喜樹堿對(duì)草地貪夜蛾幼蟲中腸細(xì)菌群落組成及多樣性的影響

舒本水，戴靜華，余竟成，楊仙妹，林進(jìn)添

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣州市亞熱帶果樹重大疫情控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510225)

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda屬鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae昆蟲，原產(chǎn)于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，是一種重大遷飛性害蟲(王磊等, 2019; 郭井菲等, 2019)。其食性雜，可為害包括玉米、花生、大豆、甘蔗等在內(nèi)的76科353種植物，其中玉米等禾本科植物是其嗜好寄主(Montezanoetal., 2018)。2015年以前草地貪夜蛾主要分布于美洲地區(qū)，隨后在2016年和2018年分別入侵非洲和亞洲(Wangetal., 2020; Zhouetal., 2020)。草地貪夜蛾于2018年12月至緬甸入侵我國(guó)云南，已擴(kuò)散到我國(guó)20個(gè)省(自治區(qū))，對(duì)我國(guó)糧食生產(chǎn)安全造成嚴(yán)重威脅(廖永林等, 2020)?；瘜W(xué)殺蟲劑的使用是防治草地貪夜蛾最為直接有效的方法，雙酰胺類、乙基多殺菌素、甲維鹽等藥劑對(duì)草地貪夜蛾表現(xiàn)出很好的防治效果(魯艷輝等, 2019; 趙勝園等, 2019; 吳正偉等, 2019; 鄭群等, 2019)。但由于繁殖速率快及大量的化學(xué)藥劑防治，導(dǎo)致我國(guó)草地貪夜蛾對(duì)有機(jī)磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯、雙酰胺類殺蟲劑的抗性問題已經(jīng)產(chǎn)生，主要表現(xiàn)為作用靶標(biāo)如乙酰膽堿酯酶、神經(jīng)膜鈉離子通道及魚尼丁受體等發(fā)生抗性相關(guān)的突變(梁沛等, 2020; Zhaoetal., 2020; Guanetal., 2021)。因此，探究生物源化合物對(duì)草地貪夜蛾的防治效果可為緩解草地貪夜蛾抗藥性的產(chǎn)生提供新思路。

喜樹堿(Camptothecin, CPT)屬單萜類吲哚生物堿，最初在我國(guó)特有樹種喜樹Camptothecaacuminata中分離鑒定(Leeetal., 2020)。喜樹堿通過抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I(TOPO I)活性導(dǎo)致DNA合成受阻，進(jìn)而起到抗腫瘤活性(Wangetal., 2019)。此外，研究發(fā)現(xiàn)喜樹堿對(duì)多種昆蟲表現(xiàn)出一定的殺蟲活性。例如：0.2%喜樹堿乳油對(duì)褐飛虱Nilaparvatalugens，甘藍(lán)蚜Brevicorynebrassicae及二化螟Chilosuppressalis表現(xiàn)出較高的毒殺活性(Maetal., 2010)。喜樹堿與蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensisvar.kurstaki或核型多角體病毒混用可增強(qiáng)對(duì)粉紋夜蛾Trichoplusiani及甜菜夜蛾Spodopteraexigua的毒殺及侵染活性(Sunetal., 2012)。目前喜樹堿對(duì)草地貪夜蛾相關(guān)研究較少。研究發(fā)現(xiàn)喜樹堿對(duì)草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞系Sf9具有抑制生長(zhǎng)及凋亡誘導(dǎo)作用(Huangetal., 2013; Jiangetal., 2018)。我們前期采用混有喜樹堿的人工飼料飼喂草地貪夜蛾幼蟲，結(jié)果發(fā)現(xiàn)幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育受到顯著抑制，且中腸組織結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞(Shuetal., 2021)。

昆蟲腸道微生物是宿主昆蟲的重要組成部分，在宿主昆蟲整個(gè)生命周期中具有重要作用(周帆等, 2020)。昆蟲腸道微生物不僅參與調(diào)控宿主昆蟲消化食物及交配繁殖等多種生理活動(dòng)，同時(shí)在調(diào)節(jié)宿主昆蟲的免疫系統(tǒng)抵御外界病原入侵、誘導(dǎo)宿主昆蟲產(chǎn)生抗性、加速有害物質(zhì)降解及調(diào)控宿主昆蟲的行為活動(dòng)等方面發(fā)揮著重要作用(吳曉露等, 2019; 周帆等, 2020)。當(dāng)前已有研究關(guān)注于草地貪夜蛾腸道微生物。研究發(fā)現(xiàn)變形菌門Proteobacteria和厚壁菌門Firmicutes是草地貪夜蛾腸道微生物最主要的細(xì)菌門，而擬桿菌門Bacteroidetes和放線菌門Actinobacteria比例較低(Gichuhietal., 2020)。草地貪夜蛾腸道微生物受多種因素影響。例如，草地貪夜蛾前腸和中腸微生物群落之間存在明顯差異，表明不同腸道微生物在同一宿主的定殖位置不同(Jonesetal., 2019)。草地貪夜蛾腸道微生物群落滴度與其發(fā)育階段有關(guān)，幼蟲蟲體越大腸道微生物菌群越多；同時(shí)幼蟲與成蟲之間細(xì)菌微生物多樣性同樣存在差異，部分重要的幼蟲細(xì)菌群在變態(tài)發(fā)育過程中發(fā)生丟失(Masonetal., 2020; Gichuhietal., 2020)。此外，不同寄主植物對(duì)草地貪夜蛾中腸細(xì)菌群落具有顯著影響，其中取食大豆的草地貪夜蛾幼蟲腸道細(xì)菌群落比取食玉米的幼蟲腸道菌群更多樣化(Jonesetal., 2019)。田間殺蟲劑選擇壓力下的草地貪夜蛾幼蟲腸道微生物群落比實(shí)驗(yàn)室篩選的抗性種群的幼蟲腸道微生物更豐富，同時(shí)存在多種能夠代謝殺蟲劑的腸道細(xì)菌(Gomesetal., 2020)。然而，目前關(guān)于植物次生代謝產(chǎn)物對(duì)草地貪夜蛾腸道微生物的影響少有報(bào)道。本研究采用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)分析喜樹堿處理對(duì)草地貪夜蛾幼蟲中腸細(xì)菌群落組成和多樣性的影響，為后續(xù)深入探究草地貪夜蛾腸道細(xì)菌與殺蟲劑代謝和抗性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

草地貪夜蛾實(shí)驗(yàn)室種群采自于廣東省廣州市從化區(qū)玉米種植田，于人工培養(yǎng)箱內(nèi)以人工飼料連續(xù)飼養(yǎng)15代以上。飼養(yǎng)條件如下：溫度25℃±1℃，相對(duì)濕度70%±5%，光周期12 L ∶12 D。選取4齡幼蟲作為供試?yán)ハx。

1.2 供試藥劑

喜樹堿(純度為99.79%)購(gòu)于上海藍(lán)木化工有限公司；二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司；土壤DNA提取試劑盒E.Z.N.A.?soil DNA Kit購(gòu)于美國(guó)Omega Biotek公司；膠回收試劑盒AxyPrep DNA Gel Extraction Kit購(gòu)于美國(guó)Axygen Biosciences公司；NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit購(gòu)于美國(guó)Bioo Scientific公司。

1.3 喜樹堿處理及幼蟲中腸內(nèi)容物收集

喜樹堿溶于DMSO后制備為5×103μg/mL母液。取適量母液加入人工飼料進(jìn)行混勻，然后加入瓊脂粉溶液進(jìn)行定型，最終制備成終濃度為1 mg/kg的加藥人工飼料。對(duì)照組人工飼料加入等量的DMSO。隨機(jī)選取生長(zhǎng)一致的4齡幼蟲進(jìn)行不同飼料的飼喂。飼喂3天后用75%乙醇溶液對(duì)蟲體進(jìn)行消毒，然后無菌水清洗。在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行蟲體解剖，同時(shí)用滅菌離心管收集中腸內(nèi)容物。每個(gè)處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，每20頭蟲的腸道內(nèi)容物作為一個(gè)重復(fù)。

1.4 幼蟲腸道內(nèi)容物DNA提取及PCR擴(kuò)增

采用E.Z.N.A.?soil DNA Kit，參照操作說明書提取不同處理組幼蟲腸道內(nèi)容物DNA。使用紫外超微量核酸蛋白儀NanoDrop 2000(賽默飛公司，美國(guó))檢測(cè)DNA的濃度及純度。以提取的DNA為模板進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)域PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增所采用的通用引物為338F (5′-ACTCCT ACGGGAGGCAGCAG-3′) 及806R (5′-GGACTACH VGGGTWTCTAAT-3′)。具體20 μL PCR反應(yīng)體系如下：5 ×TransStartFast Pfu buffer 4 μL，2.5 mM dNTPs 2 μL，上下游引物各 0.8 μL，TransStartFast Pfu DNA Polymerase 0.4 μL，模板DNA 10 ng，最后加ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋簾釂?dòng)95℃，3 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，27個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸10 min；最后4℃保存。PCR反應(yīng)重復(fù)3次。最后PCR產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)及AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行DNA條帶的純化回收。

1.5 Illumina測(cè)序及序列分析

將回收的PCR產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序。首先采用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫，然后將構(gòu)建的文庫于Miseq PE300/NovaSeq PE250平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序完成后，使用fastp軟件(https://github.com/OpenGene/fastp, version 0.20.0)對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH(http://www.cbcb.umd.edu/software/flash, version 1.2.7)軟件進(jìn)行拼接。使用UPARSE軟件(http://drive5.com/uparse/, version 7.1)，在97%的相似度水平對(duì)序列進(jìn)行 OTU 聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/, version 2.2)及Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫(v138)對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，設(shè)置比對(duì)閾值為70%。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列拼接組裝及OUT聚類分析

對(duì)6個(gè)草地貪夜蛾幼蟲中腸內(nèi)容物樣本進(jìn)行16S rDNA高通量測(cè)序，共獲得295 028條有效reads，且序列平均長(zhǎng)度為424.70 bp，具體各個(gè)樣本詳細(xì)測(cè)序數(shù)據(jù)見表1。在97%相似水平對(duì)reads進(jìn)行聚類分析共得到262個(gè)OUTs。進(jìn)一步對(duì)OUT注釋，結(jié)果表明草地貪夜蛾中腸細(xì)菌被分類為17個(gè)門35個(gè)綱80個(gè)目123個(gè)科191個(gè)屬246種。從對(duì)照組的草地貪夜蛾中腸內(nèi)容物樣本中共得到143 370條reads，聚類分析得到207個(gè)OUTs。進(jìn)一步注釋分析發(fā)現(xiàn)細(xì)菌被注釋到14個(gè)門31個(gè)綱70個(gè)目101個(gè)科151個(gè)屬196種。喜樹堿處理的草地貪夜蛾幼蟲中腸內(nèi)容物樣本經(jīng)測(cè)序共得到151 658個(gè) reads，聚類分析得到172個(gè)OUTs，注釋到15個(gè)門26個(gè)綱54個(gè)目85個(gè)科133個(gè)屬167個(gè)種。

表1 草地貪夜蛾幼蟲中腸內(nèi)容物16S rDNA測(cè)序原始數(shù)據(jù)

2.2 喜樹堿對(duì)草地貪夜蛾中腸細(xì)菌群落組成的影響

在草地貪夜蛾中腸內(nèi)容物細(xì)菌注釋的18個(gè)門中，厚壁菌門Firmicutes和變形菌門Proteobacteria為所有樣品中的優(yōu)勢(shì)菌群。厚壁菌門Firmicutes在所有樣品中豐度最高，對(duì)照組草地貪夜蛾中腸細(xì)菌群落中厚壁菌門Firmicutes占95.35%，而喜樹堿處理后厚壁菌門Firmicutes所占比例顯著下降，為80.54%。變形菌門Proteobacteria在對(duì)照組草地貪夜蛾中腸細(xì)菌群落中占3.83%，而喜樹堿處理后變形菌門Proteobacteria比例顯著增加，為18.34%(表2)。

表2 喜樹堿對(duì)草地貪夜蛾中腸細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)菌門的影響

從屬水平分析，腸球菌屬Enterococcus、乳桿菌屬Lactonacillus、醋菌屬Acetobacter、不動(dòng)細(xì)菌屬Acinetobacter、葡糖桿菌屬Gluconobacter、短波單胞菌屬Brevundimonas、嗜麥芽窄食單胞菌Stenotrophomonas為草地貪夜蛾中腸優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明腸球菌屬Enterococcus、乳桿菌屬Lactonacillus占各樣品微生物群落比例最高，但是喜樹堿處理后兩屬細(xì)菌之間所占整個(gè)細(xì)菌群落比例無顯著性差異。此外，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明其他屬在兩種處理之間也無顯著性差異(圖1)。

圖1 不同樣品中屬水平細(xì)菌群落熱圖Fig.1 Community heatmap analysis on genus level in different samples注：CK，對(duì)照組；CPT，喜樹堿處理組。Note: CK，control group; CPT，camptothecin treatment group. 腸球菌屬，Enterococcus；乳桿菌屬，Lactonacillus；醋菌屬，Acetobacter；不動(dòng)細(xì)菌屬，Acinetobacter；葡糖桿菌屬，Gluconobacter；短波單胞菌屬，Brevundimonas；嗜麥芽窄食單胞菌，Stenotrophomonas.

從物種水平上分析發(fā)現(xiàn)正常人工飼料飼喂的草地貪夜蛾幼蟲中腸細(xì)菌種數(shù)為196種，而喜樹堿處理后中腸細(xì)菌物種數(shù)相對(duì)減少為167種。Veen圖分析發(fā)現(xiàn)117種細(xì)菌為兩者共有的物種，而有79種細(xì)菌為正常人工飼料飼喂的草地貪夜蛾幼蟲特有物種，另外有50種細(xì)菌為喜樹堿處理后草地貪夜蛾幼蟲特有物種(圖2)。

圖2 不同處理組間細(xì)菌物種Veen圖分析Fig.2 Veen diagram analysis of bacterial species between control and CPT treatment groups注：CK，對(duì)照組；CPT，喜樹堿處理組。Note: CK，control group; CPT，camptothecin treatment group.

在對(duì)照組中豐度前10位的物種為：蒙氏腸球菌Enterococcusmundtii(72.90%)，短乳桿菌Lactobacillusbrevis(22.06%)，不動(dòng)桿菌Acinetobacter(2.12%)，寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas(0.36%)，植物乳酸桿菌Lactobacillusplantarum(0.28%)，巴氏醋桿菌Acetobacterpasteurianus(0.24%)，泡囊短波單胞菌Brevundimonasvesicularis(0.24%)，未知菌Saccharimonadaceae(0.17%)，紅平紅球菌Rhodococcuserythropolis(0.15%)，及缺陷假單胞菌Brevundimonasbullata(0.13%)。而喜樹堿處理組中蒙氏腸球菌E.mundtii豐度明顯下降，僅占26.80%；而短乳桿菌L.brevis(36.08%)，巴氏醋桿菌A.pasteurianus(22.03%)，不動(dòng)桿菌Acinetobacter(6.90%)，弗拉脫氏葡糖桿菌Gluconobacterfrateurii(1.48%)，寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas(1.03%)，泡囊短波單胞菌B.vesicularis(0.77%)，未知菌Saccharimonadaceae(0.55%)，缺陷假單胞菌B.bullata(0.44%)，紅平紅球菌R.erythropolis(0.38%)豐度明顯升高(圖3)。上述結(jié)果表明喜樹堿顯著改變草地貪夜蛾幼蟲中腸細(xì)菌群落組成。

圖3 喜樹堿處理后草地貪夜蛾幼蟲腸道細(xì)菌主要物種豐度比例變化Fig.3 Proportions of the main bacteria species in the midgut of Spodoptera frugiperda fed on different diets注：CK，對(duì)照組；CPT，喜樹堿處理組。Note: CK，Control group; CPT，Camptothecin treatment group.

2.3 喜樹堿對(duì)草地貪夜蛾幼蟲腸道細(xì)菌多樣性分析

2.3.1Alpha多樣性分析

草地貪夜蛾中腸細(xì)菌組成Alpha多樣性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)喜樹堿處理組Shannon指數(shù)顯著高于對(duì)照組，表明喜樹堿處理組草地貪夜蛾幼蟲中腸細(xì)菌群落多樣性高于對(duì)照組。此外，喜樹堿處理組Simpson指數(shù)顯著低于對(duì)照組，表明喜樹堿改變了幼蟲中腸優(yōu)勢(shì)菌種的集中程度。同時(shí)喜樹堿處理組ACE和Chao指數(shù)均低于對(duì)照組，但差異不顯著，表明喜樹堿處理組幼蟲中腸群落豐富度略低于對(duì)照組(表3)。

表3 喜樹堿對(duì)草地貪夜蛾幼蟲腸道細(xì)菌α多樣性指數(shù)的影響

2.3.2Beta多樣性分析

采用Hierarchical clustering算法對(duì)6個(gè)樣品進(jìn)行門水平層級(jí)聚類分析，結(jié)果表明CK1、CK2及CK3聚在一支，而喜樹堿處理組樣品CPT1、CPT2及CPT3也成功聚在另一支(圖4-A)。上述結(jié)果表明喜樹堿處理改變了草地貪夜蛾中腸細(xì)菌群落，從而導(dǎo)致兩組樣品聚類在不同的分支。PCA分析結(jié)果與表明CK1、CK2及CK3中細(xì)菌群落聚在一起，說明對(duì)照組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)之間細(xì)菌群落一致性較高。而喜樹堿處理組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)與對(duì)照組完全分開，且相對(duì)較為分散(圖4-B)。上述說明喜樹堿處理組細(xì)菌群落多樣性與對(duì)照組之間存在差異，同時(shí)喜樹堿處理組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)之間也可能存在一定的細(xì)菌群落差異性。PCoA分析結(jié)果與層級(jí)聚類和PCA分析結(jié)果一致(圖4-C)。上述結(jié)果表明喜樹堿處理后草地貪夜蛾幼蟲中腸細(xì)菌群落組成與對(duì)照組相比存在顯著差異。

圖4 草地貪夜蛾幼蟲中腸細(xì)菌群落Beta多樣性分析Fig.4 Beta diversity analysis of the midgut bacterial community of Spodoptera frugiperda larvae注：A，門水平層次聚類分析; B，所有樣品OUT水平PCA分析; C，所有樣品OTU水平PCoA分析。CK，對(duì)照組；CPT，喜樹堿處理組。Note: A，Hierarchical clustering tree on Phylum level; B，Result of PCA analysis on OTU level in all the samples; C，Result of PCA analysis on OTU level in all the samples. CK，Control group; CPT，Camptothecin treatment group.

3 結(jié)論與討論

昆蟲的腸道微生物在昆蟲整個(gè)生命歷期的多種生命過程中具有重要的調(diào)控作用。作為一種高雜食性和重要糧食作物害蟲，草地貪夜蛾腸道微生物也越來越受關(guān)注。本研究采用16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)草地貪夜蛾幼蟲中腸細(xì)菌群落組成進(jìn)行了分析，通過聚類分析得到262個(gè)OTUs，注釋到17個(gè)門35個(gè)綱80個(gè)目123個(gè)科191個(gè)屬246種細(xì)菌。而前期Gichuhi等(2020)通過16S rDNA高通量測(cè)序?qū)⒃夹蛄芯垲惖玫? 796個(gè)OTUs，遠(yuǎn)超本研究得到的OUT數(shù)量。造成OUT數(shù)量差距的原因可能與草地貪夜蛾取食的材料不同有關(guān)。本研究采用的是人工飼料飼喂的草地貪夜蛾，而Gichuhi等則是取食大田玉米的草地貪夜蛾。本研究進(jìn)一步證實(shí)取食的材料是影響昆蟲腸道微生物組成的重要因素。通過對(duì)細(xì)菌群落組成進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)厚壁菌門Firmicutes和變形菌門Proteobacteria為草地貪夜蛾中腸細(xì)菌群落中的主要優(yōu)勢(shì)菌門，與Gichuhi等(2020)分析結(jié)果一致。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)甜菜夜蛾Spodopteraexigua，落葉松毛蟲Dendrolimussuperans以及舞毒蛾Lymantriadispar中的優(yōu)勢(shì)菌門同樣為厚壁菌門Firmicutes和變形菌門Proteobacteria，推測(cè)兩個(gè)門的細(xì)菌在夜蛾科昆蟲腸道中發(fā)揮重要作用(Gaoetal., 2019; Zengetal., 2020a)。此外也有研究報(bào)道草地貪夜蛾腸道微生物中放線菌門Actinobacteria和未培養(yǎng)菌門Uncultured bacteria為優(yōu)勢(shì)菌門，兩個(gè)門在腸道微生物中所占比例分別為37.41%和19.80%，而厚壁菌門Firmicutes和變形菌門Proteobacteria僅占1.68%和0.23%(Rozadillaetal., 2020)。推測(cè)產(chǎn)生這種差異的原因可能有兩個(gè)：一是采集的草地貪夜蛾地理位置存在差異；二是測(cè)序方法不一致。本研究采用16S rDNA測(cè)序，而Rozadilla等(2020)則采用的是宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)植物防御物質(zhì)和農(nóng)藥不僅調(diào)控鱗翅目昆蟲腸道形態(tài)和消化酶活性，而且對(duì)昆蟲腸道微生物也有一定的調(diào)控作用(Zengetal., 2020a)。例如，采用尼古丁或?yàn)躅^堿處理后的落葉松Larixgmelinii和旱柳Salixmatsudana后分別飼喂落葉松毛蟲D.superans以及舞毒蛾L.dispar幼蟲，結(jié)果表明尼古丁或?yàn)躅^堿顯著影響兩種昆蟲幼蟲腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群及豐度(Zengetal., 2020a)。此外，辛硫磷處理的桑葉飼喂家蠶Bombyxmori幼蟲不同時(shí)間，家蠶體重在72 h后顯著降低，同時(shí)幼蟲腸道細(xì)菌群落組成及結(jié)構(gòu)均發(fā)生顯著改變。其中辛硫磷處理組甲基桿菌屬和金黃色葡萄球菌屬比對(duì)照組顯著降低，而一些非優(yōu)勢(shì)菌屬葡萄狀球菌顯著增加(Lietal., 2020)。使用阿維菌素噴霧法處理舞毒蛾幼蟲，24 h后收集腸道內(nèi)容物并測(cè)序。結(jié)果表明阿維菌素顯著改變舞毒蛾幼蟲腸道細(xì)菌群落組成及多樣性，表現(xiàn)為61.11%的腸道細(xì)菌豐度在阿維菌素處理組和對(duì)照組之間表現(xiàn)出顯著差異，且9個(gè)分別存在于阿維菌素處理組和對(duì)照組的細(xì)菌屬導(dǎo)致幼蟲腸道多樣性發(fā)生改變(Zengetal., 2020b)。作為一種植物源化合物，低濃度喜樹堿對(duì)草地貪夜蛾具有顯著的生長(zhǎng)抑制作用(Shuetal., 2021)。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中可通過喜樹堿與其它化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行混配，增強(qiáng)化學(xué)藥劑的防治效果及延緩草地貪夜蛾抗藥性的發(fā)生與發(fā)展，具體的方案需要進(jìn)一步研究。本研究采用混藥法將喜樹堿混合于草地貪夜蛾人工飼料并飼喂幼蟲，收集腸道內(nèi)容物進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。結(jié)果表明喜樹堿顯著改變草地貪夜蛾幼蟲細(xì)菌群落組成和多樣性。與對(duì)照組相比，喜樹堿處理組厚壁菌門Firmicutes豐度顯著降低，而變形菌門Proteobacteria顯著升高。此外，種水平研究發(fā)現(xiàn)主要的細(xì)菌物種豐度受喜樹堿影響較大。同時(shí)Alpha和Beta多樣性分析結(jié)果表明喜樹堿處理后顯著改變草地貪夜蛾幼蟲中腸細(xì)菌群落多樣性。有研究表明植物防御物質(zhì)通過與草地貪夜蛾腸道微生物相互作用改變腸道圍食膜(peritrophic matrix，PM)的功能(Masonetal., 2019)。結(jié)合喜樹堿處理抑制草地貪夜蛾幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育及改變腸道結(jié)構(gòu)等結(jié)果，推測(cè)喜樹堿同樣可能通過改變草地貪夜蛾幼蟲中腸細(xì)菌群落來改變中腸結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收造成不利影響，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

本研究通過16S rDNA測(cè)序?qū)Σ莸刎澮苟暧紫x中腸內(nèi)容物細(xì)菌群落進(jìn)行分析。同時(shí)采用多種方法分析了喜樹堿處理對(duì)草地貪夜蛾幼蟲中腸細(xì)菌群落的組成和多樣性的影響。本研究為進(jìn)一步豐富草地貪夜蛾幼蟲腸道微生物群落數(shù)據(jù)信息及探究喜樹堿對(duì)草地貪夜蛾的作用機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。