褐邊綠刺蛾幼蟲刺毛結(jié)構及蟄傷機制初探

楊樂樂，段琛媛，李 晶，孟凡華，曹 瑛，代先東，張愛兵*，范崇旭*

(1. 軍事科學院防化研究院，北京 102205；2. 首都師范大學生命科學學院，北京 100048)

鱗翅目Lepidoptera為昆蟲綱Insecta第二大目，我國鱗翅目昆蟲物種資源豐富，鱗翅目幼蟲(俗稱：毛蟲)不僅是重要的農(nóng)林葉害蟲，同時部分鱗翅目幼蟲由于其體表分布含有毒素的體刺或剛毛而對人類健康造成影響(李朝品等, 1999; Seldeslachtsetal., 2020)。近年來，伴隨我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構的調(diào)整，經(jīng)濟林木和城市綠化林木種植面積不斷擴大，造成以該類植物為重要寄主植物的鱗翅目幼蟲與人類的接觸機會增加，人類皮膚接觸毛蟲刺毛而造成的皮炎等問題頻發(fā)，其中以刺蛾科Limacodidae幼蟲造成的過敏性皮炎最為常見(韓方岸等, 2005)。刺蛾科昆蟲是重要的植食性害蟲，在全球范圍內(nèi)廣泛分布，共有301屬，1 600余種，在我國分布的有200余種(武春生, 2010; van Nieukerkenetal., 2011; 焦萌等, 2019)。由于刺蛾科幼蟲生長周期較長(一般為6～8齡)，易受到鳥類等捕食者的攻擊。因此其演化出偽裝、警戒色、有毒刺毛等多種防御策略(Greeneyetal., 2012)。其中有毒刺毛既是刺蛾科幼蟲有力的防御武器，也可作為重要的形態(tài)分類依據(jù)。

褐邊綠刺蛾ParasaconsociaWalker是我國華北及華中地區(qū)最為常見的刺蛾科昆蟲。其幼蟲顏色鮮艷，一般呈蛞蝓型，有許多枝刺和毒毛，因此也被稱為楊剌子(王鳳等, 2006)。寄主植物以薔薇科果樹、農(nóng)作物葉子為主，是華北地區(qū)重要的經(jīng)濟林業(yè)害蟲之一。當人接觸到幼蟲枝刺和毒毛時會造成蟄傷，癥狀包括瘙癢、刺痛、丘疹、紅腫、皮炎等。雖然大多數(shù)刺蛾科幼蟲體表具有枝刺和毒毛，但不同物種在刺毛結(jié)構、著生部位以及毒素成分等方面存在一定差異(Hossler, 2009)。目前對于鱗翅目幼蟲體表形態(tài)特征的研究較少，因此本研究以褐邊綠刺蛾幼蟲為研究對象，對其體表的枝刺和毒毛形態(tài)結(jié)構進行分析，明確其毒素儲存部位。同時，對其毒素化學成分進行了研究，并對蟄傷機制進行初步探討。這一研究對于今后探究鱗翅目幼蟲的防御機制和人類社會公共健康提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 幼蟲采集

利用震布法在河北省滄州市南大港濕地自然保護區(qū)(38.35°N，117.15°E)采集褐邊綠刺蛾幼蟲約600頭，放置于凍存管中帶回實驗室進行保存。

1.2 利用掃描電鏡進行體表毒毛形態(tài)分析

挑選末齡幼蟲在體視顯微鏡下觀察其體表枝刺和毒毛形態(tài)，將體表刺毛按照表型進行初步分類。用解剖剪將幼蟲背部第三簇(由頭部向尾部方向)簇狀枝刺、側(cè)部帶有橘色末端刺團狀枝刺以及尾部帶有黑色修飾剛毛的刺團取下后，置于2.5%戊二醛固定液中常溫固定4 h。之后用0.1 mol/L PBS緩沖液漂洗3次(15 min/次)，隨后用1%鋨酸-0.1 mol/L PBS固定液再次進行固定(30 min)，然后用0.1 mol/L PBS緩沖液進行漂洗。接著依次用50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%的酒精脫水，每次15 min。再加入乙酸異戊酯置換10～20 min，隨后進行臨界點干燥。最后將處理后樣品組織用導電膠粘貼在標本臺上(觀察面朝上)，噴金后利用掃描電鏡(HITACHI U8010)進行觀察拍照。

1.3 刺毛組織切片

為進一步研究褐邊綠刺蛾幼蟲體表體刺的結(jié)構，利用組織切片技術對其結(jié)構進行研究。用解剖剪分別取下幼蟲背部整簇體刺和尾部整個剛毛團，用75%酒精進行清洗后投入到4%多聚甲醛中固定24～48 h，即可進行石蠟包埋操作。然后進行石蠟切片，并將切片利用蘇木精-伊紅染色(HE染色)法進行染色。制作完成后的切片使用全景掃描儀(3D HISTECH Pannoramic MIDI)進行拍照觀察。

1.4 幼蟲修飾剛毛和體刺粗毒素提取

為了研究褐邊綠刺蛾修飾剛毛和體刺中毒液的成分，進行了粗毒素的提取。選取200頭幼蟲進行研究，將其體表體刺和修飾剛毛取下后分別放入液氮中冷凍5 min后，轉(zhuǎn)移至研缽中進行研磨。研磨后所得粉末轉(zhuǎn)移至離心管中，加入20 mL濃度為0.1%乙酸水溶液進行超聲震蕩20 min，產(chǎn)物利用冷凍離心機在4℃下10 000 g離心10 min，收集上清液；殘渣重復上述操作2次，合并上清液并進行冷凍干燥后得到體刺和修飾剛毛的粗毒素提取物。

1.5 小鼠致痛活性實驗

本研究采用小鼠舔爪實驗模型進行致痛活性評價實驗(Yaoetal., 2019)，實驗小鼠選用23～25 g雄性C57BL/6J品系小鼠。將修飾剛毛和體刺粗毒素提取物分別配制成濃度0.1 mg/mL的溶液，采用生理鹽水作為空白對照組，500 mM辣椒素溶液作為陽性對照組。將所得的粗毒素提取物稀釋液和對照樣品分別取10 μL從足底皮下各注射3只實驗小鼠右后爪，觀察并記錄小鼠反應。

1.6 毒液化學成分分析

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)技術進行毒液化學成分分析(Sambrooketal., 1989)。使用上樣緩沖液分別將修飾剛毛提取物和體刺提取物配制成不同濃度溶液(8 mg/mL、5 mg/mL、2 mg/mL)，于沸水中加熱3 min后進行10 000 g離心，取8 μL上清液進行SDS-PAGE檢測(分離膠濃度15%)，電泳結(jié)束后使用考馬斯亮藍快速染液對凝膠進行染色并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺毛結(jié)構與形態(tài)

褐邊綠刺蛾末齡幼蟲體長約20～25 mm，體表布有40簇綠色叢狀體刺(圖1-a)，其中背部兩列各10簇；雙側(cè)各一列10簇。背部兩列靠近頭部的第3簇和靠近尾部的第2簇體型稍大，其余相差不大。每簇刺叢有20～35根體刺(圖1-b)。體刺長約2 mm，直徑100～150 μm，刺尖呈棕黑色，刺身呈綠色，刺尖與刺身之間具有明顯邊界(圖1-b)。背部兩列體刺從頭部第3簇至尾部第10簇，在外皮凸起的最頂部長有至少1枝沒有明顯尖端的棒狀體刺(圖1-c)，其遠體端呈棕黑色，有圓形開口，偶見液體分泌物排出。體側(cè)兩列體刺從頭部第3簇至尾部第10簇，在外皮凸起的頂部長有1枚

圖1 褐邊綠刺蛾幼蟲及刺毛Fig.1 Larva and urticating hairs of Parasa consocia注：a，褐邊綠刺蛾幼蟲；b，體刺；c，棒狀刺；d和e，橘黃色刺團；f，微球刺；g，黑色剛毛團；h，修飾剛毛及其底部；i，繭。Note: a, Larva; b, Spines; c, Rod-like spines; d and e, Orange hairs; f, Microspheric setae; g, Black modified setae; h, Modified seta and base of modified seta; i, Cocoon.

橘黃色橄欖狀的刺團(圖1-d, e)，刺團長徑約750 μm，短徑約380 μm，刺團表面附著一層橘黃色微球刺(圖1-f)，微球刺直徑約20 μm，表面長滿小刺，刺長15～20 μm，每個微球刺有1根主刺，刺長約25 μm。微球刺觸碰易脫落，脫落后暴露出內(nèi)部的外皮凸起。據(jù)估算每個刺團表面覆有約300個微球刺，每頭幼蟲共有16個刺團，估算約為4 800個微球刺(圖1-f)。此外，幼蟲尾部長有4團黑色剛毛(圖1-g)，這種剛毛屬于修飾剛毛，長約700 μm，直徑約30 μm，剛毛通體長有倒刺，底部有3～5個似支架的倒刺(圖1-h)，底部中心有一個小凸起與外皮相連，黑色剛毛觸碰易脫落。根據(jù)組織切片估計剛毛的密度約為300根/mm2，每團黑色剛毛半徑約1 mm，因此每頭幼蟲長有3 500～4 000根黑色剛毛。在結(jié)繭時，修飾剛毛會被留在繭表面(圖1-i)。

掃描電鏡結(jié)果顯示，褐邊綠刺蛾體表體刺由刺身和刺尖兩部分組成(圖2-a, b, c)，刺身和刺尖連接處呈環(huán)狀。開口的棒狀體刺頂端平齊，上小下大，上部開口有填充物(圖2-d)。微球刺表面均勻分布約60根刺，刺長15～20 μm不等，除此之外，微球刺長有一根主刺，主刺與球狀刺身連接處呈環(huán)狀。微球刺脫落后的蟲體部位存在明顯凸起(圖2-e, f)，該凸起應該與微球刺某個部位連接。尾部的修飾剛毛表面可見明顯倒刺，并未發(fā)現(xiàn)表面存在開口。修飾剛毛(圖2-g)是由底部中心的凸起與蟲體相連，當修飾剛毛脫落后，蟲體與其連接處出現(xiàn)明顯的小洞(圖2-h, i)。

圖2 褐邊綠刺蛾幼蟲刺毛電鏡照片F(xiàn)ig.2 Photos of urticating hairs of Parasa consocia larva by scanning electron microscope注：a，體刺及棒狀刺；b，體刺；c，體刺的尖端；d，棒狀刺；e和f，微球刺；g，黑色剛毛團；h，修飾剛毛；i，修飾剛毛的近體端與蟲體連接處。Note: a, Spines and rod-like spines; b, Spines; c, Spine tip; d, Rod-like spines; e and f, Microspheric setae; g, Black setae; h, Modified setae; i, Joint of the proximal end of modified setae and integument.

組織切片結(jié)果表明，體刺、微球刺和修飾剛毛均為中空結(jié)構(圖3-a, c, d)，且均有內(nèi)容物填充，其中體刺刺壁較厚(圖3-a, b)，約7～9 μm。修飾剛毛經(jīng)HE染色結(jié)果表明刺壁可分為內(nèi)外兩部分(圖3-d)，其中外壁染色為黑色，內(nèi)壁為黃褐色。

圖3 褐邊綠刺蛾幼蟲刺毛切片圖片F(xiàn)ig.3 Section of urticating hairs stained with hematoxylin-eosin of Parasa consocia larva注：a，體刺橫切圖；b，體刺縱切圖；c，微球刺；d，修飾剛毛橫切圖。Note: a, Cross section of spines; b, Longitudinal section of spines; c, Microspheric setae; d, Cross section of modified setae.

2.2 毒素的提取

將200頭褐邊綠刺蛾幼蟲體表的修飾剛毛與體刺中的粗毒素用0.1%醋酸水溶液進行提取，冷凍干燥后共得到體刺提取物約79 mg和修飾剛毛提取物約39 mg。

2.3 致痛活性評價

為了驗證體刺與修飾剛毛提取物是否具有致痛活性，在C57BL/6J品系小鼠的右后足底部注射10 μL體刺或修飾剛毛提取物溶液，每組進行3次平行實驗，觀察并記錄小鼠反應情況。當濃度為0.1 mg/mL時，體刺及修飾剛毛提取物溶液使小鼠表現(xiàn)出相似的癥狀，受試小鼠均很快出現(xiàn)舔爪行為，在1 h的觀察時間內(nèi)該癥狀未消失。當濃度為1 mg/mL時，體刺及修飾剛毛提取物溶液使小鼠表現(xiàn)出不同的癥狀。體刺提取物溶液僅使受試小鼠出現(xiàn)舔爪行為，頻率較上一實驗組明顯提高。修飾剛毛提取物溶液使受試小鼠在前20 min癥狀與體刺提取物類似，約20 min小鼠開始出現(xiàn)頻繁的扭體現(xiàn)象，運動活力下降，舔爪頻率降低。30 min左右小鼠口鼻開始出現(xiàn)分泌物，并逐漸增多。40 min小鼠眼部出現(xiàn)白色分泌物，并很快覆蓋眼球。在1 h觀察時間結(jié)束時，上述癥狀均未緩解。次日，小鼠基本恢復正常。

2.4 毒素成分研究

為進一步探究兩種提取物中活性成分的組成，對不同濃度的體刺和修飾剛毛提取物進行SDS-PAGE電泳分析(圖4)。結(jié)果表明兩種提取物均含有蛋白質(zhì)和多肽，體刺提取物中蛋白分子量分布更廣，且總數(shù)量多于修飾剛毛提取物。修飾剛毛提取物中蛋白分子量主要分布在25 kDa以下，但在20 kDa、14 kDa附近，以及6.5 kDa以下條帶明顯與體刺提取物有區(qū)別。

圖4 褐邊綠刺蛾幼蟲體刺和修飾剛毛提取物SDS-PAGE電泳圖Fig.4 Spines and modified setae extract of Parasa consocia larva monitored by SDS-PAGE注：第1和第8泳道，混合蛋白標準液；第2～4泳道，體刺提取物溶液(濃度分別為8，5，2 mg/mL)；第5～7泳道，修飾剛毛提取物溶液(濃度分別為8，5，2 mg/mL)。Note: Lane 1 and lane 8, Premixed protein marker; lane 2～4, Spines extract solution (concentration: 8, 5 and 2 mg/mL); lane 5～7, Modified setae extract solution (concentration: 8, 5 and 2 mg/mL).

3 結(jié)論與討論

目前對于鱗翅目成蟲的研究較多，對幼蟲的研究主要集中在種類描述階段，對于其生物學特征的研究較少(James, 2017)。國內(nèi)關于毛蟲的出版物，最全面的就是由朱弘復等編著、科學出版社出版的《蛾類幼蟲圖冊》(一)，共計述了210種毛蟲，隸屬15科(朱弘復等, 1979)。國外對于鱗翅目幼蟲的研究相對較早，英國學者Hinton對鱗翅目幼蟲剛毛的同源性進行了研究(Hinton, 1946)，日本的一色周知等和白水隆等編著了日本鱗翅目幼蟲圖鑒(一色周知等, 1977; 白水隆和原章, 1979)。

對于鱗翅目幼蟲有毒刺毛的研究，Gilmer將具有刺激性的刺毛分為毛(hair)和體刺(spine)兩類，進而又將每類分為兩個亞型(Gilmer, 1925)。Maschwitz等將所有的刺毛分為4類(Maschwitz and Kloft, 1971)，分別為：普通毛、遠端結(jié)構特殊的刺激性毛、以尖端為基部的刺激性毛以及有毒體刺。Kawamoto等對鱗翅目幼蟲體表刺毛的結(jié)構開展了研究，并對刺激性刺毛進行了初步分類(Kawamoto and Kumada, 1984)，將刺激性毛分成了兩大類11型，其中一類為針毛(spicule)7型、另一類為體刺(spine)4型。Battisti等在總結(jié)前人分類的基礎上，將刺激性刺毛大致分為三類(Battistietal., 2011)，分別為真剛毛(true seta)、修飾剛毛(modified seta)和體刺(spine)。真剛毛長度大約在100～500 μm左右，直徑3～7 μm，表面長有倒刺，尖端插在幼蟲體表的凹槽內(nèi)，極易從蟲體脫落，一般在蟲體密度可到達10 000～12 000根/mm2。修飾剛毛長度一般比真剛毛長(<1 mm)，表面長有倒刺，尖端朝外，粗的底部與蟲體相連，受到刺激后易脫落，與真剛毛相比，其密度要小得多。體刺包含多種特殊的細胞，具有分泌功能。從外形來看體刺由兩部分組成，分別是刺尖和刺身。刺身堅硬不易破裂，刺尖尖銳易破裂。體刺內(nèi)部具有中空結(jié)構，充滿分泌物。刺入皮膚后刺尖破裂，刺身中的內(nèi)容物(毒液)會流出，造成不良反應。本文在研究中采用了該分類方法。

褐邊綠刺蛾幼蟲體表4種不同形態(tài)的刺毛中2種為體刺，圖1-b是普通體刺，與其它種類毛蟲的體刺結(jié)構類似，只是尺寸上的差異；而頂端開口的棒狀體刺(圖1-d)則不多見。Kawamoto曾研究過褐邊綠刺蛾幼蟲的刺毛，但沒有提到這種結(jié)構的體刺，只描述了普通體刺，而且強調(diào)體刺沒有開口(Kawamoto, 1978)。Maschwitz在刺毛分類中提到過Megalopygeoperculari和Automerisio幼蟲長有類似的體刺，毒液可以從棒狀體刺頂端的開口處排出(Maschwitz and Kloft, 1971)。褐邊綠刺蛾的剛毛為典型的修飾剛毛，通體長有倒刺，尖部在遠體端，易脫落。另一種是微球刺(microspheric setae)，這是筆者給出的命名。Kawamoto等在分類中提到類似的刺毛，稱作星形毛(star-like hair)，將其分類為針毛5型，既沒有說明大小尺寸，也沒有給出種屬來源，無法判斷是否與本文觀察到的微球刺為相同的刺毛(Kawamoto and Kumada, 1984)。他在研究褐邊綠刺蛾時也沒有指出這種刺毛(Kawamoto, 1978)。Maschwitz在綜述中描述刺蛾科幼蟲長有這種刺毛(Maschwitz and Kloft, 1971)，由于和體刺長在一起，所以沒有單獨分類，而是放在有毒體刺中一起描述。筆者認為這種微球刺應該屬于剛毛的一種，至于它屬于真剛毛還是修飾剛毛需要進一步確定。

像褐邊綠刺蛾幼蟲長有4種結(jié)構刺毛的情況還未見文獻報道。刺蛾科幼蟲通常長有1～2種不同結(jié)構的刺毛。比如黃刺蛾Cnidocampaflavescens、扁刺蛾Thoseasinensis幼蟲只有1種體刺；多數(shù)綠刺蛾屬幼蟲長有1種體刺和1種剛毛。褐邊綠刺蛾幼蟲的4種刺毛在大小尺寸和數(shù)量上存在很大差異。體刺長度約2 mm，基部直徑150 μm，總數(shù)約1 200根，其中開口的棒狀體刺更粗壯，只有20余根；修飾剛毛長度約700 μm，直徑約30 μm，總數(shù)約4 000根；而微球刺直徑約為20 μm，總數(shù)約4 800個。推測不同的刺毛可以產(chǎn)生協(xié)同的作用。普通體刺通過刺入皮膚釋放毒液，開口的棒狀體刺只要輕微的接觸就能沾染毒液；修飾剛毛長有倒刺，內(nèi)部含有毒液，刺入皮膚產(chǎn)生機械傷害的同時還能產(chǎn)生化學傷害。修飾剛毛在脫落離開蟲體后很長一段時間仍具有傷害能力，這可以解釋為什么幼蟲在死后仍具有蟄傷能力。而且，在脫落的修飾剛毛能到達的地方都存在蟄傷的可能。幼蟲結(jié)繭時，修飾剛毛會被轉(zhuǎn)移到繭的表面起到保護作用(圖1-i)；而微球刺特別容易脫落，對于捕食者的眼睛等敏感部位能夠產(chǎn)生傷害。至于尺寸上的巨大差異，可能是用來抵御不同體型的捕食者?？傊?，褐邊綠刺蛾幼蟲4種結(jié)構的刺毛，能產(chǎn)生沾染、刺入注射、攜帶刺入三種毒液的施用模式，形成協(xié)同的傷害模式。

兩種刺毛毒素成分的初步研究表明，褐邊綠刺蛾幼蟲的體刺和修飾剛毛都含有毒素，能引起小鼠舔爪、過敏等癥狀。初步的成分分析顯示產(chǎn)生致痛作用的主要化學成分是蛋白質(zhì)和多肽，這與最近關于鱗翅目幼蟲有毒刺毛成分研究的結(jié)果是一致的(Mitpuangchonetal., 2021; Walkeretal., 2021)。兩種刺毛的化學成分和生物活性存在一定的差異，可能是因為兩種刺毛的使用方式不同，需要有不同毒素進行協(xié)同作用；也可能是因為體刺中存在上皮細胞或血淋巴，其毒液成分中可能含有一些蟲體正常代謝產(chǎn)生的蛋白質(zhì)等成分(Spadacci-Morenaetal., 2016)，這需要進一步的實驗證據(jù)。

對于刺蛾科幼蟲刺毛防御策略的了解，有助于我們應對和處理其造成的傷害。目前，對于刺蛾科幼蟲蜇傷事件通常采用的處理方法較為簡單，一般是將偏堿性的液體抹于患處，以緩解患處疼痛。這對于由修飾剛毛引起的機械性疼痛并無作用，并且反復接觸患處可能會加重修飾剛毛帶來的不良反應。對于褐邊綠刺蛾幼蟲蟄傷，首先使用膠帶將患處殘留的體刺尖端及剛毛粘下，再進行對癥治療。

本研究初步探討了褐邊綠刺蛾幼蟲的刺毛結(jié)構和蜇傷機制，對毒液中的具體活性成分還有待進一步研究，進而從分子水平闡述毒液的傷害機制。