負載替米沙坦PLGA納米粒的制備與膜滲透性評價

高洋洋，朱麗丹

大連市第三人民醫(yī)院藥劑部，大連 116033

替米沙坦(telmisartan，TMS)是一種新型的降血壓藥物，能選擇性阻斷血管平滑肌和腎上腺中的血管緊張素Ⅱ與其受體亞型AT1的結合，從而抑制血管收縮和阻斷醛固酮的分泌，起到降低血壓的作用[1]。臨床研究表明，TMS降低血壓的效果良好，不良反應較少，對靶器官具有保護作用，可降低患者的發(fā)病率和死亡率，已得到廣泛應用[2]。TMS是生物制藥分類系統(tǒng)(biopharmaceutics classification system, BCS)Ⅱ類藥物，具有低溶解度和高滲透性，其在水中的溶解度僅為0.0035 mg·mL-1，口服生物利用度較低，僅為42%[3]。本研究以聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid, PLGA)作為納米粒的載體材料，將替米沙坦制備成PLGA納米粒，并通過實驗評價了其體外細胞滲透性，為替米沙坦口服新型給藥系統(tǒng)的研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-60Tvp型高效液相色譜儀(無錫創(chuàng)想分析儀器有限公司)；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州科泰實驗設備有限公司)；RE-52AA型上海亞榮旋轉蒸發(fā)器(上海儀天科學儀器有限公司)；Malvern Zetasizer Nano ZS90納米粒徑電位分析儀(英國Malvern公司)；JEM-F200 場發(fā)射透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)；Transwell板(24孔，濾膜孔徑8.0 μm，北京諾博萊德科技有限公司)；96孔板(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 試藥

替米沙坦原料藥(質量分數(shù)99.3%，批號20200416，常州亞邦制藥有限公司)；替米沙坦對照品(質量分數(shù)100%，批號100629-201803，中國食品藥品檢定研究院)；聚乳酸-羥基乙酸共聚物(50∶50, 相對分子質量為10 000～20 000，上海源葉生物科技有限公司)；泊洛沙姆188(Poloxamer 188，南京威爾藥業(yè)集團股份有限公司)；二氯甲烷(南京化學試劑股份有限公司)；DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)溶液、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和Hank平衡鹽溶液(Hank’s buffered salt solution，HBSS)、二甲基亞砜、四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)均購自賽默飛世爾科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 TMS-loaded PLGA NPs的制備

采用溶劑蒸發(fā)法[4-5]制備TMS-loaded PLGA NPs。制備工藝：稱取處方量的PLGA和替米沙坦溶解到二氯甲烷5 mL中；另稱取處方量的泊洛沙姆188溶解到50 mL純化水中；在磁力攪拌速度為3 000 r·min-1的條件下，將溶解藥物的二氯甲烷溶液以0.5 mL·min-1的速度滴加到泊洛沙姆188溶液中，并持續(xù)攪拌30 min，得到乳白色混懸液；將該混懸液通過旋轉蒸發(fā)除去有機溶劑，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾并離心處理，去除上清液，收集沉淀物重新分散到質量濃度為100 mg·mL-1的甘露醇溶液中，攪拌均勻，分裝至10 mL西林瓶中，冷凍干燥，即得到TMS-loaded PLGA NPs凍干粉。

2.2 TMS-loaded PLGA NPs處方的優(yōu)化

2.2.1實驗設計 根據(jù)預實驗結果，選擇影響TMS-loaded PLGA NPs包封率和粒徑分布的3個處方因素：以有機相中替米沙坦的質量濃度(x1)、有機相中PLGA的質量濃度(x2)和水相中Poloxamer 188的質量濃度(x3)作為考察對象，通過3因素3水平析因實驗設計[6]對其處方進行評價。3個處方因素的低、中、高水平值見表1。進行了27組實驗，結果見表2。

表1 3因素3水平析因設計中的變量水平

表2 3因素3水平析因設計的結果

2.2.2方差分析與評估 將表2中的實驗數(shù)據(jù)輸入到實驗設計軟件中，結果見表3、表4。方程模型的P值均小于0.05，說明模型擬合度較好；替米沙坦質量濃度(x1)、PLGA質量濃度(x2)和Poloxamer 188質量濃度(x3)對TMS-loaded PLGA NPs的包封率(y1)和粒徑分布(y2)均具有顯著影響(P<0.05)。通過軟件生成的效應面圖可直觀地分析替米沙坦質量濃度(x1)、PLGA質量濃度(x2)和Poloxamer 188質量濃度(x3)與TMS-loaded PLGA NPs的包封率(y1)和粒徑分布(y2)之間的關系。見圖1、圖2。

表3 x1、x2和x3對包封率(y1)影響的方差分析結果

表4 x1、x2和x3對粒徑分布(y2)影響的方差分析結果

圖1 替米沙坦質量濃度(x1)、PLGA質量濃度(x2)和Poloxamer 188質量濃度(x3)對TMS-loaded PLGA NPs包封率(y1)影響的效應面圖

在27次實驗中，制備的TMS-loaded PLGA NPs的包封率為21.4%～95.3%。由圖1可見，包封率隨著藥物質量濃度和PLGA質量濃度的增加而增大，這是由于PLGA質量濃度增加可以包載更多的藥物，提高了包封率；包封率隨著Poloxamer 188質量濃度的增加而降低，這是由于在外部水相中較高質量濃度的表面活性劑會溶解更多的藥物，不利于藥物包載。擬合得到的多元二次方程為y1=66.56+22.76x1+7.16x2-7.55x3-7.00x1x2-0.72x1x3-0.96x2x3(R2=0.913 2)。

同樣，在27次實驗中，制備的TMS-loaded PLGA NPs的粒徑分布在126.4～237.1 nm范圍內。由圖2可知，粒徑大小隨著藥物質量濃度、PLGA質量濃度和Poloxamer 188質量濃度的增加而增大。擬合得到的多元二次方程為：y2=169.59+30.17x1+20.03x2+8.51x3+8.24x1x2+3.06x1x3+0.18x2x3(R2=0.908 7)。

圖2 替米沙坦質量濃度(x1)、PLGA質量濃度(x2)和Poloxamer 188質量濃度(x3)對TMS-loaded PLGA NPs粒徑分布(y2)影響的效應面圖

2.2.3處方優(yōu)化與驗證 本研究的目的是使TMS-loaded PLGA NPs的包封率為最大值，粒徑分布為最小值，通過實驗軟件獲得TMS-loaded PLGA NPs的最優(yōu)處方：替米沙坦的質量濃度為14.0 mg·mL-1，PLGA的質量濃度為35.0 mg·mL-1，Poloxamer 188的質量濃度為5.0 mg·mL-1。預測可得到包封率為91.4%、粒徑分布為166.3 nm的TMS-loaded PLGA NPs。按該處方制備3批TMS-loaded PLGA NPs進行驗證，其粒徑分布為(159.6±18.3) nm，包封率為92.1%±1.6%，實驗值與預測值一致，說明建立的實驗模型預測準確性較好。

2.3 表征

取TMS-loaded PLGA NPs凍干粉，加入蒸餾水輕輕振搖，粉末完全溶解后形成淡藍色澄清溶液。取少量樣品溶液，加蒸餾水稀釋，通過Malvern Zetasizer Nano ZS90納米粒徑電位分析儀測定TMS-loaded PLGA NPs的粒徑分布和Zeta電位，每份樣品檢測3次，取平均值；另取1滴TMS-loaded PLGA NPs溶液滴加到300目碳涂層的銅網(wǎng)上，使用質量濃度為5.0 mg·mL-1的磷鎢酸染色30 s，于紅外燈下?lián)]干水分，在透射電鏡下觀察樣品的微觀形態(tài)。見圖3。

經(jīng)測定TMS-loaded PLGA NPs的平均粒徑為(162.1±20.7) nm，PDI為0.162±0.002，Zeta電位為(-2.92±0.01) mV。由圖3可見，TMS-loaded PLGA NPs呈圓整球狀，無聚集，分散性良好，粒徑為50～200 nm，該粒徑范圍具有最佳的細胞攝取特性，可通過內吞作用被腸細胞吸收[7]。

圖3 TMS-loaded PLGA NPs的透射電鏡照片

2.4 體外藥物釋放

采用透析法比較TMS乙醇溶液與TMS-loaded PLGA NPs的藥物釋放行為[8-9]。操作方法：取TMS-loaded PLGA NPs凍干粉加入蒸餾水中復溶，取TMS-loaded PLGA NP溶液2 mL和含量相同的TMS乙醇溶液分別加入處理好的透析袋中，兩端夾緊，分別放入體積為200 mL的pH 6.8磷酸鹽緩沖液(含體積分數(shù)為0.5%的吐溫80)中，溫度為37 ℃，磁力攪拌速度為100 r·min-1，在固定的時間(0、5、1、2、4、6、8、10、12、24 h)取出介質溶液(并加入等體積的新鮮釋放介質)，過0.45 μm微孔濾膜，取過濾液稀釋適當倍數(shù)后進樣檢測藥物含量，繪制釋放曲線。見圖4。

圖4 TMS乙醇溶液與TMS-loaded PLGA NPs的體外藥物釋放曲線 (n=6)

由圖4可見，TMS乙醇溶液中的藥物釋放較快，在2 h內藥物基本釋放完全；而TMS-loaded PLGA NPs中的藥物表現(xiàn)為持續(xù)、緩慢釋放，最終在24 h時藥物累積釋放量達到了87.1%±3.6%。

2.5 細胞毒性評估

使用MTT測定法評估TMS原料藥和TMS-loaded PLGA NPs對Caco-2細胞的體外細胞毒性[10]。取復蘇的Caco-2細胞接種到DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)14 d，采用質量濃度為2.5 mg·mL-1的胰蛋白酶-EDTA溶液消解、離心，取Caco-2細胞按照1.0×104個/孔的密度接種到96孔板中，培養(yǎng)48 h。向96孔板中分別加入二甲基亞砜溶液(作為空白對照)、TMS二甲基亞砜溶液、TMS-loaded PLGA NPs，使藥物的質量濃度達到10、40、80、150、200 μg·mL-1，培養(yǎng)48 h，除去培養(yǎng)基，每孔加入MTT溶液和培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h，除去培養(yǎng)基，加入DMSO溶解甲臜沉淀，在490 nm波長處測定各孔的吸光度值，并根據(jù)吸光度值計算細胞存活率。結果見圖5。

圖5 TMS原料藥和TMS-loaded PLGA NPs對Caco-2細胞毒性的比較

由圖5可見，在研究的藥物質量濃度范圍內，TMS原料藥和TMS-loaded PLGA NPs對Caco-2細胞均無明顯抑制作用，說明TMS-loaded PLGA NPs與Caco-2細胞具有良好的生物相容性。

2.6 Caco-2細胞轉運研究

由于Caco-2細胞在形態(tài)上與人小腸上皮細胞相似，并含有與小腸刷狀緣上皮細胞相關的酶[11]，故用Caco-2細胞單層模型評價TMS-loaded PLGA NPs的吸收和外排特性。取復蘇的Caco-2細胞接種于DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)14 d，采用質量濃度為2.5 mg·mL-1的胰蛋白酶-EDTA溶液消解、離心，按照1.0×104個/cm2的密度為將Caco-2細胞接種到Transwell板上，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)21 d，細胞發(fā)育良好，經(jīng)檢測，跨上皮電阻(trans epithelial electric resistance，TEER)值均大于600 Ω·cm-2，可確保Caco-2細胞單層的完整性。實驗開始前使用預熱(37 ℃)的空白HBSS洗滌Caco-2細胞單層3次。在研究頂端到基底外側(AP→BL)的轉運中，分別取TMS二甲基亞砜溶液和TMS-loaded PLGA NPs溶液各0.5 mL添加到AP表面，作為供給池，并將HBSS 1.5 mL添加到BL表面，作為接收池；在研究基底外側到頂端(BL→AP)的轉運中，分別取TMS二甲基亞砜溶液和TMS-loaded PLGA NPs溶液各1.5 mL添加到BL表面，作為供給池，將HBSS 0.5 mL添加到AP表面，作為接收池，在固定的時間間隔從接收池中取出200 μL樣品溶液，離心后用HPLC法測定藥物含量，按照下列公式計算表觀滲透系數(shù)(apparent permeability coefficient,Papp)和外排比(external ratio，ER)。

Papp=dQ/dt×1/A×1/C0

ER=Papp(BL→AP)/Papp(AP→BL)

其中dQ/dt表示藥物轉運率，A表示轉運膜的表面積，C0表示供給池中的藥物初始質量濃度，Papp(AP→BL)表示TMS從頂端轉運到基底外側的Papp值，Papp(BL→AP)表示TMS從基底外側轉運到頂端的Papp值。

研究結果顯示，TMS-loaded PLGA NPs組的Papp(AP→BL)值為[(9.64±0.42)×10-6] cm·s-1，高于TMS原料藥組的Papp(AP→BL)值[(5.21±0.39)×10-6] cm·s-1；而TMS-loaded PLGA NPs組和TMS原料藥組的Papp(BL-AP)值無明顯差異，其值分別為[(6.32±0.29)×10-6]和[(6.18±0.34)×10-6] cm·s-1；TMS原料藥組的ER值為1.19，TMS-loaded PLGA NPs組的ER值為0.66，說明TMS-loaded PLGA NPs能夠有效提高藥物的滲透性。

3 討論

為提高TMS的溶解度，提高其口服生物利用度，研究人員已將其制備成包括自乳化藥物遞送(self-emulsifying drug delivery system，SEDDS)[12]、固體分散體[13]、環(huán)糊精包合物[14]、納米粒[15]及共晶物[16]等多種新型給藥系統(tǒng)。PLGA是一種可生物降解的高分子材料，在體內PLGA的酯鍵水解生成乳酸和羥基乙酸，并進一步代謝為二氧化碳和水[17]，目前其作為傷口縫合材料和藥用輔料已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準使用。以PLGA作為納米粒載體材料制備的納米粒不僅可以增大藥物的溶解度，而且經(jīng)口服后可被腸道集合淋巴結的M細胞吸收[18]，能夠逃避P-糖蛋白的識別作用[19]，促進藥物吸收。因此，本研究以PLGA作為納米粒的載體材料，將替米沙坦制備成PLGA納米粒。實驗結果顯示，制備的TMS-loaded PLGA NPs粒徑分布為(159.6±18.3)nm，包封率為92.1%±1.6%，呈圓整球狀；體外藥物釋放研究結果顯示，TMS-loaded PLGA NPs中的藥物呈現(xiàn)持續(xù)緩慢釋放；體外滲透性研究結果顯示，TMS-loaded PLGA NPs能夠有效提高藥物的滲透性。本研究為后續(xù)的動物體內藥動學評價奠定了實驗基礎。