PCR儀的分類及校準(zhǔn)方法分析

張永臣 周彤 / 黑龍江省計量檢定測試研究院

0 引言

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，簡稱PCR）儀利用PCR技術(shù)對特定DNA分子進(jìn)行體外快速擴增及分析，是一種廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域的儀器。該技術(shù)可將微量的靶DNA特異地擴增上百萬倍，其原理為在一個標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)體系中重復(fù)完成以下三個步驟：模板DNA的變性（溫度場90～96 ℃）、模板DNA與引物的退火45～65 ℃、引物的延伸55～75 ℃。每一次擴增需在指定溫度場下完成，即DNA的體外擴增需要通過一臺精密溫度控制儀完成。1988年美國Cetus公司推出了第一臺PCR自動熱循環(huán)儀，開創(chuàng)了PCR自動化進(jìn)程。隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展，在傳統(tǒng)PCR儀基礎(chǔ)上增加信號采集系統(tǒng)和數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)，構(gòu)成了相對定量或者絕對定量分析模式的PCR儀。對不同加熱原理、不同分析方法的PCR儀的測量結(jié)果準(zhǔn)確性判定及量值溯源工作提出了新的要求。

1 PCR儀的分類

本文對PCR儀的分類主要參考YY/T 1173-2010《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀》，并結(jié)合實際應(yīng)用[1]。隨著對該類儀器的深入研究及開發(fā)利用，控溫更精準(zhǔn)、檢測通量更高、定量分析更準(zhǔn)確的PCR儀正逐漸被推廣應(yīng)用，PCR儀的分類也將不斷更新完善。

1.1 按控溫方式分類

溫度控制是PCR儀的關(guān)鍵技術(shù)，樣品池溫度控制的準(zhǔn)確性、均勻性和波動性直接影響聚合酶鏈反應(yīng)的擴增結(jié)果。現(xiàn)階段PCR儀常見的控溫系統(tǒng)有兩種。一種是空氣循環(huán)驅(qū)動控溫系統(tǒng)，多以電熱絲加熱，空氣制冷，利用風(fēng)扇將熱風(fēng)或冷風(fēng)傳送給反應(yīng)孔。也有由熱風(fēng)槍提供熱風(fēng)，冷氣由空氣或其他制冷設(shè)備提供。另一種是半導(dǎo)體鋁塊基座控溫系統(tǒng)（見圖1），利用具有熱電能量轉(zhuǎn)換特性的特殊導(dǎo)體材料組成串聯(lián)的PN結(jié)（見圖2），并通上直流電，便能實現(xiàn)一端制冷一端制熱的效果。當(dāng)電流從N型半導(dǎo)體流向P型半導(dǎo)體方向時，接觸處會吸熱，形成冷端；當(dāng)電流從P型半導(dǎo)體流向N型半導(dǎo)體方向時，接觸處會放熱，形成熱端。半導(dǎo)體控溫系統(tǒng)已成為PCR儀主流控溫系統(tǒng)。

圖1 半導(dǎo)體鋁塊基座控溫系統(tǒng)

圖2 半導(dǎo)體控溫原理

張蓬勃等人依據(jù)非穩(wěn)態(tài)傳熱原理，考慮熱量從鋁塊基座傳導(dǎo)至試劑需要一定時間，試劑的升降溫相對基座的升降溫存在時間延遲，因此，不能直接檢測反應(yīng)池中試劑的實際溫度。為解決對試劑溫度的實時準(zhǔn)確監(jiān)控，設(shè)計了基于紅外熱像儀的實時溫度監(jiān)控系統(tǒng)[2]。劉超等人設(shè)計了PCR微流體芯片溫度控制系統(tǒng)，采用具有光學(xué)透明的PDMS和ITO導(dǎo)電玻璃，設(shè)計制作了溫度可控全透明PDMS微流體芯片，實現(xiàn)對PCR反應(yīng)過程中3個溫度區(qū)的獨立設(shè)置和控制[3]。

1.2 按擴增結(jié)果處理方式分類

根據(jù)PCR儀對擴增結(jié)果的處理方式，可將其分為普通PCR儀、實時熒光定量PCR儀和數(shù)字PCR儀。

普通PCR儀比實時熒光定量PCR儀少了熒光信號采集系統(tǒng)和計算機分析處理系統(tǒng)，普通PCR儀配合后續(xù)檢測方法多用于定性地分析是否存在目標(biāo)片段。

實時熒光定量PCR儀是在擴增時加入熒光染料或者使用帶有熒光集團(tuán)和淬滅集團(tuán)標(biāo)記的探針，擴增產(chǎn)生的熒光信號通過采集系統(tǒng)實時傳輸至分析處理系統(tǒng)，得出量化的實時結(jié)果輸出。實時熒光定量PCR儀有單通道、雙通道和多通道之分，每個通道可以對一種熒光染料進(jìn)行檢測。如果擴增體系采用多個熒光染料標(biāo)記，則需要多通道的實時熒光定量PCR儀完成多色熒光的同時采集和多個基因的同時檢測分析。

數(shù)字PCR是一種可以對核酸絕對定量的技術(shù)。與熒光定量PCR的區(qū)別在于不需要用標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，而將一個樣本稀釋后分配到上萬個不同的反應(yīng)單元中，使每個反應(yīng)單元不含或包含一個核酸分子，且每個反應(yīng)單元都會對目標(biāo)分子進(jìn)行擴增，然后再對每個反應(yīng)單元進(jìn)行熒光信號的統(tǒng)計并計算樣本濃度。

2 PCR儀的校準(zhǔn)方法分析

2.1 溫度校準(zhǔn)

JJF 1527-2015《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》對PCR儀的溫度校準(zhǔn)包括溫度示值誤差、溫度均勻度、平均升溫速率和平均降溫速率[4]。上海市計量測試技術(shù)研究院的朱晨彬等人提出應(yīng)對該類儀器進(jìn)行最大超調(diào)溫度以及平均超調(diào)溫度的校準(zhǔn)[5]。因為PCR儀在提高升降溫速率的同時必然產(chǎn)生熱慣性，過高的溫度影響酶的活性，不利于引物和靶基因模板的結(jié)合，過低的溫度也可能導(dǎo)致靶基因模板或PCR擴增產(chǎn)物不能完全變性，導(dǎo)致PCR過程失敗。

JJF 1527-2015中對溫度校準(zhǔn)裝置的要求為由若干個（通常是15個）精密溫度傳感器、數(shù)據(jù)采集分析模塊組成，測溫范圍0～120 ℃，測量不確定度≤0.1 ℃。規(guī)范中未對被校PCR儀的溫度指標(biāo)進(jìn)行限定，但校準(zhǔn)時應(yīng)根據(jù)被校準(zhǔn)PCR儀說明書中溫度最大允許誤差選取測量不確定度≤0.1 ℃，且最大允許誤差小于等于被校儀器最大允許誤差的三分之一的校準(zhǔn)裝置。

常用的PCR儀溫度控制準(zhǔn)確度有±0.1 ℃、±0.15 ℃、±0.2 ℃、±0.3 ℃等，所以PCR儀溫度校準(zhǔn)裝置的溫度測量準(zhǔn)確度應(yīng)該在±（0.03～0.1） ℃范圍內(nèi)，國內(nèi)多數(shù)廠家的PCR儀溫度校準(zhǔn)裝置準(zhǔn)確度在±（0.01～0.1）℃范圍內(nèi)，滿足了JJF 1821-2020《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀溫度校準(zhǔn)裝置校準(zhǔn)規(guī)范》中對該類校準(zhǔn)裝置溫度示值最大允許誤差±0.20 ℃的要求[6]。

在溫度校準(zhǔn)過程中，為準(zhǔn)確反映PCR反應(yīng)體系溫度，減小測量方法及校準(zhǔn)裝置帶來的測量誤差，曾穎研制了厚1 mm、熱觸點面積1 mm2的薄膜鉑電阻測溫傳感器，并分別測試了PCR儀反應(yīng)孔座孔壁溫度和反應(yīng)池內(nèi)溫度，如圖3所示。測量反應(yīng)池內(nèi)部的溫度偏差和溫度均勻度更好，但該方法因用戶所用反應(yīng)板的個體差異以及導(dǎo)熱油的注入量不同而產(chǎn)生測量誤差[7]。余松林等人提出一種熱敏電阻封裝方法，研制出基于熱敏電阻傳感陣列的PCR儀溫度校準(zhǔn)系統(tǒng)。該系統(tǒng)使用高靈敏度的熱敏電阻進(jìn)行封裝設(shè)計，力求緊密貼合PCR儀基座插孔（如圖4所示），很好地解決了測量反應(yīng)池內(nèi)部溫度偏差和均勻度的問題，由于仍采用有線連接控制器的方法，且PCR儀有熱蓋，多次操作之后會減少傳輸數(shù)據(jù)線的壽命，并容易發(fā)生纏繞[8]。呂茂超等人利用無線溫度傳感器和無線手持機研制了一款基于無線網(wǎng)絡(luò)的PCR儀溫度校準(zhǔn)裝置，實現(xiàn)了溫度傳感器與采集電路分離，避免了校準(zhǔn)時溫度對電路的影響[9]。

圖3 測溫位置

圖4 熱敏電阻封裝

2.2 熒光檢測系統(tǒng)校準(zhǔn)

熒光檢測系統(tǒng)是PCR儀實現(xiàn)定量功能的基礎(chǔ)，原理如圖5所示。JJF 1527-2015中對熒光檢測系統(tǒng)的校準(zhǔn)是通過樣本示值誤差和樣本線性的校準(zhǔn)實現(xiàn)的。在使用質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或者核糖核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行校準(zhǔn)時，需要精確配制至少5個梯度的未知樣溶液，這必然會引入人為操作誤差和稀釋誤差，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，當(dāng)出現(xiàn)異常系統(tǒng)誤差時很難分析原因，所以，計量技術(shù)機構(gòu)增加了校準(zhǔn)項目，更全面地評價熒光定量檢測系統(tǒng)。

圖5 熒光檢測系統(tǒng)

地方規(guī)范JJF（蘇）222-2019《實時熒光定量PCR儀校準(zhǔn)規(guī)范》、JJF（津）04-2020《實時熒光定量PCR儀校準(zhǔn)規(guī)范》和《數(shù)字PCR儀校準(zhǔn)規(guī)范（征求意見稿）》都提出了對熒光定量檢測系統(tǒng)物理項目和生物化學(xué)項目的校準(zhǔn)，其中JJF（蘇）222-2019和JJF（津）04-2020中提到的物理項目包括Ct值示值誤差、Ct值均勻度、Ct值精密度、通道峰值高度一致性、線性靈敏系數(shù)、熔解溫度漂移、熔解溫度比等，生物化學(xué)項目包括熒光強度精密度、樣本精密度、熒光線性相關(guān)系數(shù)、樣本線性相關(guān)系數(shù)等?！稊?shù)字PCR儀校準(zhǔn)規(guī)范（征求意見稿）》中建議對拷貝數(shù)濃度相對示值誤差、拷貝數(shù)濃度重復(fù)性、熒光通道一致性、熒光強度重復(fù)性、反應(yīng)單元數(shù)重復(fù)性等項目進(jìn)行校準(zhǔn)[10-11]。

JJF（蘇）222-2019和JJF（津）04-2020中還提出以一種PCR擴增光學(xué)模擬器實現(xiàn)對光學(xué)系統(tǒng)和溫度系統(tǒng)的同時校準(zhǔn)，PCR擴增光學(xué)模擬器集成了高準(zhǔn)確度溫度傳感器和發(fā)射光發(fā)生器兩部分，其控制電路可根據(jù)溫度傳感器監(jiān)測的溫度循環(huán)變化驅(qū)動發(fā)射光發(fā)生器發(fā)射逐漸增大的光強度，模擬儀器擴增過程。

對于生物化學(xué)項目的校準(zhǔn)，JJF（蘇）222-2019、JJF（津）04-2020和《數(shù)字PCR儀校準(zhǔn)規(guī)范（征求意見稿）》中都采用了與JJF 1527-2015中同樣的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，但數(shù)字PCR儀校準(zhǔn)規(guī)范對于該類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的拷貝數(shù)及不確定度要求做了修改，由拷貝數(shù)≥109 copies/μL,相對擴展不確定度≤5%修改為拷貝數(shù)≥104 copies/μL，相對擴展不確定度 ≤6%。因 此，GBW（E）091100～ GBW（E）091108系列定量PCR儀校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)符合規(guī)范要求。但對于熒光強度、精密度和熒光線性相關(guān)系數(shù)校準(zhǔn)使用的標(biāo)準(zhǔn)熒光染料的計量特性未做具體要求。

使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的校準(zhǔn)方法雖對PCR儀整機進(jìn)行了評價，但其操作過程受多種因素影響，如使用的熒光試劑、PCR反應(yīng)體系、人工操作（試劑稀釋）等都給測量結(jié)果引入一定的誤差。其次，由于定量PCR儀校準(zhǔn)用質(zhì)粒DNA含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)需儲存在-20 ℃環(huán)境條件下，且運輸過程需保證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)處于冰凍狀態(tài)，給現(xiàn)場校準(zhǔn)帶來一定難度，所以，對PCR儀熒光檢測系統(tǒng)的校準(zhǔn)逐漸由生物化學(xué)方法轉(zhuǎn)向物理光學(xué)方法。

3 結(jié)語

現(xiàn)階段PCR儀溫度溯源得到了較好的解決，因為溫度校準(zhǔn)裝置便于攜帶且自動化程度高，人為操作影響小，校準(zhǔn)結(jié)果的不確定度來源可控，所以多數(shù)校準(zhǔn)機構(gòu)對PCR儀只做溫度校準(zhǔn)項目。為全面評價PCR儀的計量特性，對PCR儀光學(xué)檢測系統(tǒng)的校準(zhǔn)也非常必要，但限于現(xiàn)有的定量PCR儀校準(zhǔn)用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（包括質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、核糖核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）的種類較少，生產(chǎn)能力有限，且運輸攜帶不便，以及在使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)過程中需要加入配套的PCR反應(yīng)體系、人工稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，因此，要求校準(zhǔn)機構(gòu)的工作人員有熟練的實驗操作技能。在JJF（蘇）222-2019和JJF（津）04-2020中雖提到以一種光學(xué)模擬器來模擬PCR過程，將生物化學(xué)校準(zhǔn)方法一定程度上轉(zhuǎn)向了物理光學(xué)方法，具有較強的科學(xué)性，但暫時未得到廣泛應(yīng)用。對于數(shù)字PCR儀校準(zhǔn)規(guī)范征求意見稿中提到的熒光強度、精密度、熒光線性相關(guān)系數(shù)校準(zhǔn)所使用的熒光染料，暫時沒有相應(yīng)的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，校準(zhǔn)的溯源性有待商榷。所以，計量技術(shù)人員還應(yīng)繼續(xù)在校準(zhǔn)裝置和校準(zhǔn)技術(shù)上不斷深耕，為PCR儀測量結(jié)果的溯源提供持續(xù)的技術(shù)保證。