當歸揮發(fā)油對痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠鈣通道蛋白表達的影響

王雨薇,陳國廉,普 彬,?；矍?車永貴,陳光艷

(甘肅省人民醫(yī)院,甘肅 蘭州 730030)

痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變(painful diabetic peripheral neuropathy,PDPN)在糖尿病患者中的發(fā)病率為10%～20%[1]。PDPN 以自發(fā)性疼痛、痛覺過敏、痛覺超敏和一定程度感覺缺失為特征,癥狀多為四肢末端的灼燒樣或針刺樣疼痛,夜間加重,強度異常劇烈,對標準化鎮(zhèn)痛治療效果差,是糖尿病并發(fā)癥治療領(lǐng)域的重要難題,嚴重影響患者的生活質(zhì)量[2]。目前研究表明，PDPN發(fā)病機制與Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)相關(guān)[3],在 STZ 誘導的糖尿病大鼠模型的神經(jīng)細胞中，T型和N型Ca2+通道的基因表達水平增高，神經(jīng)損傷后的早期使用Cav3.2通道阻斷劑，可以阻斷神經(jīng)病理性疼痛由急性期向慢性期的轉(zhuǎn)變，有效阻止神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生[4]。本研究觀察了當歸揮發(fā)油對PDPN大鼠L4～5背根神經(jīng)節(jié)細胞T型及N型鈣離子通道Cav3.1、Cav3.2、Cav2.2蛋白表達的影響,探討其是否能夠改善PDPN大鼠L4～5背根神經(jīng)節(jié)細胞鈣離子超載,從而抑制PDPN的發(fā)生和進展。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 成年雄性SPF級Wistar大鼠50只，體重200～250 g,購自常州卡文斯實驗有限公司，許可證號:SYXK(閩)2018-0008。所有操作及動物處理均嚴格遵循相關(guān)動物保護及使用規(guī)定。

1.2主要儀器 低溫高速離心機,Eppenedorf(Centrifuge 5418 R)；電泳儀、電泳槽,Tanon(EPS-300)；小型垂直電泳槽,Bio-rad(1658001)；轉(zhuǎn)印槽,Bio-rad(170-3930)；脫色搖床,Aohua(TY-80B)；暗匣,Servicebio(WGA0017)；暗室專用紅燈,Servicebio(WGA0016)；柯達膠片,Servicebio(WGJP0001)；倒置顯微鏡,Leica(DMi3000 B)；Von Frey纖維絲,上海玉研(Aesthesio)；石蠟切片機,Leica (RM2245)；攤片機,Leica (TPJ-438)；恒溫烘箱,上海恒一科學儀器有限公司(DHG-9030)；顯微鏡,Olympus(BX53)；數(shù)碼相機,Olympus(SC180)。

1.3主要藥物及試劑 當歸揮發(fā)油(南京草本源生物科技有限公司，批號： 2019032415)；RIPA裂解液,Beyotime(P0013B)；PMSF (100 mmol/L),Beyotime(ST506)；BCA蛋白濃度測定試劑盒,Beyotime(P0010S)；顯影定影試劑,Servicebio(G2019)；ECL,Servicebio(G2014)；預(yù)染蛋白Marker,Beyotime(P0066)；PBS,Beyotime(C0221A)；PVDF膜,Beyotime(FFP24)；TBSTx (10X),Beyotime(ST677-100 mL)；10% SDS,Beyotime(ST628)；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液,Beyotime(P0015A)；丙烯酰胺,sigma(HC2040)；過硫酸銨,sigma(17874)；TEMED,sigma(17919)；脫脂奶粉,Beyotime(P0216-300 g)；Tris-HCl,pH8.8,Beyotime(ST789-100 mL)；Tris-HCl,pH6.8,Beyotime(ST768-100 mL)；Cav3.1 Antibody(兔多克隆抗體),Abcam(ab134269)；Cav3.2 Antibody(兔多克隆抗體)；Affinity(DF4615)。

1.4實驗方法 取雄性Wistar大鼠10只作為正常組，其余大鼠用于糖尿病造模。造模方法:大鼠夜間禁食,然后單次腹腔注射煙酰胺50 mg/kg，間隔15 min后腹腔注射鏈脲佐菌素52.5 mg/kg。鏈脲佐菌素注射后,所有大鼠用5%葡萄糖溶液代替自來水飲用24 h,以降低低血糖休克相關(guān)死亡的風險。鏈脲佐菌素注射2 d后,從每只大鼠的尾靜脈取血測量血糖水平,血糖超過200 mg/dL的大鼠被認為患有糖尿病。將造模成功的大鼠隨機分為模型組和當歸揮發(fā)油高、中、低劑量組，每組10只。當歸揮發(fā)油高劑量組給予10%當歸油15 mL/(kg·d)灌胃[按照1%吐溫80與當歸揮發(fā)油2∶1的比例加蒸餾水配成,等效劑量約等于60 kg成人每日當歸用量(30 g)的10倍],當歸揮發(fā)油中劑量組給予5%當歸油15 mL/(kg·d)灌胃[按照1%吐溫80與當歸揮發(fā)油2∶1的比例加蒸餾水配成,等效劑量約等于60 kg成人每日當歸用量(30 g)的5倍]，當歸揮發(fā)油低劑量組給予 2.5%當歸油15 mL/(kg·d)灌胃[按照1%吐溫80與當歸揮發(fā)油2∶1的比例加蒸餾水,等效劑量約等于60 kg成人每日當歸用量(30 g)的2.5倍]，模型組和正常組灌胃等容量生理鹽水,均1次/d,連續(xù)灌胃8周。整個實驗期間，各組大鼠給予SPF級飼料喂養(yǎng),自由進食和水。

1.5檢測指標與方法

1.5.1體重和血糖 分別于造模成功后灌胃前及灌胃4周、8周用天平稱量各組大鼠體重，血糖儀檢測尾靜脈空腹血糖水平。

1.5.2雙后足機械痛閾 分別于造模成功后灌胃前及灌胃4周、8周檢測各組大鼠雙后足機械痛閾：將大鼠置于20 cm×20 cm金屬籠中適應(yīng)環(huán)境30 min,用重量為0.099 g的Von Frey纖維絲刺激大鼠后爪的足掌中心部位，逐漸增加壓力,當大鼠出現(xiàn)后足迅速縮回、抬起、快速甩足、甩足后舔足、嘶叫等反應(yīng)時計為陽性，記錄此時刺激力度。左右后足輪流測試,每次間隔10 min，計算3次測試的平均值。

1.5.3L4～5背根神經(jīng)節(jié)中Cav3.2表達情況 隨機取造模成功后灌胃前及灌胃4周各組3只大鼠和灌胃8周末剩余大鼠的L4～5背根神經(jīng)節(jié)組織，置于4%甲醛固定24 h。洗滌、脫水，透明、浸蠟、包埋、切片、烤片和脫蠟，37 ℃下5%BSA封閉60 min。傾去多余血清,滴加以1∶100稀釋的Cav3.2抗體，4 ℃下封閉過夜。PBS沖洗,5 min,3次。加1∶1 000稀釋熒光二抗cy3和DAPI混合液,避光室溫孵育60 min。PBS沖洗,5 min,3次。防淬滅封片劑封片,4 ℃下避光保存。顯微鏡拍照觀察。

1.5.4L4～5背根神經(jīng)節(jié)中Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3、Cav2.2蛋白表達情況 隨機取造模成功后灌胃前及灌胃4周各組3只大鼠和灌胃8周末剩余大鼠的L4～5背根神經(jīng)節(jié)，按照Western blot法處理檢測:組織塊用PBS洗滌2～3次,每60 mg組織加入200 μL裂解液,震蕩、離心,收集裂解液上清、計算各標準品和待測蛋白質(zhì)樣品在562 nm 處的吸光值,根據(jù)標準曲線的計算公式算出樣品濃度、SDS-PAGE凝膠電泳,參照預(yù)染Marker的位置,待目的條帶進入凝膠最佳分離區(qū)(大約凝膠的2/3)時,停止電泳。PVDF膜無水甲醇浸泡3～5 min,水和電轉(zhuǎn)液依次漂洗2 min,2次；參考目的條帶分子量大小將轉(zhuǎn)好的膜對照Marker進行裁剪,PVDF膜置于封閉液中,室溫下封閉1 h；將Cav3.1用封閉液稀釋1 μg/mL，Cav3.2和Cav2.2用封閉液按1∶1 000的比例稀釋,Cav3.3用封閉液按1∶200的比例稀釋,內(nèi)參一抗用封閉液按1∶10 000的比例稀釋；封閉后的膜分別加入對應(yīng)的一抗工作液中,4 ℃搖動過夜；將PVDF膜重復洗滌3次；將二抗用1×TBST稀釋2 000倍,將洗滌后的PVDF膜放入二抗工作液中,室溫、避光緩慢搖動60 min,用1×TBST洗膜3次,洗去游離二抗。取ECL化學發(fā)光顯色液A液和B液等量混合,沖洗PVDF膜3～5 min,然后用保鮮膜包裹好。在暗室中使用膠片曝光,膠片先置于顯影液中2 min,用清水沖洗后再置于定影液中。最后沖洗膠片,烘干后保存。將膠片進行掃描存檔,用蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示蛋白表達量。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠體重和血糖 造模成功灌胃前，模型組及當歸揮發(fā)油各組大鼠體重均明顯低于正常組(P均<0.05)；灌胃4周、8周后，模型組及當歸揮發(fā)油各組大鼠體重仍明顯低于正常組(P均<0.05)，但當歸揮發(fā)油各組大鼠體重均明顯高于模型組(P均<0.05),且當歸揮發(fā)油高劑量組明顯高于當歸揮發(fā)油低、中劑量組(P均<0.05)，當歸揮發(fā)油中劑量組明顯高于當歸揮發(fā)油低劑量組(P<0.05)。造模成功灌胃前，模型組及當歸揮發(fā)油各組大鼠空腹血糖均明顯高于正常組(P均<0.05)；灌胃4周、8周后，模型組及當歸揮發(fā)油各組大鼠空腹血糖仍明顯高于正常組(P均<0.05)，但當歸揮發(fā)油各組大鼠空腹血糖均明顯低于模型組(P均<0.05),且當歸揮發(fā)油高劑量組明顯低于當歸揮發(fā)油低、中劑量組(P均<0.05)，當歸揮發(fā)油中劑量組明顯低于當歸揮發(fā)油低劑量組(P<0.05)。見圖1。

圖1 正常組和痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變各組大鼠造模成功灌胃前及灌胃4周、8周后體重及血糖

2.2各組大鼠雙后足機械痛閾 造模成功灌胃前，模型組及當歸揮發(fā)油各組大鼠雙后足機械痛閾值均明顯高于正常組(P均<0.05)；灌胃4周、8周后，模型組及當歸揮發(fā)油各組大鼠雙后足機械痛閾值仍明顯高于正常組(P均<0.05)，但當歸揮發(fā)油各組大鼠雙后足機械痛閾值均明顯低于模型組(P均<0.05),且當歸揮發(fā)油高劑量組明顯低于當歸揮發(fā)油低、中劑量組(P均<0.05)，當歸揮發(fā)油中劑量組明顯低于當歸揮發(fā)油低劑量組(P<0.05)。見圖2。

圖2 正常組和痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變各組大鼠造模成功灌胃前及灌胃4周、8周后雙后足機械痛閾

2.3各組大鼠L4～5背根神經(jīng)節(jié)中Cav3.2表達情況造模成功灌胃前與正常組比較，模型組及當歸揮發(fā)油各組大鼠L4～5背根神經(jīng)節(jié)中Cav3.2陽性表達熒光強度明顯增強；灌胃4周、8周后與模型組比較，當歸揮發(fā)油各組大鼠Cav3.2陽性表達熒光強度減弱，且當歸揮發(fā)油低、中、高劑量組呈劑量依賴性減弱。見圖3～5。

圖3 正常組和痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變各組大鼠造模成功后灌胃前L4～5背根神經(jīng)節(jié)中Cav3.2表達情況(免疫熒光染色，×400)

圖4 正常組和痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變各組大鼠灌胃4周后L4～5背根神經(jīng)節(jié)中Cav3.2表達情況(免疫熒光染色，×400)

圖5 正常組和痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變各組大鼠灌胃8周后L4～5背極神經(jīng)節(jié)中Cav3.2表達情況(免疫熒光染色，×400)

2.4各組大鼠L4～5背根神經(jīng)節(jié)中Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3、Cav2.2蛋白表達情況 造模成功灌胃前，模型組及當歸揮發(fā)油各組大鼠Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3、Cav2.2蛋白表達量均明顯高于正常組(P均<0.05)；灌胃4周、8周后，模型組大鼠Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3、Cav2.2蛋白表達量仍明顯高于正常組(P均<0.05)；灌胃4周后，當歸揮發(fā)油低劑量組大鼠Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3、Cav2.2蛋白表達量與模型組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，當歸揮發(fā)油中、高劑量組均明顯低于模型組(P均<0.05)，且當歸揮發(fā)油高劑量組均明顯低于當歸揮發(fā)油中劑量組(P均<0.05)；灌胃8周后，當歸揮發(fā)油各劑量組大鼠Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3、Cav2.2蛋白表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)，且當歸揮發(fā)油高劑量組明顯低于當歸揮發(fā)油低、中劑量組(P均<0.05)，當歸揮發(fā)油中劑量組明顯低于當歸揮發(fā)油低劑量組(P<0.05)。見圖6～8。

圖6 正常組和痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變各組大鼠造模成功后灌胃前L4～5背根神經(jīng)節(jié)中Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3、Cav2.2蛋白表達情況

圖7 正常組和痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變各組大鼠灌胃4周后L4～5背根神經(jīng)節(jié)中Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3、Cav2.2蛋白表達情況

圖8 正常組和痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變各組大鼠灌胃8周后L4～5背根神經(jīng)節(jié)中Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3、Cav2.2蛋白表達情況

3 討 論

中醫(yī)根據(jù)PDPN的癥狀特點,認為其屬于“痛證”“血痹”“痿證”等范疇[5]。其發(fā)病多由久食肥甘、情志不暢等導致臟腑功能受損,日久脾氣不能散精,氣血陰陽皆有不足,氣血虧虛,津枯血滯,生痰成瘀,痰濁瘀血痹阻脈絡(luò),經(jīng)絡(luò)不通則“痛”,肌膚不榮則“麻”,陰陽俱損,陽虛不能溫煦氣化,血行不暢,血得寒則凝,形成絡(luò)脈瘀血,營衛(wèi)不能周流,肢體脈絡(luò)、筋骨、皮膚失于濡養(yǎng)則“痹”之癥成矣。當歸揮發(fā)油是從當歸中提取的有效成分,基于“血中氣藥”的理論,當歸揮發(fā)油為當歸中“輕者”,“輕者”能行氣,氣又能行血,因此可治療“血瘀”所致的疾病[6]。

神經(jīng)細胞鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)是導致缺血性神經(jīng)元發(fā)生不可逆損傷的關(guān)鍵步驟[7]，神經(jīng)細胞鈣超載是細胞凋亡的最后共同通路[8-11]。導致細胞內(nèi)Ca2+升高的原因是胞外Ca2+內(nèi)流和胞質(zhì)Ca2+庫釋放,前者為Ca2+通過開放的細胞膜鈣通道進入細胞質(zhì)。在外源性Ca2+內(nèi)流中,電壓門控鈣通道是Ca2+進入細胞的主要方式[12]。

有研究證實，T型Ca2+通道調(diào)節(jié)傷害感受器的亞閾值興奮性,且這種電流在實驗性糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠的傷害感受器中增加[3]。在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠模型中,神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞均經(jīng)歷代謝應(yīng)激和線粒體功能障礙,其導致Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào),線粒體內(nèi)的Ca2+緩沖受損,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導致的Ca2+積聚和Ca2+信號傳導失調(diào),進而促進PDPN的發(fā)展[4]，使用特異性受體阻斷Cav3.2表達通道的功能可以抑制痛覺過敏,T型鈣離子通道的下調(diào)可以減輕痛覺超敏反應(yīng)[4，13-15]。

本實驗結(jié)果顯示，高血糖可致大鼠雙后足機械痛閾升高,細胞內(nèi)鈣離子增多,Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3、Cav2.2蛋白表達量顯著升高；不同劑量的當歸揮發(fā)油干預(yù)可以降低大鼠的雙后足機械痛閾值，減弱Cav3.2表達熒光強度,下調(diào)Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3、Cav2.2蛋白表達,高劑量當歸揮發(fā)油效果最為顯著。證實當歸揮發(fā)油可以有效降低N型及T型鈣離子通道蛋白Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3、Cav2.2的表達,通過Ca2+通道的下調(diào),起到鈣阻滯作用,改善PDPN大鼠痛覺超敏反應(yīng),從而抑制PDPN的進展，說明當歸揮發(fā)油具有T型鈣離子通道靶向治療作用,為中西醫(yī)結(jié)合治療PDPN提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)及新思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。