復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者種植窗口期外周血與子宮內(nèi)膜淋巴細(xì)胞亞群比例分析

王耀楷，羅智華，姚吉龍

（1. 廣州醫(yī)科大學(xué)2017級(jí)碩士研究生，廣東 廣州 511436；2. 南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院婦產(chǎn)科，廣東 深圳 518000）

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（Recurrent spontaneous abortions，RSA）是指同一性伴侶發(fā)生2次或2次以上的妊娠失敗，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病因復(fù)雜，包括遺傳、內(nèi)分泌、解剖，男方異常等。仍有過半數(shù)患者找不到明確的病因，這部分患者我們稱之為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者［1］。近年來研究表明約半數(shù)以上的RSA與免疫功能紊亂有關(guān)［2］。母胎免疫耐受是成功妊娠的重要環(huán)節(jié)，其機(jī)制是多方面的，目前應(yīng)用外周血淋巴評(píng)估母胎免疫狀態(tài)的報(bào)道存在爭議［3］。子宮內(nèi)膜作為母胎界面的重要組成部分，當(dāng)中的淋巴細(xì)胞與胎兒來源的滋養(yǎng)細(xì)胞直接接觸而不產(chǎn)生免疫應(yīng)答，是胚胎正常發(fā)育的免疫基礎(chǔ)。因此，我們推測(cè)子宮內(nèi)膜淋巴細(xì)胞比例發(fā)生改變導(dǎo)致母胎免疫識(shí)別紊亂，可能是URSA 的病因之一。本研究采用流式細(xì)胞儀對(duì)URSA 患者和因男方因素行輔助生殖的婦女的子宮內(nèi)膜及外周血淋巴細(xì)胞亞群比例進(jìn)行分析，探討T淋巴細(xì)胞亞群及NK 細(xì)胞在妊娠維持與胚胎丟失中的作用，以期進(jìn)一步了解RSA 的發(fā)病機(jī)制，為臨床診斷與防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院復(fù)發(fā)性流產(chǎn)專科門診2018 年1 月至2019年1月收治的20例URSA 患者作為觀察組。觀察組入選標(biāo)準(zhǔn)：同一性伴侶發(fā)生兩次或兩次以上的早期自然流產(chǎn)；既往沒有活產(chǎn)、死產(chǎn)及死胎史；平素月經(jīng)規(guī)律，無排卵障礙，基礎(chǔ)性激素水平正常；夫妻雙方染色體無異常；經(jīng)超聲檢查未見生殖系統(tǒng)解剖異常；抗核抗體、抗心磷脂抗體、抗β2 糖蛋白抗體、抗狼瘡細(xì)胞抗體等自身抗體陰性。觀察組排除標(biāo)準(zhǔn)：生殖道支原體、衣原體等感染及TORCH 感染，有生殖道急慢性炎癥；近3月有使用甾體類激素等藥物。對(duì)照組選擇明確因男方因素（少、弱、畸精等）行輔助生殖的婦女。觀察組平均年齡（30.1±2.6）歲，對(duì)照組平均年齡（30.3±2.9）歲，兩組患者年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。所有入選患者均知情同意并簽署知情同意書，本研究通過深圳市婦幼保健院倫理委員會(huì)審查。

1.2 研究方法

1.2.1 取樣時(shí)間 兩組患者自測(cè)尿排卵試紙并進(jìn)行B 超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育，當(dāng)檢測(cè)線出現(xiàn)陽性后行卵泡監(jiān)測(cè)，于排卵后7 d進(jìn)行外周血及子宮內(nèi)膜取樣。

1.2.2 外周血及子宮內(nèi)膜取樣 晨起空腹抽取外周血2 mL，同日行內(nèi)膜取樣：常規(guī)消毒外陰及陰道，置入一次性內(nèi)膜取樣器（宇度，蘇州），負(fù)壓吸取內(nèi)膜組織約1～2 g，置入生理鹽水保存。外周血及子宮內(nèi)膜組織迅速送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行淋巴細(xì)胞檢測(cè)。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血及子宮內(nèi)膜CD3+T淋巴細(xì)胞、CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞、CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞、CD3-CD56+CD16+NK 細(xì)胞比例。操作步驟按試劑盒（Beckman Coulter，美國）說明進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，外周血與子宮內(nèi)膜相對(duì)應(yīng)淋巴細(xì)胞相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組外周血淋巴細(xì)胞比例比較 兩組外周血CD3+T 淋巴細(xì)胞、CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞及CD3-CD56+CD16+NK 細(xì)胞比例比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 兩組外周血T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞比例比較/±s

表1 兩組外周血T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞比例比較/±s

組別觀察組對(duì)照組n 20 20 tP CD3+T細(xì)胞65.85±9.02 68.02±7.22-0.84 0.41 CD3+CD4+T細(xì)胞33.29±7.63 35.98±6.33-1.21 0.23 CD3+CD8+T細(xì)胞26.10±6.91 25.62±5.71 0.61 0.81 CD3-CD56+CD16+NK細(xì)胞17.71±8.28 16.08±7.45 0.65 0.51

2.2 兩組子宮內(nèi)膜淋巴細(xì)胞比例比較 觀察組子宮內(nèi)膜CD3+T 淋巴細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組，CD3-CD56+CD16+NK 細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；兩組子宮內(nèi)膜CD3+CD4+T 細(xì)胞、CD3+CD8+T 細(xì)胞比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表2 兩組子宮內(nèi)膜T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞比例比較/±s

表2 兩組子宮內(nèi)膜T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞比例比較/±s

組別觀察組對(duì)照組n 20 20 tP CD3+T細(xì)胞61.05±13.22 46.99±9.65 3.84＜0.01 CD3+CD4+T細(xì)胞32.17±7.63 33.89±6.53-0.76 0.45 CD3+CD8+T細(xì)胞60.32±8.77 61.06±5.00-0.33 0.75 CD3-CD56+CD16+NK細(xì)胞30.24±6.61 47.76±7.06-8.11＜0.01

2.3 兩組外周血及子宮內(nèi)膜淋巴細(xì)胞相關(guān)性分析

兩組外周血CD3+T淋巴細(xì)胞及CD3-CD56+CD16+NK細(xì)胞比例與子宮內(nèi)膜相對(duì)應(yīng)淋巴細(xì)胞亞群比例無相關(guān)性（P＞0.05）。

3 討 論

臨床上自然流產(chǎn)的發(fā)生率為15%～25%，是臨床診療的一道難題［2］。隨著生殖免疫學(xué)研究的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)免疫因素在自然流產(chǎn)過程中起重要作用，約50%～60%的自然流產(chǎn)與妊娠期免疫功能調(diào)節(jié)紊亂密切相關(guān)，既往生殖免疫相關(guān)研究表明正常生理妊娠類似于同種異體移植，實(shí)際上是母胎半同種免疫耐受結(jié)果［4］。

目前，尚無評(píng)估母體免疫狀態(tài)的金標(biāo)準(zhǔn)，既往研究大多通過分析外周血淋巴細(xì)胞的比例來評(píng)估母體免疫狀態(tài)及預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局［5-6］，但存在爭議。最新研究發(fā)現(xiàn)，外周血淋巴細(xì)胞比例與RSA 發(fā)生無相關(guān)性，且外周血淋巴細(xì)胞比例不能準(zhǔn)確反映母胎免疫狀態(tài)。應(yīng)用外周血淋巴細(xì)胞比例評(píng)估母胎免疫狀態(tài)可能預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局不夠全面［7］。本研究綜合考慮了外周血淋巴細(xì)胞及子宮內(nèi)膜淋巴細(xì)胞比例，通過檢測(cè)URSA 患者外周血淋巴細(xì)胞亞群及子宮內(nèi)膜淋巴細(xì)胞亞群比例，探討RSA 與機(jī)體淋巴細(xì)胞免疫功能的關(guān)系。綜合分析了對(duì)照組和觀察組外周血淋巴細(xì)胞亞群及子宮內(nèi)膜淋巴亞群比例，發(fā)現(xiàn)兩組外周血淋巴細(xì)胞亞群比例無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，應(yīng)用外周血淋巴細(xì)胞來評(píng)估子宮內(nèi)膜局部免疫狀態(tài)并不準(zhǔn)確。

子宮內(nèi)膜淋巴細(xì)胞主要由T 淋巴細(xì)胞及內(nèi)膜NK 細(xì)胞（Uterine natural killer cell，uNK）構(gòu)成，子宮內(nèi)膜淋巴細(xì)胞比例隨月經(jīng)周期變化［8］，本研究選擇促黃體生成素（Luteinzing hormone，LH）峰后7 d 這樣一個(gè)種植窗口期來模擬受精卵著床時(shí)子宮內(nèi)膜免疫狀態(tài)，減少月經(jīng)周期對(duì)局部淋巴細(xì)胞比例的影響。發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，觀察組種植窗口期子宮內(nèi)膜CD3+T 淋巴細(xì)胞比例顯著增高，而uNK 細(xì)胞比例則顯著降低。結(jié)果表明，URSA 患者子宮內(nèi)膜淋巴細(xì)胞比例失衡，導(dǎo)致了母胎界面免疫功能紊亂，可能是URSA病因之一。

既往研究表明，T 淋巴細(xì)胞亞群平衡在妊娠建立與維持中發(fā)揮著重要作用，其亞群失衡導(dǎo)致了RSA 的發(fā)生［8-9］。滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)一系列獨(dú)特的主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibility com‐plex，MHC）分子是母胎免疫耐受的基礎(chǔ)。人類滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)經(jīng)典的HLA-C 和非經(jīng)典的HLA-E 來取代高度多態(tài)的經(jīng)典MHCⅠ類分子（HLA-Aand-B）［4］，是胚胎組織對(duì)子宮內(nèi)膜局部T淋巴細(xì)胞的免疫逃逸基礎(chǔ)。子宮內(nèi)膜CD3+T 淋巴細(xì)胞分為CD4+T 淋巴細(xì)胞及CD8+T淋巴細(xì)胞兩大亞群，本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組與對(duì)照組間子宮內(nèi)膜CD3+CD4+及CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞亞群比例上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。既往對(duì)子宮內(nèi)膜T 淋巴細(xì)胞功能研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜局部的T 淋巴細(xì)胞可分泌一系列的細(xì)胞因子（如：IFN、TNF、IL-6、IL-10 等）調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的功能、誘導(dǎo)母胎免疫耐受及營養(yǎng)胚胎［10-11］。因此，本研究子宮內(nèi)膜T 淋巴細(xì)胞的比例升高，推測(cè)可能由于uNK 比例下降引起T淋巴細(xì)胞比例相對(duì)性升高。

uNK 細(xì)胞在子宮內(nèi)膜淋巴細(xì)胞占主導(dǎo)地位，其細(xì)胞比例在排卵后開始上升，最高時(shí)可占據(jù)淋巴細(xì)胞中的60%［12］。有學(xué)者對(duì)早孕期蛻膜NK 細(xì)胞的表型及功能分析發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜自然殺傷細(xì)胞為一特殊分群的淋巴細(xì)胞，且通過微列陣分析證明uNK 細(xì)胞與外周血NK 細(xì)胞并非同一種細(xì)胞［13］，對(duì)uNK 細(xì)胞比例在生殖免疫方面的作用尚存爭議［14-15］。通過對(duì)uNK 細(xì)胞進(jìn)行表型分析發(fā)現(xiàn)，uNK 細(xì)胞以CD3-CD56+為主，并不表達(dá)CD16，而CD16 與抗體依賴性細(xì)胞毒作用相關(guān)［13］。同時(shí)，uNK 細(xì)胞表面表達(dá)抑制性受體如殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（Killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR）等，這些抑制性受體分別識(shí)別滋養(yǎng)層細(xì)胞的HLA-G、HLA-E 和HLA-C 等，兩者之間的相互作用導(dǎo)致母體對(duì)胎兒不引起免疫應(yīng)答［16-17］。同樣，對(duì)uNK 細(xì)胞的功能分析表明，uNK 細(xì)胞在非孕期子宮內(nèi)膜期妊娠蛻膜［18］生成一系列的血管生長因子包括血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）、胎盤生長因子（Placental growth factor，PlGF）及血管生成素2等［18］，結(jié)合uNK 細(xì)胞圍繞血管分布的特點(diǎn)，推測(cè)uNK 細(xì)胞通過分泌一系列促血管生成因子促進(jìn)子宮螺旋動(dòng)脈的重塑及胎盤的形成。另一方面，電鏡顯示uNK 細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)存在膜結(jié)合型顆粒，這些顆粒內(nèi)含穿孔素（Perforin，PFP）和顆粒酶，表明uNK細(xì)胞存在溶解細(xì)胞的潛能［19］。分析其機(jī)制可能是：⑴uNK 細(xì)胞比例下降，抑制性受體減少使得uNK 細(xì)胞激活性受體和抑制性受體間失去平衡，導(dǎo)致uNK 細(xì)胞對(duì)胚胎產(chǎn)生溶細(xì)胞效應(yīng)；⑵uNK 細(xì)胞比例下降使得其分泌的營養(yǎng)性細(xì)胞因子減少，導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲活力下降及胎盤發(fā)育不良。

本研究僅僅就外周血及子宮內(nèi)膜淋巴細(xì)胞亞群比例進(jìn)行分析，如前所述，淋巴細(xì)胞數(shù)目與功能之間的關(guān)系并沒有完全明確。因此，僅僅針對(duì)淋巴細(xì)胞比例而不結(jié)合細(xì)胞功能來評(píng)估子宮內(nèi)膜局部的免疫狀態(tài)是不全面的，后續(xù)仍需要更多的研究來表明淋巴細(xì)胞在子宮內(nèi)膜局部免疫的角色。