小型魚(yú)類透明標(biāo)本制作技術(shù)

文章編號(hào)：16742419（2022）01005803

摘要：文章以孔鰩（Raja porosa，俗稱“老板魚(yú)”）為代表的軟骨魚(yú)和錦鯉為代表的硬骨魚(yú)作為主要實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在進(jìn)行去鱗、去內(nèi)臟后，通過(guò)氫氧化鉀腐蝕透明肌肉并用阿利新藍(lán)和茜素紅染色劑對(duì)魚(yú)體內(nèi)的軟骨及硬骨部分進(jìn)行著色，再通過(guò)脫色液及甘油將外部肌肉脫色并透明化。透明后的魚(yú)類骨骼（含鈣部分）均被茜素紅染成玫瑰紅色，軟骨被阿利新藍(lán)染成藍(lán)色，兩者輪廓清晰，顏色均勻，且其他組織均呈無(wú)色透明狀，得到一個(gè)外觀完整，骨骼結(jié)構(gòu)清晰、層次鮮明的透明魚(yú)類標(biāo)本。

關(guān)鍵詞：透明標(biāo)本;骨骼;染色;硬骨;軟骨

中圖分類號(hào)：J529文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

動(dòng)物標(biāo)本的制作方法有很多種，如骨骼標(biāo)本、風(fēng)干標(biāo)本、剝制標(biāo)本、浸制標(biāo)本和透明標(biāo)本等[1]。隨著醫(yī)學(xué)影像技術(shù)的發(fā)展，對(duì)骨學(xué)及骨發(fā)育的形態(tài)學(xué)提出了越來(lái)越高的要求，以往的解剖學(xué)或胚胎學(xué)骨發(fā)育的教學(xué)，只限于理論上的講解及線條觀察，缺乏實(shí)際的骨標(biāo)本直觀素材，而且風(fēng)干標(biāo)本及浸制標(biāo)本在制作過(guò)程中由于實(shí)驗(yàn)者直接或間接接觸福爾馬林溶液危害身體健康。透明標(biāo)本技術(shù)不同于其他標(biāo)本制作技術(shù)，它是一種將動(dòng)物體肌肉透視化的骨骼展示，呈現(xiàn)出一具骨骼結(jié)構(gòu)清晰、直觀的形態(tài)學(xué)素材，避免了傳統(tǒng)標(biāo)本只可以看到外部形態(tài)的束縛，它的創(chuàng)新點(diǎn)在于保持動(dòng)物基本形態(tài)及肌肉不破壞的情況下進(jìn)行深層次的顯露骨骼系統(tǒng)，特別是能體現(xiàn)骨骼結(jié)構(gòu)和位置，真正意義上脫離了傳統(tǒng)外觀單一的保存方式，無(wú)毒無(wú)刺激性氣味兒，可以近距離觀察，是標(biāo)本保存與展示上的一種革新，為骨骼發(fā)育的教學(xué)和科研提供了有效的形態(tài)學(xué)觀察方法[2]。1897年Schulze用2%～3%的氫氧化鉀茜素紅及甘油成功制作了胚胎骨骼的染色標(biāo)本得到了廣泛的推廣與應(yīng)用[3]。透明標(biāo)本在動(dòng)物教學(xué)范疇中，由于其具有骨骼直觀性的特點(diǎn)，通過(guò)標(biāo)本直接觀察就可以較易理解它們的骨骼在演化過(guò)程中發(fā)生的變化，可以直觀地感受到骨骼的大小及位置，所以它的出現(xiàn)也成為了解剖學(xué)研究中的重要組成部分，對(duì)于物種演變及生物遺傳多樣性的研究、動(dòng)物資源科學(xué)開(kāi)展的研究、以及研究動(dòng)物與人之間的關(guān)系的重要途徑，它清晰地反應(yīng)了動(dòng)物不同年齡的骨化點(diǎn)，為當(dāng)前臨床胚胎骨骼發(fā)育畸形病理研究提供依據(jù)[4]。目前常用的染色方法有硫酸銅浸透法、茜素紅染色法、墨汁染色法、雙重染色法有茜素紅、甲基綠雙重染色，甲苯胺藍(lán)—茜素紅雙色染色法。本實(shí)驗(yàn)所采用的透明標(biāo)本的制作技術(shù)相對(duì)成熟，阿利新藍(lán)、茜素紅單染色及雙重染色。

1 材料與試劑

1.1 樣品選取

選取鮮活、外表無(wú)破損的老板魚(yú)和錦鯉進(jìn)行制作。樣品采購(gòu)于海鮮市場(chǎng)和水族館，老板魚(yú)重量在150g左右3條，錦鯉體長(zhǎng)20cm左右3條。

1.2 樣品預(yù)處理

將購(gòu)買(mǎi)的老板魚(yú)和錦鯉進(jìn)行流水清洗，首先去除皮膚上的黏液，然后去鱗、鰓及眼睛，其次除去錦鯉外表皮膚，及內(nèi)臟部分，錦鯉背鰭肌肉組織不宜過(guò)厚保留，注意不能破壞骨骼結(jié)構(gòu)及鰭條，取出內(nèi)臟時(shí)盡可能切口小些，不要傷及肋骨，保持魚(yú)體表完整，處理后將標(biāo)本用透明細(xì)魚(yú)線小心捆綁固定在干凈的長(zhǎng)條玻璃（或高透亞克力板）上，此步驟很重要，方便后續(xù)標(biāo)本轉(zhuǎn)移，將其置于95%酒精中固定。

1.3 主要器皿、藥品試劑和溶液配制

1.3.1 實(shí)驗(yàn)主要器皿

染色及透明用大號(hào)無(wú)色透明保鮮盒、容量瓶、滴管、電子天平、燒杯、玻璃棒、燒杯、洗瓶、手術(shù)刀、鑷子、吸水紙等。

1.3.2 藥品及試劑

無(wú)水乙醇、氨水、氫氧化鉀、茜素紅、阿利新藍(lán)、冰乙酸、丙三醇、苯甲酸鈉、蒸餾水等。

1.3.3 溶液濃度及配制方法

固定液：將無(wú)水乙醇視盛放標(biāo)本瓶大小配制成為95%濃度的固定液;漂白液：按照氨水∶甘油∶水=1∶5∶15的比例配制漂白劑并混勻;預(yù)透明液：配置成5%氫氧化鉀溶液;軟骨染色液：按照染色液每1L體積，將無(wú)水乙醇與冰乙酸進(jìn)行1∶1混合，并加入200mg阿利新藍(lán)混勻;硬骨染色液：1g茜素紅和100 mL95%乙醇混勻， 再與1%氫氧化鉀900mL溶液混合;梯度脫色液：分別配置成25%（添加0.5%KOH溶液）、50%（添加0.5%KOH溶液）、75%（添加0.5%KOH溶液）濃度的丙三醇溶液;保存液：100%丙三醇。

2 制作方法及染色步驟

2.1 染色前預(yù)處理

將已固定半個(gè)月左右的魚(yú)標(biāo)本取出，用吸水紙吸干，將其放于預(yù)透明液中進(jìn)行腐蝕透明，此環(huán)節(jié)至關(guān)重要，時(shí)間不宜腐蝕過(guò)長(zhǎng)，濃度過(guò)低會(huì)延長(zhǎng)腐蝕時(shí)間，濃度過(guò)高將導(dǎo)致肌肉松散脫落，影響透明效果，尤為魚(yú)背鰭條部分很容易脫落解體。一般視魚(yú)體厚度及大小，腐蝕透明控制在2d左右，若固定的魚(yú)類標(biāo)本肌肉不泛白顏色較重，則還需進(jìn)行一次漂白，以達(dá)到最佳透明效果。經(jīng)腐蝕透明后的肌肉呈半透明狀，可以很明顯觀察到魚(yú)體內(nèi)骨骼形態(tài)。

2.2 骨骼染色

將腐蝕透明后的標(biāo)本小心拖起，根據(jù)軟骨及硬骨不同分別置于染色液中，先進(jìn)行單染，染色時(shí)間要根據(jù)標(biāo)本實(shí)際狀態(tài)，要及時(shí)觀察，避免染色過(guò)重過(guò)深，特別是肌肉被染料沾染過(guò)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致后期脫色難，整體標(biāo)本透明效果發(fā)暗，一般視肌肉厚度和骨骼著色程度，染色時(shí)間控制在1d～2d。另外，還可按照研究需求進(jìn)行雙重染色，在硬骨或軟骨染色后，進(jìn)行交換染料雙重染色，此時(shí)需要隨時(shí)觀察，當(dāng)出現(xiàn)軟骨變藍(lán)、硬骨變紅時(shí)及時(shí)停止染色，用蒸餾水小心沖洗標(biāo)本表面，洗去標(biāo)本體表和腹腔內(nèi)多余染料，直到無(wú)浮色溶出即可。

2.3 肌肉脫色

將染色后的魚(yú)標(biāo)本置于梯度脫色液中，順序按照濃度低轉(zhuǎn)移至高濃度，每個(gè)濃度脫色停留時(shí)間為2d～3d，當(dāng)觀察標(biāo)本肌肉已接近透明狀態(tài)，軟硬骨骼及關(guān)節(jié)部位色系清晰時(shí)表明脫色完成，進(jìn)入保存環(huán)節(jié)。

2.4 標(biāo)本保存

將脫色后的標(biāo)本轉(zhuǎn)移到100%丙三醇中支撐固定，加入0.6%的苯甲酸鈉可有效防腐[5]，為了呈現(xiàn)最佳觀察效果，在選取標(biāo)本瓶時(shí)盡可能選擇寬度及高矮合適的標(biāo)本瓶，以便于日后觀察。

3 結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用化學(xué)藥品和物理方法通過(guò)堿性透明液體作用于小型魚(yú)肌體組織，使組織的折光率和透明劑的折光率相近，從而達(dá)到透明的目的。透明后的標(biāo)本其骨骼（含鈣部分），因硬骨部分對(duì)茜素紅有較強(qiáng)的特異性，所以被染成玫瑰紅色，軟骨中具有硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素等主要成分被阿利新藍(lán)染成藍(lán)色，兩者輪廓清晰，顏色均勻，其他組織均呈無(wú)色透明狀，因此骨骼呈現(xiàn)了透明后的顏色狀態(tài)[6][7]。通過(guò)茜素紅及阿利新藍(lán)染色劑對(duì)兩種常見(jiàn)魚(yú)類的硬骨及軟骨部分進(jìn)行成功著色，界限清晰，且易于識(shí)別，提供了傳統(tǒng)解剖方法不易得到的信息[8]?？傮w來(lái)說(shuō)，一具完好的透明標(biāo)本所需要的周期要根據(jù)原材料的大小、肌肉厚度以及所需的單復(fù)染色工藝等，一般完成周期在1～2個(gè)月。相信隨著透明標(biāo)本的不斷深入研究，立足于當(dāng)代科普展覽中，其獨(dú)特的展示方式也必將作為新的文化特色產(chǎn)業(yè)出現(xiàn)，其作用也將進(jìn)一步顯現(xiàn)出來(lái)。

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Technique of making transparent specimen of small fishes

CHEN Guanhua

（Animal Husbandry and Fishery Technical Service Center of Zhaoyuan County， Zhaoyuan 166500， Heilongjiang China）

Abstract：The article to Raja porosa （commonly known as "the boss fish"） is a representative of cartilaginous fish and Cyprinus carpio haematopterus， represented by bony fish as the main object of the experiment， after descaling and evisceration， internal corrosion by potassium hydroxide transparent muscle with the new blue and alizarin red stain for fish cartilage and bony part of shading， again through the decoloring liquid and glycerin to the external muscle decoloring and transparent.After transparency， the skeletons （calcium-containing parts） of fish were dyed rose red by alizarin red， and the cartilage was dyed blue by Alicin blue. Both were clear in outline and uniform in color， and the other tissues were colorless and transparent， resulting in a transparent fish specimen with complete appearance， clear bone structure and distinct layers.

Keywords：transparent specimen; Bone; Dyeing; Bony; cartilage第41卷第1期2022年2月 黑龍江水產(chǎn)Northern Chinese Fisheries實(shí)用技術(shù)Practical technology

第41卷第1期2022年2月 黑龍江水產(chǎn)Northern Chinese FisheriesVol.41? ?No.1 February 2022

作者簡(jiǎn)介：陳冠華（1984-），男，齊齊哈爾市龍江縣人，碩士研究生，水產(chǎn)工程師。研究方向：水產(chǎn)技術(shù)推廣。