茶多酚對膿毒癥大鼠肝損傷的作用研究*

張鳳偉，桑珍珍，王淑娟，賈春梅，王 偉

（滄州市中心醫(yī)院急診醫(yī)學部，滄州 061000）

膿毒癥是感染、燒傷、創(chuàng)傷、休克等急危重患者的嚴重并發(fā)癥，患者機體難以控制的炎癥反應導致機體多個器官出現(xiàn)急性功能損傷，發(fā)展為膿毒性休克和多器官功能衰竭[1]。膿毒癥患者病情發(fā)展十分迅速，盡管目前有良好的監(jiān)護措施及診療技術，但其發(fā)病率和病死率仍較高。肝臟血運豐富，并且具有免疫、代謝、解毒等重要功能，是膿毒癥最常受累的器官之一，膿毒癥病理過程涉及炎癥、氧化應激的過度激活，釋放大量炎癥因子，導致肝損傷[2]。肝損傷可出現(xiàn)在膿毒癥的各個時期，是多器官功能衰竭和死亡的獨立危險因素，盡早發(fā)現(xiàn)和干預可以改善膿毒癥肝損傷患者的預后[3]。茶多酚（tea polyphenols，TP）是綠茶葉中酚類化合物及其衍生物的總稱，主要包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素、咖啡堿、表兒茶素及兒茶素等，是綠茶的主要活性物質(zhì)。國內(nèi)外大量研究顯示，TP在調(diào)節(jié)炎癥反應、細胞凋亡、氧化應激、抗腫瘤等方面發(fā)揮了重要作用[4-5]，亦有學者發(fā)現(xiàn)其可參與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展和調(diào)控的過程[6]。但TP 是否對膿毒癥肝損傷具有保護作用目前相關報道仍較少。因此，本研究通過探討TP 對膿毒癥大鼠肝損傷的保護作用及其作用機制，以期為膿毒癥臨床治療尋求新的方向，減少膿毒癥引起的肝功能衰竭，改善患者的預后，并且為明確TP改善肝損傷的藥理作用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 大鼠盲腸結(jié)扎穿刺法（cecum ligation and puncture，CLP）模型的建立及分組 40 只7 周齡健康雄性成年SD大鼠購自東方生物服務公司（南京）。實驗方案經(jīng)滄州市中心醫(yī)院倫理委員會批準，符合《實驗動物護理與使用指南》（IACUC-190525-12）。所有大鼠維持12 h的光/暗循環(huán)，并隨意喂食食物和水。實驗前，讓大鼠適應環(huán)境1周。將SD大鼠隨機分為4組：Sham組（術后每天300 mg/kg生理鹽水灌胃）、Sham+TP 組（CLP 術后每天300 mg/kg TP 灌胃）、CLP 組（CLP 術后每天300 mg/kg 生理鹽水灌胃）、CLP+TP 組（CLP 術后每天300 mg/kg TP 灌胃），每組10 只。采用CLP 建立膿毒癥模型[7]：異氟醚麻醉下，正中切口1.5 cm 暴露盲腸，隨后在距盲腸尖端1 cm處用5-0絲線結(jié)扎，用18號針頭穿刺盲腸，擠壓出少量糞便，然后用無菌4-0 絲線縫合切口。Sham組和Sham+TP組行剖腹手術，但不結(jié)扎、不穿孔。術后皮下注射1 mL 生理鹽水進行液體復蘇。7 d后麻醉處死大鼠，并取出肝臟組織、全血。

1.2 大鼠肝臟組織形態(tài)學檢查 大鼠肝臟組織用4%多聚甲醛固定24 h后進行切片，進行蘇木精－伊紅（HE）染色（麥克林，上海）：對切片用無水乙醇－二甲苯溶液脫蠟，洗滌后浸入蘇木精溶液中染色5～8 min 取出洗滌，浸入伊紅溶液染色3 min 取出洗滌，依次放入無水乙醇—二甲苯中5 min，使用中性樹膠封片。400 倍光學顯微鏡（Olympus，日本東京）下觀察并采集圖像，重復3次。

1.3 大鼠血清肝功能檢測 取全血3 000 r/min 離心15 min，收集上層血清待測。采用微量法活性檢測試劑盒（索萊寶，北京）檢測大鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspertate aminotransferase，AST）及谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）等肝臟功能的指標。根據(jù)試劑盒說明書操作，重復3次。

1.4 大鼠肝臟細胞凋亡測定 使用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL）試劑盒（Roche，德國）評估大鼠肝臟細胞凋亡情況。剪取少量肝臟組織，加入胰蛋白酶-EDTA 消化液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中20 min，收集上清液過濾，800 r/min離心5 min，收集底層肝臟細胞，PBS 洗滌5 組肝臟細胞后，利用4%多聚甲醛固定細胞30 min 后再次進行洗滌，隨后用含0.1%Triton X-100 的PBS 重懸細胞，冰孵2 min 后再次洗滌2 次。加入50 μL TUNEL 檢測液，37 ℃避光孵育60 min，PBS 洗滌2 次，250 μL PBS懸浮細胞，涂片后在熒光顯微鏡下觀察并進行定量分析，重復3次。

1.5 大鼠肝臟組織白細胞介素-6（IL-6）的表達

肝臟組織在10%福爾馬林溶液中置于4 ℃冰箱固定72 h。然后，對樣品進行常規(guī)處理和石蠟包埋。然后將組織切成4 μm 厚度使用IL-6 兔抗大鼠一抗（Abcam，美國，稀釋濃度1∶50）、山羊抗兔二抗（索萊寶，北京，稀釋濃度1∶200）進行免疫組化染色（Immuno histochemistry，IHC），根據(jù)SP 試劑盒（中山金橋，北京）說明書操作，顯微鏡觀察染色情況，重復3次。

1.6 大鼠肝組織IL-6和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（建成，南京）測定4 組大鼠肝組織IL-6 和TNF-α，重復3 次，參照試劑盒說明書操作。

1.7 大鼠肝臟組織氧化應激標志物檢測 檢測肝臟勻漿的上清液氧化應激標記物水平。根據(jù)生物診斷試劑盒（Dokki，埃及）說明書，對過氧化氫酶（catalase，CAT）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）進行檢測，重復3次。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TP對膿毒癥大鼠肝損傷具有保護治療作用

Sham 組大鼠肝形態(tài)正常，與Sham 組比較，Sham+TP 組肝形態(tài)無明顯改變，說明TP 對大鼠肝臟無明顯毒副作用；CLP 組大鼠肝臟出現(xiàn)大空泡，說明肝臟受到損傷；而CLP+TP 組大鼠肝臟大空泡較CLP 組明顯減少，說明TP 可改善膿毒癥大鼠肝臟組織形態(tài)學表現(xiàn)，見圖1。與Sham 組相比，Sham+TP組AST及ALT的水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；CLP 組與Sham 組相比，AST 及ALT 的水平增高（P＜0.001）；CLP+TP 組與CLP 組相比，AST及ALT的水平降低（P＜0.01），見表1。

表1 TP處理對膿毒癥大鼠血液中AST、ALT含量的影響U/L， ±s

表1 TP處理對膿毒癥大鼠血液中AST、ALT含量的影響U/L， ±s

與Sham組相比，###P＜0.001；與CLP組相比，**P＜0.01。

圖1 各組大鼠肝臟組織形態(tài)學（HE，×400）

2.2 TP可減少膿毒癥大鼠肝臟細胞凋亡 與Sham組相比，Sham+TP組TUNEL陽性細胞比例比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與Sham組相比，CLP組TUNEL陽性細胞比例增加（P＜0.001）；與CLP組相比，CLP+TP 組TUNEL 陽性細胞比例降低（P＜0.01），見圖2、表2。

表2 TP處理對膿毒癥大鼠肝臟細胞中TUNEL染色陽性細胞比例的影響%， ±s

表2 TP處理對膿毒癥大鼠肝臟細胞中TUNEL染色陽性細胞比例的影響%， ±s

與Sham組相比，###P＜0.001；與CLP組相比，**P＜0.01。

圖2 TP對膿毒癥大鼠肝臟細胞凋亡的影響（×400）

2.3 TP對膿毒癥大鼠肝臟組織中炎癥反應的影響

IL-6陽性反應呈棕色。Sham+TP組及Sham組大鼠肝臟組織中均無明顯的IL-6陽性表達；在CLP組中，可見大量IL-6陽性表達，而CLP+TP組IL-6陽性表達減少，見圖3。與Sham 組相比，Sham+TP 組IL-6及TNF-α水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與Sham組相比，CLP組IL-6及TNF-α水平增高（P＜0.001）；與CLP 組相比，CLP+TP 組IL-6 及TNF-α水平降低（P＜0.01），見表3。

表3 TP處理對膿毒癥大鼠肝臟中IL-6、TNF-α含量的影響pg/mL， ±s

表3 TP處理對膿毒癥大鼠肝臟中IL-6、TNF-α含量的影響pg/mL， ±s

與Sham組相比，##P＜0.01，###P＜0.001；與CLP組相比，**P＜0.01，***P＜0.001。

圖3 免疫組化染色觀察TP對輕膿毒癥大鼠肝臟組織中IL-6水平的影響（×400）

2.4 TP對膿毒癥大鼠肝臟組織中氧化應激反應的影響 與Sham 組相比，Sham+TP 組CAT 及SOD 水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與Sham組相比，CLP 組CAT 及SOD 水平降低（P＜0.01）；與CLP組相比，CLP+TP組CAT及SOD水平增高（P＜0.05），見表4。

表4 TP處理對膿毒癥大鼠肝臟組織中的CAT、SOD含量的影響U/mg，n=10

3 討論

近年來，膿毒癥發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)仍呈現(xiàn)明顯增高的趨勢，且死亡率居高不下[8]。肝臟是膿毒癥最常受累的靶器官之一，與預后密切相關。膿毒癥后的肝功能障礙是多器官功能障礙和膿毒癥誘發(fā)的死亡的獨立危險因素，給臨床診療帶來了較大的困擾[9-10]。膿毒癥發(fā)生時肝臟微循環(huán)血流量減少，肝竇灌注降低，肝功能降低，本研究應用CLP誘導的膿毒癥大鼠肝損傷模型，發(fā)現(xiàn)CLP組大鼠肝臟出現(xiàn)大空泡，且CLP組與Sham組相比，AST及ALT的水平增高，說明膿毒癥時大鼠的肝臟受損，并且在這一病理過程中，大鼠肝臟組織中炎癥及氧化應激存在過度激活。

TP是茶葉中非常重要的成分，作為一種天然的酚類化合物參與過氧化過程中螯合脂質(zhì)過氧化自由基，降低多酚自由基含量，阻斷自由基氧化鏈反應，從而有效清除自由基，現(xiàn)已被國內(nèi)外學者廣泛應用于過氧化引起的多種疾病治療中，如梗阻性黃疸肝損傷、急性肝損傷、酒精性肝損傷和肝癌，發(fā)揮肝保護作用[11-12]。為驗證TP對膿毒癥大鼠肝損傷是否具有保護作用，本研究通過給予CLP大鼠模型TP治療，發(fā)現(xiàn)CLP+TP 組大鼠肝臟大空泡較CLP 組減少，CLP+TP 組AST 及ALT 的水平低于CLP 組，說明TP 對膿毒癥大鼠肝損傷具有保護治療作用。肝細胞凋亡或者壞死是造成肝臟損傷和肝臟疾病最基本的中心環(huán)節(jié)，在膿毒癥肝損傷的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用[13]。本研究采用TUNEL 染色對各組大鼠肝臟細胞凋亡進行研究，結(jié)果顯示，Sham 組的大鼠采用TP 或者生理鹽水灌胃后CLP 組TUNEL陽性細胞比例高于Sham 組，而膿毒癥模型大鼠經(jīng)TP 治療后，TUNEL 陽性細胞比例降低，提示TP 可減少膿毒癥大鼠肝臟細胞凋亡。

炎癥細胞過度激活并釋放大量炎癥因子是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的重要機制之一。有研究顯示，膿毒癥能引起的肝損傷涉及炎癥反應及氧化應激的過度激活，此時體內(nèi)可產(chǎn)生大量的氧自由基，而自由基的形成及其引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應是肝損傷的主要機制之一，并且已有文獻報道炎癥因子如TNFα 直接參與肝壞死的發(fā)生，在膿毒癥肝損傷中發(fā)揮重要的作用[14-15]。而TP已被證實在多種生理及病理過程中可發(fā)揮抗炎及抗氧化的作用，不僅可減少細胞內(nèi)因氧化和自由基引起的DNA 損傷，保護組織，還可與過氧化氫自由基反應，終止脂質(zhì)過氧化反應[16-17]。本研究大鼠肝臟組織切片IHC 染色發(fā)現(xiàn)，Sham 組的大鼠肝臟組織中均無明顯IL-6 表達。Sham+TP 組、Sham 組的大鼠肝臟IL-6 及TNF-α 水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義，且CAT 及SOD 水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義，說明手術過程及灌胃處理對大鼠的炎癥因子、氧化應激因子的表達無顯著影響，而膿毒癥模型大鼠的IL-6及TNF-α水平均增高，CAT及SOD水平降低，且經(jīng)TP治療的大鼠模型的肝臟組織IL-6及TNF-α水平降低，CAT及SOD水平增高，提示TP在膿毒癥引起的肝損傷這一病理過程中可發(fā)揮其抗炎及抗氧化的作用。

綜上所述，TP可通過抑制膿毒癥引起的肝臟炎癥及氧化應激反應進而發(fā)揮其對肝臟的保護作用，并且具有一定的安全性，可為膿毒癥的臨床治療及輔助用藥提供新的思路，但對于TP改善膿毒癥引起肝損傷的具體作用機制仍然需要進一步研究。