴上揮干、得粗浸膏并稱重。

取黑果枸杞多糖浸膏20 mg，精密稱定，加內(nèi)標(biāo)溶液順丁烯二酸50 μL（順丁烯二酸122 mg，溶于1.22 mL重水），再加入550 μL重水，全部溶解后，用移液槍全部移至核磁管內(nèi)，用于氫譜核磁共振波普測(cè)定。

2.6 內(nèi)標(biāo)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取12.2 mg內(nèi)標(biāo)物順丁烯二酸溶解至1.22 mL重水中，制得10.00 mg/mL內(nèi)標(biāo)溶液，以作為用于1H-qNMR樣品定量的內(nèi)標(biāo)樣品;準(zhǔn)確稱取20 mg內(nèi)標(biāo)物順丁烯二酸溶解至2 mL重水中，制得10.00 mg/mL內(nèi)標(biāo)溶液，以作為用于線性關(guān)系考察時(shí)1H-qNMR定量的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。

2.7 線性關(guān)系考察

精密稱取無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg加入2 mL重水溶解成為標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，混勻后分別吸取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液50、100、200、300、400、500 μL，加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液儲(chǔ)備液后加入重水補(bǔ)足600 μL?；靹?，配制后全部移制核磁管中，按“2.1”進(jìn)行測(cè)定。以（樣品/內(nèi)標(biāo)）質(zhì)量比為橫坐標(biāo)（X），1H-qMNR定量峰面積比為縱坐標(biāo)（Y），用純品對(duì)照品評(píng)價(jià)的零截距標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.147X-0.087 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，同時(shí)核磁管中所含葡萄糖的濃度作為橫坐標(biāo)（X），1H-qMNR定量峰面積比為縱坐標(biāo)（Y），制做濃度與面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.883X-0.088 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.999。

2.8 儀器精密度試驗(yàn)

稱取新疆樣品制備的浸膏和內(nèi)標(biāo)，用供試品溶液制備方法制備，測(cè)試6次，結(jié)果葡萄糖峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積RSD為0.12%，表明儀器精密度良好。

2.9 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

黑果枸杞新疆樣品的供試品的核磁管，分別在1、2、4、6、8、10、24 h在“2.1”核磁條件下測(cè)定樣品穩(wěn)定性，穩(wěn)定性RSD為2.5%（n=7），說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)樣品在室溫24 h下具有良好的穩(wěn)定性。

2.10 重復(fù)性試驗(yàn)

取黑果枸杞新疆樣品，按照“2.5”制備平行制備供試品5溶液，分別置于按照“2.1”核磁條件下測(cè)試樣品重復(fù)性，獲取1H-NMR譜并積分計(jì)算定量峰與內(nèi)標(biāo)峰的峰面積比值重復(fù)性RSD為1.5%。

2.11 回收率試驗(yàn)

取新疆樣品提取后浸膏10.0 mg，在“2.1”核磁共振波譜測(cè)定條件測(cè)定樣品1H-qNMR法測(cè)定其中所含葡萄糖的含量;加入適量的D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品共同溶解后，按照“2.1”測(cè)定含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果葡萄糖回收率為98.6%～100.3%，RSD=0.9%（n=5）。

2.12 樣品含量的測(cè)定

取黑果枸杞不同采收時(shí)期樣品，按照“2.5”方法制備供試品溶液，按照“2.1”核磁條件進(jìn)行測(cè)試，分析樣品圖譜積峰面積，計(jì)算樣品含量。見(jiàn)表1。多糖含量逐漸增加。通過(guò)不同采收期的多糖含量與環(huán)境溫度的相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表2得出黑果枸杞中多糖含量與平均日溫差有極顯著性相關(guān)性，適當(dāng)提高溫差可提高黑果枸杞中多糖含量，在人工栽培中可適當(dāng)增加溫差來(lái)增加黑果枸杞中多糖的含量。

取不同產(chǎn)地的黑果枸杞樣品，按“2.5”項(xiàng)提取方法提取黑果枸杞中多糖的含量，按“2.1”方法測(cè)定不同產(chǎn)地的黑果枸杞中多糖的含量。結(jié)果測(cè)得青海海西州黑果枸杞中多糖含量為0.29 mg/g，新疆和田為0.27 mg/g，甘肅武威為0.23 mg/g，甘肅張掖為0.22 mg/g，甘肅民勤為0.17 mg/g。

3 討論

3.1 核磁條件的確定

弛豫時(shí)間（D1）和掃描次數(shù)（NS）的選擇：弛豫時(shí)間（D1）和掃描次數(shù)（NS）是qNMR測(cè)試中非常重要的參數(shù)。本研究考察了標(biāo)準(zhǔn)品D1分別在1、2、3、5、6、8、10、15、20、25、30、40、50、60 s時(shí)NS分別在16、32、64、128時(shí)，對(duì)D-δ無(wú)水葡萄糖含量的影響。結(jié)果表明，當(dāng)D1=1 s時(shí)、NS≥32時(shí)比值趨于穩(wěn)定（AS是樣品所含葡萄糖定量峰的積分面積，Ar是內(nèi)標(biāo)物質(zhì)順丁烯二酸定量峰的積分面積），因此選擇1 s作為弛豫時(shí)間，選擇32作為掃描次數(shù)。

3.2 氘代溶劑的選擇

黑果枸杞浸膏能夠同時(shí)溶解于氘代甲醇和重水中，不溶于氘代二甲基亞砜[9]，經(jīng)試驗(yàn)表明黑果枸杞樣品在氘代甲醇中殘留水峰δ 4.87與多糖的定量峰δ 5.07～5.82（d，CD3OD）分離度較差。樣品在重水中溶解度較好且樣品定量峰不與殘留的重水質(zhì)子信號(hào)δ 4.79分離度較好，故此選用重水作為氘代溶劑[10-13]，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)經(jīng)過(guò)試驗(yàn)鄰苯二氫鉀、吡嗪、對(duì)苯二酚、順丁烯二酸等內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，結(jié)果表明順丁烯二酸和樣品在重水中分離情況良好，不與樣品峰重合。內(nèi)標(biāo)溶液濃度的由同一樣品的比較不同梯度25、50、100、150 μL內(nèi)標(biāo)液進(jìn)行比較，結(jié)果表明內(nèi)標(biāo)液50 μL可與樣品定量峰既不太高，又不低于定量峰[14-16]。

3.3 結(jié)論

定量核磁測(cè)定黑果枸杞中多糖的含量，可以快速準(zhǔn)確的對(duì)黑果枸杞中多糖進(jìn)行定量分析，核磁共振波譜定量測(cè)定黑果枸杞多糖的方法具有時(shí)間短，線性關(guān)系良好，穩(wěn)定性和重復(fù)性較好的優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果表明核磁共振波譜法測(cè)定多糖對(duì)照品的含量準(zhǔn)確，該方法具有快速、簡(jiǎn)便、不破壞樣品的特點(diǎn)。通過(guò)定量核磁共振波譜技術(shù)對(duì)黑果枸杞中多糖的分析表明，在不同采收期時(shí)8月份黑果枸杞中多糖含量最高達(dá)0.31 mg/g，青海海西州黑果枸杞多糖含量最高達(dá)0.29 mg/g。

甘肅武威的黑果枸杞在8月份采收時(shí)做含量最高為0.31 mg/g，不同產(chǎn)地為青海海西州的黑果枸杞多糖含量最高。以枸杞子2015版藥典標(biāo)準(zhǔn)為參考，表明青海海西州黑果枸杞質(zhì)量最佳。黑果枸杞總多糖的測(cè)定是必不可少的一部分，通過(guò)定量核磁測(cè)定黑果枸杞中多糖的含量，可以快速準(zhǔn)確的對(duì)黑果枸杞中多糖進(jìn)行定量分析。核磁共振波譜定量測(cè)定黑果枸杞多糖的方法具有時(shí)間短[13-19]，試驗(yàn)結(jié)果表明核磁共振波譜法測(cè)定多糖對(duì)照品的含量，線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，具有快速、簡(jiǎn)便、不破壞樣品的特點(diǎn)，該方法可有效避免苯酚-硫酸法測(cè)定多糖時(shí)因硫酸加入的速度對(duì)其含量測(cè)定的影響。

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（2020-04-14收稿 本文編輯：楊覺(jué)雄）