基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討麻杏石甘湯治療急性肺損傷的機(jī)制

程 賽，陳 偉，吳鋼偉，張淑玫，張 旗*

1. 福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)系，福州 350122；2. 福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析系，福州 350122；3. 福建省立醫(yī)院藥學(xué)部，福州 350001

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是指由除心源性以外的各種肺內(nèi)、外致病因素(SARS、SARS-CoV-2等)所導(dǎo)致的嚴(yán)重的急性呼吸道疾病，如果醫(yī)治不及時(shí)易發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。ALI與ARDS是連續(xù)的病理生理過程，二者在臨床中常表述為ALI/ARDS。即使在創(chuàng)傷復(fù)蘇技術(shù)快速發(fā)展的今天，ALI/ARDS的死亡率仍在 40%～46%[1-2]。

麻杏石甘湯(MXSGD)是由麻黃、杏仁、石膏和甘草4種中藥組成，具有發(fā)汗宣肺、清肺平喘之功效[3]，臨床主要用于治療病毒性肺炎、上呼吸道感染、小兒肺炎、支氣管哮喘和放射性肺損傷等。麻杏石甘湯被普遍用于病毒感染后的重型疫毒閉肺證即ALI/ARDS階段的治療。由于其作用機(jī)制尚未清晰，故本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析，對(duì)麻杏石甘湯的有效成分、作用靶點(diǎn)和急性肺損傷的靶點(diǎn)和信號(hào)通路進(jìn)行預(yù)測，為針對(duì)其后續(xù)的研究提供參考[4-5]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Sigma3-18k型高速低溫離心機(jī)(德國Sigma公司)；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)；SpectraMax M3 Plus酶標(biāo)儀(美國MD公司)；DM2500顯微鏡(德國Leica公司)；AlphaImager EP凝膠成像系統(tǒng)(美國ProteinSimple公司)。

1.2 試藥

麻黃、杏仁、石膏和甘草均購自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院；脂多糖(lipopolysacchatide，LPS)(大腸桿菌 055：B5)(批號(hào)0000081275，美國Sigma-Aldrich公司)； PI3Kp85α抗體(批號(hào)ab191606，Abcam公司)；AKT的抗體(批號(hào)4691，Cell Signaling Technology 公司)；β-actin抗體(批號(hào)GR208234-1，DGCS-BIO公司)；二抗(批號(hào)7074p2，Cell Signaling Technology公司)，稀釋使用(1∶5 000)；取麻黃9 g、杏仁9 g、石膏18 g、甘草6 g，用10倍水回流提取3次，濃縮，制備麻杏石甘湯灌胃液(質(zhì)量濃度 1 g·mL-1)。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠，雄性，體質(zhì)量為180～200 g，合格證號(hào)SCK(京)2016-0011，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求已獲得福建醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)2018097)。

2 方法

2.1 篩選麻杏石甘湯的有效成分和作用靶點(diǎn)

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)中檢索麻杏石甘湯中麻黃、杏仁、石膏和甘草的成分及靶點(diǎn)。雖然未檢索到石膏的有效成分，但通過文獻(xiàn)及相關(guān)資料確定了石膏的成分及作用靶點(diǎn)。將作用靶點(diǎn)的蛋白名稱在Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/uploadlists/)中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，獲得基因名。

2.2 構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

用Cytoscape 3.70(http://www.cytoscape.org/)繪制活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

2.3 急性肺損傷靶點(diǎn)的預(yù)測和核心靶點(diǎn)的篩選

用數(shù)據(jù)庫GeneCards(https://www.genecards.org/)檢索“Acute Lung Injury”，得到ALI的靶點(diǎn)。在韋恩圖中將藥物與疾病的共有部分篩選出來得到核心靶點(diǎn)。

2.4 構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

取交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins,https://string-db.org/)，物種選擇“Homo sapiens”，將文件保存為TSV格式，在Cytoscape 3.7.0中構(gòu)建蛋白與蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖。

2.5 核心靶點(diǎn)通路分析

在DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov)中按照物種為“Human”(P<0.01)的要求將核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG通路分析，預(yù)測麻杏石甘湯治療急性肺損傷的可能機(jī)制[6-7]。

2.6 大鼠ALI模型的建立與藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)課題組前期摸索的模型，將SD大鼠40只，隨機(jī)分成4組，每組10只，分別為對(duì)照組、模型組、麻杏石甘湯高劑量(MXSGD，7.6 g·kg-1)、低劑量(MXSGD, 1.9 g·kg-1)組，灌胃給藥7 d后，除對(duì)照組外，各組大鼠分別進(jìn)行造模，即氣管滴注LPS(5 mg· kg-1)溶液。造模12 h后，麻醉，腹主動(dòng)脈取血。用PBS進(jìn)行左肺灌洗，收集肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)。檢測PMN、肺濕干比值、蛋白濃度，并觀察肺組織的病理變化，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析得到麻杏石甘湯的藥效值。

2.7 Western blot驗(yàn)證

采用Western blot檢測各組大鼠肺部組織差異蛋白的表達(dá)水平，分析麻杏石膏湯藥效成分治療大鼠ALI的具體分子機(jī)制。步驟：將 2.6項(xiàng)下取得的肺組織樣本在液氮中進(jìn)行研磨，通過二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法獲得蛋白的量，取總蛋白30 μg上樣。進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜1.5 h，封閉處理1 h，根據(jù)說明書加入相應(yīng)的抗體PI3K、AKT、β-actin(1∶2 000)，孵育過夜，加入二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h，顯影，應(yīng)用Image Lab軟件分析一抗蛋白的灰度值，以內(nèi)參β-actin蛋白的表達(dá)量為基準(zhǔn)，計(jì)算各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。采用Graph Pad Prism 6.0 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

3 結(jié)果

3.1 藥物的活性成分與作用靶點(diǎn)

通過TCMSP篩選出麻杏石甘湯的主要活性成分756種，其中包含麻黃363種、杏仁113種、甘草280種。在TCMSP中無法檢索出石膏的活性成分，通過文獻(xiàn)查閱得到石膏的活性成分主要為CaSO4·2H2O。以O(shè)B值大于30%、LD值大于0.18為標(biāo)準(zhǔn)篩選得到活性成分135種，加上石膏的活性成分，共136種。其中麻黃23種、杏仁19種、甘草92種、石膏1種。結(jié)果見表1。將活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)篩選出來，得到1 738個(gè)靶點(diǎn)，去掉重復(fù)值后得到1 444個(gè)靶點(diǎn)。

表1 麻杏石甘湯中活性化合物的信息

表1(續(xù)) MXSGD中活性化合物的信息

3.2 構(gòu)建藥物-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

應(yīng)用Cytoscape 3.7.0構(gòu)建藥物-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖1，紅色表示藥物，紫色表示麻黃的有效成分，粉色表示杏仁的有效成分，綠色表示甘草的有效成分，藍(lán)色表示石膏的有效成分，黃色表示共有的藥物和有效成分，橙色表示靶點(diǎn)基因。網(wǎng)絡(luò)圖中顯示有345個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 572條邊，可以得出一個(gè)成分對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)，一個(gè)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)多種成分。

3.3 疾病靶點(diǎn)的預(yù)測與核心靶點(diǎn)的篩選

從GeneCard數(shù)據(jù)庫中篩選出1 701個(gè)ALI的靶點(diǎn)，將藥物與疾病的靶點(diǎn)信息導(dǎo)入韋恩圖中取交集，獲得靶點(diǎn)136個(gè)。

3.4 蛋白相互作用及其PPI網(wǎng)絡(luò)圖

將136個(gè)核心靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫中，得到蛋白之間的相互作用，將其以TSV格式保存，在Cytoscape 3.7.0中構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖2。圖中有135個(gè)節(jié)點(diǎn)、2 836條邊，節(jié)點(diǎn)表示蛋白，度值表示節(jié)點(diǎn)連接邊的條數(shù)。節(jié)點(diǎn)度值的平均值為42.014 81，大于平均值的節(jié)點(diǎn)有43個(gè)，其中AKT1、TP53、IL6、VEGFA、TNF、MAPK3、JUN、CASP3、EGF、EGFR、MAPK8、MAPK1、STAT3、MYC、PTGS2、MMP9、ESR1、CCND1和CXCLB的度值較大，AKT1為核心靶點(diǎn)。

圖1 麻杏石甘湯藥物-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 麻杏石甘湯治療ALI的核心靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

3.5 GO分類富集分析與KEGG通路分析

將交集靶點(diǎn)在DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO富集分析，得到P<0.01的條目315條，將排名前20的GO富集條目在微生信網(wǎng)站進(jìn)行可視化，結(jié)果見圖3，其中

圖3 GO生物過程富集分析(前20位)

有對(duì)RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、對(duì)藥物的反應(yīng)、對(duì)凋亡過程的負(fù)調(diào)控、對(duì)基因表達(dá)的正調(diào)控和轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、在沒有配體情況下的外在凋亡信號(hào)通路等，表明麻杏石甘湯是通過多靶點(diǎn)、多途徑治療ALI。繼而在DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG通路分析，得到101個(gè)條目(P<0.01)，將排名前20的條目進(jìn)行可視化，結(jié)果見圖4。由圖4可見，麻杏石甘湯治療ALI的核心靶點(diǎn)主要參與TNF信號(hào)通路、甲型流感通路、HIF-1信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路和PI3K-Akt信號(hào)通路等。

圖4 KEGG信號(hào)通路富集分析(前20位)

3.6 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

為了評(píng)價(jià)麻杏石甘湯對(duì)ALI的治療作用，對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI相關(guān)參數(shù)進(jìn)行了量化，包括總白細(xì)胞計(jì)數(shù)、肺W/D質(zhì)量比(W/D比值)和BALF中蛋白質(zhì)的濃度，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，在對(duì)照組肺泡灌洗液中有非常少的中性粒細(xì)胞浸潤；與對(duì)照組相比，模型組肺泡灌洗液中的白細(xì)胞總數(shù)明顯增加(P<0.01)；而與模型組相比，MXSGD高劑量組和低劑量組的白細(xì)胞總數(shù)明顯減少(P<0.01)，且呈劑量依賴性，高劑量組白細(xì)胞總數(shù)下降得更明顯。肺的W/D比值能夠直接反映肺水腫的情況，模型組的W/D比值與對(duì)照組比較明顯增大(P<0.05)。然而，與對(duì)照組相比，MXSGD高、低劑量組的W/D比值顯著減小(P<0.01)，且高劑量組比低劑量組降低得更多。與對(duì)照組相比，模型組大鼠BALF中的蛋白質(zhì)量濃度比較高(P<0.01)，而MXSGD高、低劑量可以起到降低肺泡灌洗液中蛋白質(zhì)量濃度的作用(P<0.01)，高劑量MXSGD的作用更明顯。

麻杏石甘湯治療大鼠ALI的肺組織病理情況見圖5。由圖5可見，對(duì)照組在光鏡下，肺泡總體結(jié)構(gòu)比較完整，大小一致，肺泡腔內(nèi)清晰，肺泡壁比較??；模型組肺泡結(jié)構(gòu)與對(duì)照組比較明顯受到破壞，肺泡腔變小，肺泡之間的厚度變大，肺間質(zhì)及肺泡腫大、充血并伴有炎性細(xì)胞浸潤；高、低劑量的MXSGD能使炎性細(xì)胞浸潤數(shù)量減少，減輕肺間質(zhì)及肺泡充血、水腫程度，且呈劑量依賴性。

表2 麻杏石甘湯對(duì)大鼠ALI炎癥水平的影響

注：A.對(duì)照組；B.模型組；C.MXSGD低劑量組；D.MXSGD高劑量組。

3.7 Western blot驗(yàn)證關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的表達(dá)

選擇2個(gè)關(guān)鍵的上調(diào)蛋白，即PI3K和AKT，應(yīng)用Western blot進(jìn)行定量檢測。與對(duì)照組比較，模型組肺組織中PI3K和AKT 的表達(dá)量下降，但MXSGD高、低劑量組蛋白的表達(dá)量顯著高于模型組(P<0.05)，對(duì)圖像的統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)一步證實(shí)了Western blot的結(jié)果，結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，Western blot結(jié)果與靶點(diǎn)推測結(jié)果一致。

注：A.Western blot結(jié)果；B.PI3K灰度值統(tǒng)計(jì)；C.AKT灰度值統(tǒng)計(jì)。采用Western blot對(duì)PI3K、AKT蛋白的表達(dá)量進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參。##P<0.01與對(duì)照組比較；**P<0.01與模型組比較。

4 討論

ALI是一種由創(chuàng)傷、感染、有害氣體吸入和休克等多種直接或間接因素導(dǎo)致的以肺彌散功能障礙為特征的疾病，最終造成缺氧性呼吸衰竭甚至死亡[8-9]。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測麻杏石甘湯治療ALI的作用機(jī)制，得出核心靶點(diǎn)及相應(yīng)的通路，主要涉及病毒感染、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等方面。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法得到134種有效成分、135個(gè)核心靶點(diǎn)、623條GO富集分析條目、128條KEGG通路分析條目。結(jié)果顯示，槲皮素、木犀草素、山柰酚、柚皮素、芒柄花黃素、甘草查爾酮A、光甘草啶和異鼠李素等可能是麻杏石甘湯治療ALI的主要有效成分，其中槲皮素的作用最大。槲皮素是廣泛存在于自然界中的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗病毒[10]、降血脂、調(diào)節(jié)免疫、減輕心肌缺血再灌注損傷等作用[11]。槲皮素可以減輕心肌損傷癥狀，并且可能通過激活PI3K/AKT/mTOR通路[12]，調(diào)控p21/cip1和p27/kip1蛋白的穩(wěn)定性，抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖，起到抗癌的作用[13]。山柰酚具有抗氧化、抗癌和消除自由基的功能，山柰酚通過抑制由LPS導(dǎo)致的人單核細(xì)胞THP-1的MAPK通路的表達(dá)，從而降低炎癥因子，如IL-8、IL-6和TNF的表達(dá)水平，從而發(fā)揮抑制炎癥的作用[14]。柚皮素具有鎮(zhèn)咳、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老和減輕炎癥的作用。柚皮素可以抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，從而減輕由LPS導(dǎo)致的肺部炎癥[15]，進(jìn)而治療ALI。因此，麻杏石甘湯的主要活性成分在治療ALI中具有良好的療效。

通過將核心靶點(diǎn)繪制的PPI網(wǎng)絡(luò)圖可以得出AKT1、IL6、VEGFA、TNF和MAPK3為關(guān)鍵靶標(biāo)。AKT1為蛋白激酶1，在細(xì)胞存活和凋亡中具有重要的作用。PI3K-AKT是生物體內(nèi)經(jīng)典的生物通路。IL6是一種多功能細(xì)胞因子，是調(diào)控炎性反應(yīng)的重要促炎細(xì)胞因子，在不同情況下可以由多種細(xì)胞產(chǎn)生[16]，而麻杏石甘湯中的山柰酚和柚皮素具有抑制IL6表達(dá)的作用，從而起到抗炎的作用。VEGFA也稱為促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，它不僅能夠加快內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，還能提高血管的通透性，主要參與早期急性肺水腫的形成[17]。TNF為腫瘤壞死因子，具有殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，但其作用機(jī)制尚不清晰。TNF還具有抑制病毒復(fù)制的作用[18]。MAPK3是在細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激、神經(jīng)遞質(zhì)和病毒感染的應(yīng)激環(huán)境下所產(chǎn)生的，該酶調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、對(duì)環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種生理或病理過程[19-20]。

經(jīng)GO和KEGG通路分析表明關(guān)鍵靶點(diǎn)主要集中在甲型流感通路、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路等相關(guān)信號(hào)通路上，由此可以預(yù)測麻杏石甘湯是通過減輕炎癥反應(yīng)、降低肺組織通透性、鎮(zhèn)咳平喘和抗病毒等作用來治療ALI。

通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，麻杏石甘湯具有減輕大鼠肺部損傷、減少炎癥細(xì)胞因子以及減輕肺部水腫和出血的作用。同時(shí)，Western blot結(jié)果顯示，麻杏石甘湯可以上調(diào)PI3K蛋白的表達(dá)水平，提高AKT蛋白的表達(dá)量，從而調(diào)控PI3K/AKT通路，起到抗炎的目的。磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)為磷脂激酶家族的主要因子，其中PI3K具有蛋白激酶活性，對(duì)AKT具有調(diào)節(jié)作用，AKT可激活下游蛋白Bcl-2，可直接調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生存、抑制凋亡[21]。

綜上所述，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)麻杏石甘湯治療ALI的有效成分、作用靶點(diǎn)以及相關(guān)的通路進(jìn)行了探究，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)方法，驗(yàn)證麻杏石甘湯的藥效和調(diào)控機(jī)制。本研究為深入研究麻杏石甘湯治療ALI的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。