lncRNA TSIX通過(guò)靶向miR-548-a-3p抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和侵襲的機(jī)制研究

王佳樂(lè) 李琤 李廣明

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，以往關(guān)于肝癌發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在傳統(tǒng)蛋白編碼基因[1]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)非編碼RNA(ncRNA)占人類(lèi)基因組的95%以上，編碼RNA的蛋白質(zhì)與功能性ncRNA之間的相互作用在癌癥的發(fā)展過(guò)程中具有重要作用[2]。長(zhǎng)ncRNA(lncRNA)作為ncRNA的重要組成部分，已被證明與表觀(guān)遺傳、基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)控和翻譯有關(guān)[3]。X非活性特異性轉(zhuǎn)錄物(XIST)是最近發(fā)現(xiàn)的位于染色體10q26上的lncRNA，XIST在胃癌和結(jié)腸直腸癌中發(fā)揮明顯抑癌作用[4]。既往研究證實(shí)miR-548-a-3p參與了HCC，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明[5]。miRNA是lncRNA發(fā)揮其生物學(xué)功能的重要靶標(biāo)，生物信息學(xué)分析表明，XIST和miR-548-a-3p之間存在結(jié)合位點(diǎn)[6]。目前尚未見(jiàn)lncRNA TSIX在肝細(xì)胞癌中的研究，本研究擬探討lncRNA TSIX通過(guò)靶向miR-548-a-3p抑制HCC細(xì)胞增殖和侵襲的機(jī)制，為HCC的治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、主要儀器與試劑

Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Thermo Fisher Scientific)，胎牛血清、青霉素、鏈霉素(美國(guó)Gibco)，Lipofectamine 2000(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)，CCK-8試劑盒(美國(guó)Sigma)，WE-986.90酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad),多聚甲醛、結(jié)晶紫(中國(guó)碧云天生物科技)、SD-09倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)，膜聯(lián)蛋白V-FITC和碘化丙啶(PI)雙重染色試劑(BD Biosciences)，CV-90流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter)，Matrigel膜(美國(guó)Corning)，Transwell腔室(美國(guó)BD Biosciences)，TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(中國(guó)塔卡拉)，SYBR-Green定量實(shí)時(shí)PCR Master Mix試劑盒(日本Toyobo)，Tween-20細(xì)胞裂解緩沖液(中國(guó)碧云天生物科技)，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，美國(guó)Sigma)，聚偏二氟乙烯膜(PVDF，美國(guó)賽默飛世)，1%牛血清白蛋白(BSA，上海生工)。

二、細(xì)胞培養(yǎng)及其分組設(shè)計(jì)

Huh7細(xì)胞從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心獲得，并在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng) (含有10%的胎牛血清，100 U/mL的青霉素和100 mg/mL的鏈霉素)，并在在37 ℃、5%CO2的濕潤(rùn)氣氛中生長(zhǎng)。

lncRNA TSIX mimics組、lncRNA TSIX inhibitor組培養(yǎng)方法：載體包括lncRNA TSIX過(guò)表達(dá)載體(lncRNA TSIX mimics)，lncRNA TSIX低表達(dá)載體(lncRNA TSIX inhibitor組)購(gòu)自Ribo Bio Co，Ltd(中國(guó)廣州)。根據(jù)制造商的建議，使用Lipofectamine RNAiMAX試劑(Invitrogen，Carlsbad，美國(guó))對(duì)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后收集細(xì)胞并進(jìn)行處理以進(jìn)行進(jìn)一步的體外研究。

三、Huh7細(xì)胞活力的檢測(cè)及癌細(xì)胞單克隆形成數(shù)目檢測(cè)

使用MTT試劑盒測(cè)量細(xì)胞增殖，將細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)，并在細(xì)胞孔中加入20 μL MTT試劑(5 mg/mL)。在37 ℃下孵育4 h后，將MTT替換為150 μL DMSO，并將平板緩慢振搖10 min，通過(guò)酶標(biāo)儀在570 nm下測(cè)定每個(gè)吸光度。

通過(guò)胰蛋白酶消化收集接受不同處理后的細(xì)胞，并以1 000個(gè)細(xì)胞/孔的密度鋪在6孔板上。培養(yǎng)14 d后，將細(xì)胞用10%甲醛固定，然后用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)菌落數(shù)。

四、Huh7細(xì)胞凋亡測(cè)定

Annexin V-FITC / PI雙重染色結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以3×105細(xì)胞/孔的密度接種在6孔板中，用0.25%胰蛋白酶消化，消化后用PBS洗滌兩次，加入100 μL結(jié)合緩沖液，依次制成1×106細(xì)胞/mL懸浮液。加入膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI，在室溫下于黑暗中孵育5 min，并用FC500MCL流式細(xì)胞儀系統(tǒng)檢測(cè)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次并取平均值。

五、Huh7細(xì)胞遷移水平測(cè)定

使用Matrigel Tranwell評(píng)估細(xì)胞侵襲水平，將經(jīng)過(guò)不同處理的細(xì)胞重新懸浮在無(wú)FBS的RMPI-1640培養(yǎng)基中，并鋪在上腔室的transwell插入物上。而下腔室則裝有含有20%FBS的RMPI-1640培養(yǎng)基。進(jìn)一步培養(yǎng)24 h后，將侵襲和遷移的細(xì)胞用10%甲醛固定，并用0.1%結(jié)晶紫染色10 min。通過(guò)在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇五個(gè)視野來(lái)量化侵襲細(xì)胞的數(shù)量。

六、Huh7細(xì)胞lncRNA TSIX、miR-548-a-3p表達(dá)水平測(cè)定

首先，將細(xì)胞系制備成細(xì)胞懸液。然后，添加TRIzol試劑以提取總RNA。用紫外分光光度計(jì)測(cè)試提取的總RNA的純度和濃度。使用SYBR-Green Realtime PCR Master mix用miR-26a-5p和HMGA2反轉(zhuǎn)錄總RNA。操作步驟嚴(yán)格按照制造商的工具包進(jìn)行。然后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。 PCR反應(yīng)系統(tǒng)如下：cDNA 1 μL，上，下游引物0.4 μL，2×SYBRr-Green Realtime PCR Master mix 10 μL，被動(dòng)參考染料(50×)0.4 μL，ddH2O添加至20 μL。lncRNA TSIX的PCR反應(yīng)條件如下：在94 ℃預(yù)變性45 s，在94 ℃變性10 s，在60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)以U6作為內(nèi)部參照進(jìn)行了3次。miR-548-a-3p反應(yīng)條件如下：在94 ℃變性10s，在60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參進(jìn)行了3次。lncRNA TSIX、miR-548-a-3p的特異性引物如下：lncRNA TSIX，正向5-GCACAGGTTAGCGTG-TTTCC-3，反向5-CCCAGTTTCCCAGAGGTCAC-3； miR-548-a-3p，forward5-AACACACCTTTAC-AAGGATTCA-3。β-肌動(dòng)蛋白，上游序列：5′-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3′，下游序列：5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，定量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析比較，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組Huh7細(xì)胞OD值、存活率比較

由表1可見(jiàn)，lncRNA TSIX mimics組OD值、存活率低于Huh7細(xì)胞組(t=8.725、5.437，P<0.05)，lncRNA TSIX inhibitor組OD值、存活率高于Huh7細(xì)胞組和lncRNA TSIX mimics組(t=4.124、3.784、10.462、7.965，P<0.05)。

二、各組Huh7細(xì)胞單克隆形成數(shù)目、凋亡率及穿膜數(shù)比較

由表2及圖1、圖2可見(jiàn)，lncRNA TSIX mimics組單克隆形成數(shù)目、穿膜數(shù)低于Huh7細(xì)胞組，凋亡率高于Huh7細(xì)胞組(t=120.834、64.321、10.531，P<0.05)；lncRNA TSIX inhibitor組單克隆形成數(shù)目、穿膜數(shù)高于Huh7細(xì)胞組和lncRNA TSIX mimics組，凋亡率低于Huh7細(xì)胞組和lncRNA TSIX mimics組(t=37.192、174.632、30.703、104.562、37.385、48.021，P<0.05)。

表1 各組Huh7細(xì)胞OD值、存活率比較

表2 各組Huh7細(xì)胞克隆形成數(shù)目、凋亡率及穿膜數(shù)比較

圖1 各組Huh7細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖

A: Huh7細(xì)胞組；B: lncRNA TSIX mimics組；C: lncRNA TSIX inhibitor組

三、各組Huh7細(xì)胞lncRNA TSIX、miR-548-a-3p表達(dá)水平比較

由表3可見(jiàn)，lncRNA TSIX mimics組lncRNA TSIX高于Huh7細(xì)胞組，miR-548-a-3p低于Huh7細(xì)胞組(t=12.372、11.265，P<0.05)，lncRNA TSIX inhibitor組lncRNA TSIX低于Huh7細(xì)胞組和lncRNA TSIX mimics組，miR-548-a-3p高于Huh7細(xì)胞組和lncRNA TSIX mimics組(t=4.618、9.597、6.612、10.058，P<0.05)。

討 論

具有功能性的lncRNA的異常表達(dá)與肝癌的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲性生物學(xué)行為密切相關(guān)。例如，在人肝癌組織和細(xì)胞中，lncRNA轉(zhuǎn)移相關(guān)的肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)一直增加，這可能成為肝癌的有效生物標(biāo)志物[7]。在本研究中，lncRNA TSIX mimics組OD值、存活率、單克隆形成數(shù)目、穿膜數(shù)低于Huh7細(xì)胞組，lncRNA TSIX inhibitor組OD值、存活率、單克隆形成數(shù)目、穿膜數(shù)高于Huh7細(xì)胞組、lncRNA TSIX mimics組(P<0.05)。lncRNA TSIX mimics組凋亡率高于Huh7細(xì)胞組，lncRNA TSIX inhibitor組凋亡率低于Huh7細(xì)胞組、lncRNA TSIX mimics組(P<0.05)。這說(shuō)明lncRNA TSIX參與了肝癌的發(fā)病和發(fā)展，并可明顯抑制HCC細(xì)胞增殖、侵襲，促進(jìn)HCC細(xì)胞凋亡。 lncRNA TSIX已被證明在幾種人類(lèi)腫瘤中低表達(dá)，并在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起著抑癌作用[8-9]。在臨床研究中，已經(jīng)觀(guān)察到人肝癌組織中l(wèi)ncRNA TSIX表達(dá)的顯著下調(diào)，這與其在其他腫瘤中的表達(dá)譜一致[10-11]。本研究假設(shè)具有癌抑制作用的lncRNA TSIX在HCC中起一定的作用，并且通過(guò)觀(guān)察HCC細(xì)胞的生物行為學(xué)進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論。

為了進(jìn)一步探索肝癌中l(wèi)ncRNA TSIX的精確調(diào)控過(guò)程，根據(jù)已發(fā)表的研究和生物信息學(xué)分析，推斷miR-548-a-3p可能是lncRNA TSIX的下游靶標(biāo)。新興研究表明，miRNA屬于ncRNA，在人類(lèi)HCC中也起著至關(guān)重要的作用，包括miR-548-a-3p[12]。miR-548-a-3p在肝癌組織和血清中上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，與患者預(yù)后不良有關(guān)[13]。lncRNA對(duì)miRNA的直接或間接調(diào)節(jié)是發(fā)揮其生物學(xué)功能的重要機(jī)制之一。生物信息學(xué)分析表明，lncRNA TSIX可能通過(guò)堿基配對(duì)相互作用與miR-548-a-3p結(jié)合，表明它們之間的功能相關(guān)性[14]。與lncRNA TSIX相反，臨床研究觀(guān)察到miR-548-a-3p在HCC組織和細(xì)胞中顯著增加[15]。有趣的是，在肝癌組織中，lncRNA TSIX的表達(dá)與miR-548-a-3p呈顯著負(fù)相關(guān)，表明它們之間存在相互調(diào)節(jié)的關(guān)系。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，lncRNA TSIX負(fù)調(diào)控miR-548-a-3p的表達(dá)，這可能取決于直接組合，但具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。本研究中，lncRNA TSIX mimics組lncRNA TSIX 高于Huh7細(xì)胞組，miR-548-a-3p 低于Huh7細(xì)胞組(P<0.05)；lncRNA TSIX inhibitor組lncRNA TSIX 低于Huh7細(xì)胞組、lncRNA TSIX mimics組，miR-548-a-3p高于Huh7細(xì)胞組、lncRNA TSIX mimics組(P<0.05)。這說(shuō)明，lncRNA TSIX的上調(diào)過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-548-a-3p在體外對(duì)HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)促進(jìn)作用。本文數(shù)據(jù)證明，lncRNA TSIX誘導(dǎo)的HCC生長(zhǎng)抑制至少部分由負(fù)調(diào)節(jié)miR-548-a-3p介導(dǎo)。

表3 各組Huh7細(xì)胞lncRNA TSIX、miR-548-a-3p表達(dá)水平比較

綜上所述，lncRNA TSIX明顯抑制HCC細(xì)胞增殖、侵襲，促進(jìn)HCC細(xì)胞凋亡；其機(jī)制可能與lncRNA TSIX負(fù)調(diào)節(jié)miR-548-a-3p有關(guān)。