鄂藥合葉子的化學(xué)成分及其抗炎和細(xì)胞毒活性研究

李英剛，王博博，楊 晶，陳麗婭，張 睿，劉娜娜，王 欣，高 陽，張海龍*

1. 豐潤生物科技股份有限公司，哈爾濱 150066；2. 西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061

鄂藥合葉子(Filipendulapalmate)是薔薇科(Rosaceae)蚊子草屬植物，主要分布于我國東北地區(qū)和山西等地，是鄂倫春族民間使用的一種藥材[1-2]，主要用于治療風(fēng)濕、痛風(fēng)、燒傷和燙傷等癥。此外，俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)人們將其作為野蔬腌制后食用[3-4]。合葉子作為一種藥食兩用的植物，目前國內(nèi)外對其化學(xué)成分和藥理活性的研究鮮有報道。為充分開發(fā)利用這種具有民族特色的藥食兩用植物，本課題組持續(xù)對合葉子進(jìn)行化學(xué)成分和生物活性的研究。在本研究中，從合葉子醇提物的乙酸乙酯部位分離鑒定得到了11種化合物，其中8種化合物是首次從該植物中分離得到，且化合物1能顯著抑制RAW264.7細(xì)胞中NO的產(chǎn)生，且無明顯的細(xì)胞毒作用，推測其可能具有一定的體內(nèi)抗炎活性；而化合物11對巨噬細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒作用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

PuriMaster 5000型高效液相色譜儀、SuPerMax 3100型多功能酶標(biāo)儀均購自上?？普苌萍加邢薰荆籑egres C18分析型色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Cosmosil C18半制備型色譜柱(250 mm×10.0 mm，5 μm)均購自江蘇漢邦科技有限公司；AVANCE Ⅲ HD 400 MHz型核磁共振儀(德國Bruker公司)。

1.2 試藥

合葉子全草于2019年7月末采集于黑龍江省通北林業(yè)局，經(jīng)張海龍教授鑒定為光葉蚊子草(FilipendulapalmateMaxim.)，憑證標(biāo)本保留在西安交通大學(xué)藥學(xué)院(編號HYZ20190728)。柱層析硅膠(100～200、200～300目)、薄層層析硅膠GF254均購自青島海洋化工有限公司；RP-C18(德國Merck公司)；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等試劑均為分析純，均購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；氘代試劑[薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司]；DMEM高糖培養(yǎng)基、Griess試劑均購自美國Hyclone公司；胎牛血清、青鏈雙抗均購自美國Gibco公司；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、胰蛋白酶、噻唑藍(lán)[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-Z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide), MTT]等均購自美國Sigma公司。

2 方法

2.1 提取

將15.0 kg合葉子全草陰干后，使用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇回流提取3次。減壓回收溶劑，得浸膏929.0 g。將浸膏分散于適量蒸餾水中，分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，減壓濃縮，得石油醚萃取物155.2 g、乙酸乙酯萃取物175.6 g、正丁醇萃取物96.3 g和水層280.2 g。

2.2 化學(xué)成分分離

取乙酸乙酯層萃取物155.0 g，通過硅膠柱色譜(200～300目，900 g)分別以石油醚-乙酸乙酯(80∶1、40∶1、20∶1、10∶1、5∶1)、二氯甲烷-甲醇(20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶0)梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜檢識，合并相同流分，得到17個流分(EA-1～EA-17)。EA-2經(jīng)硅膠柱層析以石油醚-乙酸乙酯(100∶1)作為流動相洗脫，得到3個流分(EA-2-1～EA-2-3)，EA-2-1以石油醚作為溶劑，經(jīng)過多次重結(jié)晶得到化合物1(500.2 mg)。EA-2-2經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯(200∶1)作為流動相，得3個流分(PE-2-2-1～PE-2-2-3)。EA-2-2-2經(jīng)薄層色譜(preparative thin layer chromatography, PTLC)(石油醚-乙酸乙酯：20∶1)純化后得化合物2(10.0 mg)和3(4.0 mg)。EA-2-2-3經(jīng)PTLC(石油醚-乙酸乙酯：20∶1)純化后得化合物4(9.2 mg)。EA-7經(jīng)硅膠柱層析，以二氯甲烷-甲醇(40∶1、20∶1、10∶1)作為流動相洗脫，得6個流分(EA-7-1～EA-7-6)。EA-7-2以甲醇-水作為溶劑，經(jīng)多次重結(jié)晶得化合物5(21.8 mg)。EA-7-3經(jīng)PTLC(石油醚-乙酸乙酯：5∶1)純化后得化合物6(24.0 mg)。EA-7-4經(jīng)PTLC純化后得到化合物7(7.3 mg)。EA-7-6以甲醇-水(30∶70、50∶50、70∶30)作為流動相梯度洗脫，經(jīng)反相硅膠(octadecyl silane, ODS)柱色譜進(jìn)一步分離，得4個流分(EA-7-6-1～EA-7-6-4)。EA-7-6-2以甲醇-水(60∶40)作為流動相洗脫，經(jīng)HPLC純化后得化合物8(5.4 mg)和9(2.8 mg)。EA-7-6-3經(jīng)高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法純化得化合物10(2.8 mg)和11(2.1 mg)。

2.3 體外抗炎活性篩選

2.3.1細(xì)胞毒作用測定 參考文獻(xiàn)方法[5]，將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，以2×105個/孔的密度接種于96孔板中。待24 h細(xì)胞貼壁后，將化合物(100 μmol·L-1)添加到培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液，培養(yǎng)4 h后，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，再加入150 μL 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，在恒溫振蕩器上充分搖勻后于490 nm處測定吸光度值，計算細(xì)胞增殖抑制率。

2.3.2一氧化氮生成抑制作用測定 參考文獻(xiàn)方法[6]，將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，以2×105個/孔的密度接種于96孔板中。37 ℃下于體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長后，將化合物(100 μmol·L-1)添加到培養(yǎng)基中，每組設(shè)3個平行。1 h后，在每個孔中添加LPS(質(zhì)量濃度1 μg·mL-1)，培養(yǎng)24 h后，收集上清液，使用Griess試劑測定上清液中NO的含量，并計算NO抑制率。

2.3.3統(tǒng)計學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0以Dunnett’s test方法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)進(jìn)行統(tǒng)計分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色無定形粉末，易溶于氯仿，硫酸乙醇顯色呈紫紅色，推斷其為三萜或甾體類化合物。分別用石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮和二氯甲烷-甲醇3種展開體系，將化合物與β-谷甾醇對照品進(jìn)行共薄層分析，其色譜行為完全相同，鑒定該化合物為β-谷甾醇。

化合物2白色無定形粉末，易溶于氯仿，分子式為C7H6O3。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δH：10.44(2-OH，s，1H)，7.92(H-4，d，1H，J= 7.9 Hz)，7.53(H-6，t，1H，J= 7.8 Hz)，7.02(H-5，d，1H，J= 8.4 Hz)，6.93(H-3，t，1H，J= 7.5 Hz)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δC：173.6(C-7)，162.5(C-2)，137.0(C-4)，130.9(C-6)，119.7(C-5)，118.0(C-3)，113.9(C-1)。將化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[7]比對，確定該化合物為水楊酸。

化合物3白色無定形粉末，易溶于氯仿，分子式為C20H40O。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δH：4.15(H-1，d，2H，J= 7.0 Hz)，3.65(H-2，d，1H，J= 6.6 Hz)，1.67(H-3，s，3H)，0.86(H-17、H-18，m，6H)，0.84(H-19、H-20，d，6H，J= 2.8 Hz)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δC：140.5(C-3)，123.2(C-2)，59.6(C-1)，40.1(C-4)，39.5(C-14)，37.7(C-10)，37.6(C-8)，37.3(C-12)，36.7(C-6)，33.6(C-11)，32.9(C-7)，28.2(C-15)，25.9(C-5)，25.4(C-13)，24.6(C-9)，22.9(C-16)，22.3(C-17)，19.8(C-18)，19.7(C-19)，16.2(C-20)。將化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[8]比對，確定該化合物為植物醇。

化合物4白色無定形粉末，易溶于氯仿，分子式為C29H48O2。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δH：5.79(H-4，s，1H)，4.32(H-6，s，1H)，1.38(H-19，s，3H)，0.90(H-21，d，3H，J=6.5 Hz)，0.85-0.77(H-26、H-27、H-29，m，9H)，0.73(H-18，s，3H)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δC：200.7(C-3)，168.7(C-5)，125.4(C-4)，73.4(C-6)，56.3(C-17)，55.9(C-14)，53.8(C-9)，46.1(C-24)，42.4(C-13)，39.5(C-12)，38.7(C-7)，37.9(C-10)，37.3(C-1)，35.9(C-20)，34.2(C-2)，33.9(C-22)，29.7(C-8)，29.3(C-25)，28.1(C-16)，26.3(C-23)，23.8(C-15)，22.7(C-28)，20.8(C-11)，19.8(C-18)，19.7(C-19)，19.7(C-26)，19.1(C-21)，18.9(C-27)，12.1(C-29)。將化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[9]比對，確定該化合物為6-羥基-豆甾-4-烯-3-酮。

化合物5白色無定形粉末，易溶于氯仿，分子式為C29H46O。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δH：3.63(H-12，d，1H，J= 6.7 Hz)，3.48(H-3，dd，1H，J= 10.5，5.2 Hz)，1.02(H-24，s，3H)，0.98(H-26，s，3H)，0.96(H-23、H-27，t，6H，J= 3.4 Hz)，0.86(H-25，s，3H)，0.79(H-29，s，3H)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δC：137.4(C-13)，133.3(C-18)，129.1(C-17)，117.0(C-12)，78.5(C-3)，55.7(C-5)，47.4(C-9)，39.1(C-8)，39.0(C-1)，38.8(C-4)，38.7(C-14)，36.7(C-10)，33.9(C-7)，32.9(C-22)，32.8(C-20)，32.7(C-19)，28.6(C-16)，28.5(C-2)，28.0(C-23)，27.4(C-15)，25.7(C-21)，24.0(C-11)，20.8(C-27)，19.8(C-30)，17.2(C-26)，19.6(C-6)，16.9(C-24)，16.1(C-25)，13.3(C-29)。將化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[10]比對，確定該化合物為3β-hydroxy-28-norurs-12，17-dien。

化合物6白色油狀物，易溶于甲醇，分子式為C6H6O3。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δH：9.53(H-6，s，1H)，7.38(H-3，d，1H，J= 3.6 Hz)，6.57(H-4，d，1H，J= 3.5 Hz)，4.59(H-7，s，2H)。13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δC：179.2(C-6)，163.1(C-2)，154.1(C-5)，124.8(C-3)，110.7(C-4)，57.8(C-7)。將化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[11]比對，確定該化合物為5-羥甲基糠醛。

化合物7白色無定形粉末，易溶于甲醇，分子式為C12H20O4。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δH：6.96-6.90(H-3，m，1H)，5.78(H-2，d，1H，J= 15.6 Hz)，2.27(H-4，t，2H，J= 7.4 Hz)，2.21(H-11，t，2H，J= 7.1 Hz)，1.63-1.56(H-6，m，2H)，1.50-1.44(H-9，m，2H)。13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δC：174.6(C-12)，168.2(C-1)，149.5(C-3)，121.4(C-2)，33.7(C-11)，31.7(C-4)，28.9(C-7)，28.9(C-8)，28.8(C-6)，28.6(C-9)，27.8(C-5)，24.7(C-10)。將化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[12]比對，確定該化合物為(2E)-dodecenedioic acid。

化合物8白色針晶，易溶于甲醇，分子式為C9H10O5。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δH：7.06(H-2、H-6，s，2H)，4.25(H-8，q，2H，J= 7.1 Hz)，1.32(H-9，t，3H，J= 7.1 Hz)。13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δC：168.5(C-7)，146.4(C-3)，146.3(C-5)，139.5(C-4)，121.7(C-1)，110.6(C-2)，110.1(C-6)，61.7(C-8)，14.6(C-9)。將化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[13]比對，確定該化合物為沒食子酸乙酯。

化合物9白色簇狀結(jié)晶，易溶于甲醇，分子式為C7H6O5。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δH：7.05(H-2，H-6，s，2H)。13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δC：170.3(C-7)，146.7(C-3)，146.3(C-5)，139.8(C-4)，122.1(C-1)，110.4(C-2)，110.2(C-6)。將化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[14]比對，確定該化合物為沒食子酸。

化合物10無色油狀物，分子式為C19H36O5。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δH：5.76-5.64(H-9、H-10，m，2H)，4.04(H-11，dd，1H，J= 11.7，6.2 Hz)，3.90(H-12，t，1H，J= 5.7 Hz)，3.64(-OCH3，s，3H)，3.47-3.34(H-8，m，1H)，2.32(H-2，t，2H，J= 7.4 Hz)，0.88(H-18，t，3H，J= 6.7 Hz)。13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δC：176.1(C-1)，136.4(C-9)，131.3(C-10)，76.2(C-11)，76.1(C-12)，72.9(C-8)，52.3(-OCH3)，38.1(C-7)，34.6(C-2)，33.2(C-13)，33.1(C-16)，30.7(C-15)，30.5(C-5)，30.3(C-4)，26.4(C-14)，26.2(C-6)，25.9(C-3)，23.8(C-17)，14.2(C-18)。將化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[15]比對，確定該化合物為tianshic acid methyl este。

化合物11白色無定形粉末，易溶于氯仿-甲醇混合溶劑，分子式為C30H48O4。1H-NMR(600 MHz，Pyr-d5)δH：5.63(H-12，t，1H，J=3.3 Hz)，3.65(H-3，s，1H)，1.75(H-23，s，3H)，1.51(H-29，s，3H)，1.25(H-27，s，3H)，1.16(H-26，d，3H，J=6.6 Hz)，1.13(H-30，s，3H)，1.03(H-25，s，3H)，0.93(H-24，s，3H)。13C-NMR(150 MHz，Pyr-d5)δC：181.4(C-28)，140.5(C-13)，128.7(C-12)，77.9(C-3)，73.2(C-19)，56.2(C-5)，55.0(C-18)，48.9(C-17)，48.1(C-9)，42.9(C-20)，42.4(C-14)，41.1(C-8)，39.9(C-4)，38.8(C-22)，38.2(C-1)，37.9(C-10)，34.1(C-7)，29.9(C-15)，29.3(C-2)，29.1(C-23)，27.6(C-29)，27.4(C-21)，26.9(C-16)，25.2(C-27)，24.5(C-11)，19.5(C-6)，17.9(C-26)，17.2(C-30)，17.0(C-25)，15.8(C-24)。將化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[16]比對，確定該化合物為坡模酸。

3.2 體外抗炎活性檢測

測定了11種化合物對RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響，并同時進(jìn)行了細(xì)胞毒測定，結(jié)果見表1和表2。由表1和表2可知，化合物1能抑制巨噬細(xì)胞中NO的產(chǎn)生，同時無明顯的細(xì)胞毒，推測其可能具有一定的體內(nèi)抗炎活性。而化合物11能顯著抑制RAW264.7細(xì)胞中NO的產(chǎn)生，在濃度為100 μmol·L-1時，其抑制率達(dá)66.2%±3.9%，但這主要是由于其細(xì)胞毒引起的，因?yàn)楫?dāng)化合物11的濃度為100 μmol·L-1，與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞活力只有11.5%。因此，該三萜化合物具有顯著的細(xì)胞毒作用。

表1 化合物對RAW264.7細(xì)胞一氧化氮產(chǎn)生的抑制活性

表2 化合物對RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒作用

4 討論

鄂倫春族人民在長期的游獵生活中形成了具有鮮明民族特色的醫(yī)藥文化，但隨著社會的發(fā)展和生產(chǎn)、生活方式的改變，其民族醫(yī)藥文化正在逐漸消失，為了及時和更好地傳承和發(fā)揚(yáng)其民族醫(yī)藥文化，課題組長期致力于對鄂倫春族民族藥的研究。近年來，筆者系統(tǒng)地研究了幾種鄂倫春族民族藥的化學(xué)成分及其藥理活性，從中發(fā)現(xiàn)了一些結(jié)構(gòu)新穎且具有顯著藥理作用的化合物[17-23]，這為鄂倫春族民族藥的開發(fā)、利用提供了科學(xué)依據(jù)。研究從合葉子的乙醇提取物的乙酸乙酯部位中分離得到了三萜、酚酸以及脂肪酸和甾體類化合物。在這些化合物中，三萜類成分具有顯著的細(xì)胞毒作用，而甾體化合物具有一定的抗炎作用，這些結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)利用鄂藥合葉子奠定了研究基礎(chǔ)。