甲砜霉素對中華鱉血清生化指標、抗氧化酶活性及組織結(jié)構(gòu)的影響

劉 瑩，張永剛，李先國，張大海，李兆新，邢麗紅，孫曉杰

(1.中國海洋大學化學化工學院，山東青島 266100；2.青島市漁業(yè)技術(shù)推廣站，山東青島 266071；3.中國水產(chǎn)科學院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071)

中華鱉()又稱甲魚、水魚，是世界上重要的水生爬行動物物種之一，廣泛分布于中國、日本、韓國等亞洲國家，并因其高營養(yǎng)和高藥用價值而聞名。目前，中華鱉已成為我國淡水養(yǎng)殖中重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖品種之一，2019年我國鱉的養(yǎng)殖總產(chǎn)量約為32.5萬噸。然而，隨著中華鱉養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的迅速擴大、養(yǎng)殖密度增加、水環(huán)境惡化，使得養(yǎng)殖過程中細菌性疾病大規(guī)模爆發(fā)，且感染率及死亡率較高，導致嚴重的經(jīng)濟損失，阻礙了中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。

甲砜霉素(thiamphenicol，TAP)為第二代人工合成的氯霉素類廣譜抗菌藥物，抑菌效果及作用機理與氯霉素相似，但是毒性有所降低。因其低成本、吸收快，與常用抗菌藥物無交叉耐藥性等特點，被廣泛應用于畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)細菌性疾病預防和治療過程中。但是由于在養(yǎng)殖過程中的過度使用、濫用，導致TAP在養(yǎng)殖環(huán)境中殘留，對生態(tài)系統(tǒng)和人類健康造成嚴重的負面影響。已有研究表明，TAP在一定劑量下具有較強的血液毒性、胚胎毒性和免疫抑制作用，甚至可影響動物、植物和微生物的生理功能。目前，關于TAP在松浦鏡鯉()、鯽()、大菱鲆()、眼斑擬石首魚()等水產(chǎn)動物的血液毒性或藥物代謝動力學的研究已有較多報道，但關于TAP對中華鱉毒性的研究鮮有報道。

本實驗在水溫26.0 ℃條件下，研究了口灌不同用藥劑量的TAP對中華鱉血液生化指標、組織抗氧化酶活及各組織器官損傷的毒性作用，旨為指導TAP在中華鱉病害防控過程中的科學使用提供基礎數(shù)據(jù)和臨床用藥理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗用中華鱉規(guī)格約(500±50)g/只，由山東省平度百歲泊中華鱉養(yǎng)殖基地提供。實驗鱉暫養(yǎng)在養(yǎng)殖池中7 d后，選取體質(zhì)健壯、活力強、無病無傷的中華鱉進行實驗，給藥前停飼24 h。養(yǎng)殖池規(guī)格為150 m，水深 1.5～2 m，中華鱉養(yǎng)殖密度約300只/池，投喂飼料為幼鱉飼料。

1.2 藥品與試劑

TAP標準品(純度≥99.5%)，購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；TAP原料粉(純度≥99.5%)，生產(chǎn)批號：C10056838，購自上海麥克林公司。

血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(UN)、血糖(GLU)、氯離子(Cl)、鉀離子(K)、鈣離子(Ca)和堿性磷酸酶(AKP)等血清生化指標試劑盒，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、一氧化氮合酶(NOS)、丙二醛(MDA)組織抗氧化相關指標測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.3 TAP藥物配制

參考2015年版《中華人民共和國獸藥典》中TAP對魚的推薦用藥劑量(16.7 mg/kg)，使用0.9%生理鹽水將TAP原料粉配制濃度為16.7、50.1及83.5 mg/mL的藥液(魚推薦用藥劑量的1、3、5倍)。

1.4 實驗方案設計

設3個實驗組(16.7、50.1及83.5 mg/kg)和1個對照組，每組設置3個平行，每個平行10只中華鱉，取樣時自每個平行中取3個樣品作為生物學重復(=3)進行測定。為了保持給藥量精確，給藥采用口服灌喂方式。用帶有橡皮軟管的注射器吸取0.5 mL的藥液，將注射器慢慢深入中華鱉口中灌喂，保持中華鱉形體豎立約半分鐘，然后放入養(yǎng)殖水槽正常飼養(yǎng)。若有回吐，則棄去，再新取另一只口灌。對照組口灌等同體積的生理鹽水。實驗共進行4 d，口灌1次/d，實驗期間水溫保持在26.0 ℃。

1.5 樣品采集方法

中華鱉給藥停止24 h后采樣。每組隨機取3只中華鱉采集血液，之后依次取肝臟、脾臟、心臟、腎臟、肌肉、睪丸和精巢等組織。

1.6 血液生化指標測定方法

采集的血液在室溫靜置2～3 h后，置于4 ℃冰箱過夜，以4 ℃ 5 500 r/min離心15 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱中備測。按試劑盒說明書中步驟，分別測定血清中TP、ALB、ALT等10個生理生化指標。

1.7 肝臟、脾臟抗氧化指標的測定方法

將采集的肝臟和脾臟組織勻漿處理，按試劑盒說明書中步驟，測定組織中SOD、CAT、NOS活性及MDA含量。

1.8 組織切片處理方法

將采集的中華鱉肝臟、脾臟、腎臟、心臟、肌肉、腸道、精巢和睪丸等組織或器官在Davidson’s固定液中固定24 h后，將固定液換成70%的乙醇。參照王凱的方法，進行樣品的脫水、石蠟包埋、切片(5 μm)和染色等處理后，在光學顯微鏡下觀察、拍照。

1.9 數(shù)據(jù)分析方法

2 結(jié)果與分析

2.1 TAP對中華鱉血清生理生化指標的影響

對照組及實驗組血清生理生化指標測定結(jié)果如表1所示。與對照組相比，給藥組血清中的ALT和AST均有所增加，在83.5 mg/kg劑量組達到最高值，分別為對照組的7倍和3.7倍；AKP、ALB、TP、K及GLU等血清生化指標在16.7 mg/kg劑量組顯著升高，隨著用藥劑量增加，含量逐漸降低，83.5mg/kg劑量組的AKP活性低于對照組，其他均高于對照組。Cl濃度隨著TAP的使用有所降低，Ca的濃度變化不顯著。

表1 TAP對中華鱉血清中生理生化指標的影響

2.2 TAP對中華鱉肝臟、脾臟抗氧化指標的影響

2.2.1 TAP對肝臟SOD、CAT、NOS活性和MDA含量的影響

如圖1所示，與對照組相比，16.7 mg/kg劑量組肝臟中的SOD和NOS活性顯著增加，具有明顯的誘導作用；而50.1和83.5 mg/kg劑量組活性逐漸降低。肝臟中的CAT活性在50.1 mg/kg劑量組達到最高值，83.5 mg/kg劑量組活性逐漸降低但仍高于對照組。16.7 mg/kg劑量組肝臟中的MDA含量有所下降，50.1和83.5 mg/kg劑量組活性逐漸升高，在83.5 mg/kg劑量組最高。

圖1 TAP對中華鱉肝臟抗氧化酶活性的影響

說明TAP以推薦劑量口灌中華鱉時，對肝臟的SOD、CAT、NOS活性起到誘導作用，當超過一定濃度范圍時，誘導作用逐漸減弱。而肝臟MDA含量的變化趨勢與之相反，在16.7 mg/kg劑量組，肝臟MDA含量與對照組相同，隨著給藥劑量的增加，MDA含量呈逐漸上升的趨勢，在83.5 mg/kg劑量組時，MDA含量達到最高值。

2.2.2 TAP對脾臟SOD、CAT、NOS活性和MDA含量的影響

口服灌喂TAP前后，中華鱉脾臟中的SOD、CAT、NO活性和MDA含量測定結(jié)果如圖2所示。與對照組相比，各給藥組脾臟的SOD、CAT、NOS活性呈先升后降的趨勢，在16.7 mg/kg劑量組時均達到最高值，50.1和83.5 mg/kg劑量組顯著降低，且均低于對照組。說明在規(guī)定劑量濃度下口灌TAP，可誘導中華鱉脾臟SOD、CAT、NOS活性，反之則降低。而MDA含量與對照組相比，16.7 mg/kg劑量組顯著低于對照組，隨著給藥濃度的增加，MDA含量呈上升趨勢，83.5 mg/kg劑量組MDA含量最高。

圖2 TAP對中華鱉脾臟抗氧化酶活性的影響

2.3 TAP對中華鱉組織損傷的影響

腎臟:對照組中華鱉腎臟由許多腎小管和少量結(jié)締組織構(gòu)成，組織結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，未見有組織病理變化(圖版I-腎臟A)。與對照組相比，16.7 mg/kg劑量組腎臟組織結(jié)構(gòu)較清晰，但管腔內(nèi)有少量炎性細胞出現(xiàn)(圖版I-腎臟B)；而隨著給藥劑量的增加，50.1 mg/kg劑量組腎小管管壁增厚，炎性細胞增多(圖版I-腎臟C)；83.5 mg/kg劑量組組織界限模糊(圖版I-腎臟D)。

肝臟:對照組與16.7 mg/kg劑量組肝組織致密、結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞呈多角狀，排列整齊緊密，呈放射狀圍繞中央靜脈排列(圖版I-肝臟A-B)；50.1 mg/kg劑量組肝小管出現(xiàn)炎癥，管壁細胞腫脹彼此融合(圖版I-肝臟C)；而83.5 mg/kg劑量組肝血竇擴張嚴重，有大量炎性細胞浸潤，肝細胞染色淺淡(圖版I-肝臟D)。

脾臟:對照組與16.7 mg/kg劑量組脾臟紅髓和白髓結(jié)構(gòu)明顯，排列有序，成熟紅細胞、淋巴細胞、單核細胞、吞噬細胞等密集相間，未見有組織病理變化(圖版I-脾臟A-B)；隨著給藥劑量的增加，50.1 mg/kg劑量組脾臟小梁靜脈中充滿大量炎性細胞(圖版I-脾臟C)；83.5 mg/kg劑量組小梁動脈出現(xiàn)炎癥，管壁增厚(圖版I-脾臟D)。

腸道:對照組與16.7 mg/kg劑量組腸由黏膜、肌層和漿膜三層構(gòu)成，黏膜層結(jié)構(gòu)完整，黏膜上皮清晰，細胞類型正常，未見有組織病理變化(圖版I-腸道A-B)；50.1 mg/kg劑量組腸絨毛結(jié)構(gòu)不完整，出現(xiàn)脫落現(xiàn)象，細胞核固化(圖版I-腸道C)；隨著給藥劑量的增加，83.5 mg/kg劑量組腸紋狀緣、固有膜嚴重受損，杯狀細胞增多(圖版I-腸道D)。

心臟:16.7 mg/kg劑量組與對照組心肌纖維排列有序、相互縱橫交叉，構(gòu)成復雜的網(wǎng)狀組織，無組織病理變化(圖版I-心臟A-B)；隨著給藥劑量的增加，50.1 mg/kg劑量組心肌纖維斷裂現(xiàn)象逐漸嚴重，其間有大量炎性細胞浸潤(圖版I-心臟C)；83.5 mg/kg劑量組心外膜受損，心肌纖維斷裂，部分組織出現(xiàn)崩解現(xiàn)象，呈空泡狀(圖版I-心臟D)。

精巢:16.7 mg/kg劑量組與對照組精巢結(jié)構(gòu)完整無病理特征，精小囊內(nèi)充斥著大量的生殖細胞，細胞質(zhì)致密(圖版I-精巢A-B)；隨著用藥劑量的增加，50.1 mg/kg劑量組精小囊內(nèi)生殖細胞逐漸減少，生精小管受損(圖版I-精巢C)；而83.5 mg/kg劑量組精小囊內(nèi)生殖細胞完全消失(圖版I-精巢D)。

睪丸:睪丸間質(zhì)由結(jié)締組織細胞和間質(zhì)細胞組成，對照組與16.7 mg/kg劑量組曲精管腔結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)腔充滿了大量生殖細胞群體，未見病理變化(圖版I-睪丸A-B)；隨著用藥劑量的增加，50.1和83.5 mg/kg劑量組曲精管腔內(nèi)生殖細胞或游離的精子逐漸減少(圖版I-睪丸C)，83.5 mg/kg劑量組受損程度嚴重，曲精管腔留有大面積的空白區(qū)域(圖版I-睪丸D)。

肌肉:肌肉由白肌和紅肌組成，肌纖維成束排列，紅肌橫斷面為圓形或近圓形，白肌為三角形或多邊形，16.7和50.1 mg/kg劑量組肌肉組織結(jié)構(gòu)與對照組相似，組織結(jié)構(gòu)正常未見病理變化(圖版I-肌肉A-C)；而83.5 mg/kg劑量組的肌肉細胞核固化，肌原纖維受損，導致肌束間間隙增大(圖版I-肌肉D)。

圖版I 口灌TAP對中華鱉組織的病理變化

3 討論

3.1 TAP對中華鱉血液生化指標的影響

血液在動物體內(nèi)有著十分重要的作用，參與機體的新陳代謝、防御、免疫及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等，血液學指標不僅能反映動物的生理狀態(tài)，也廣泛用于評價動物的健康狀況。目前，關于TAP對魚類血液毒性的研究已有報道，但對于中華鱉血液毒性的研究較少。

本實驗采用口灌的方法，研究了TAP對中華鱉10項血清生化指標的影響，發(fā)現(xiàn)TAP對中華鱉血清生化指標影響顯著，且存在明顯的劑量效應關系。在本研究中，ALT、AST活力與藥物濃度成正比，在83.5 mg/kg劑量組達到最高值，明顯高于對照組，與楊洪波等報道的TAP對松浦鏡鯉血清生化指標影響的結(jié)果一致。Sobhy等也報道成年小鼠以16 mg/100 g體質(zhì)量服用TAP 7 d，其血清AST、ALT顯著升高。ALT、AST主要分布于肝細胞內(nèi)，為肝臟中兩種重要的指示酶，其升高的程度與肝細胞受損的程度相一致，由此可見，TAP對中華鱉肝臟可能有一定的損傷作用。

TP、ALB可反映動物機體組織器官功能狀態(tài)，肝腎功能受損可引起其在血清中含量的降低。在本研究中，16.7 mg/kg劑量組血清TP、ALB含量顯著高于對照組，但隨著藥物濃度的增加而逐漸降低。說明TAP在推薦劑量下可提高機體的蛋白合成代謝功能，當超過閾值時導致肝腎功能受損，含量降低。本結(jié)果與唐海蓉等報道的TAP對肉雞血清TP、ALB變化趨勢的影響存在一定差異，可能與實驗動物和實驗周期不同有關。

UN及動物機體內(nèi)環(huán)境中各種離子濃度的變化，對機體健康狀況有著重要的影響，均可衡量腎臟功能的受損情況。UN來源于肝臟，而通過腎臟隨尿排出，當腎臟受損時，濾過增多，血清中含量就增高；UN較低表明機體蛋白合成效率高。在本研究中，16.7和50.1 mg/kg劑量組UN含量和對照組無顯著差異，而83.5 mg/kg劑量組顯著高于其他三組；實驗組K濃度顯著高于對照組，Cl濃度顯著降低，Ca無顯著差異，表明TAP對中華鱉血清Ca濃度影響較小。本研究結(jié)果與唐海蓉等的報道結(jié)果相似，可能由于隨著藥物濃度的增加，加大了肝腎負擔，對肝腎的代謝功能造成了一定的壓力，降低了蛋白合成效率，導致其相對應的指標含量下降。

AKP是生物體的一種重要的代謝調(diào)控酶，在堿性環(huán)境下能水解磷酸單酯起到解毒、免疫防御的作用。在本研究中，血清AKP活性在16.7 mg/kg劑量組顯著升高，50.1和83.5 mg/kg劑量組顯著降低。SONG等報道，當大量病毒在血細胞內(nèi)繁殖時，血細胞會大量減少，同時AKP的活性也會下降。原理可能與其相似，當中華鱉在推薦劑量下口灌TAP時，可促進血細胞的生產(chǎn)，提高血清AKP的活性，對外界刺激可達到免疫防御的作用，反之則降低。血清GLU可反映機體在脅迫環(huán)境中體內(nèi)代謝和組織器官的功能狀態(tài)。本研究中，實驗組血清GLU含量顯著高于對照組。

3.2 TAP對中華鱉肝臟、脾臟抗氧化指標的影響

近年來，在評價水生動物的健康方面，利用組織抗氧化指標來反映動物機體損傷程度得到眾多學者的廣泛應用，其中重要的抗氧化因子包括SOD、CAT、GST、GSH、NOS、MDA等，其活性及含量可隨外界脅迫而做出迅速響應。

SOD、CAT、NOS三者在機體的抗氧化和免疫保護方面有著密切的關系，共同組成了抗氧化防御系統(tǒng)的第一道防線。在本研究中，除肝臟CAT外，肝臟和脾臟SOD、CAT、NOS活性均在16.7 mg/kg劑量組達到最大值，顯著高于對照組和其他實驗組，均呈現(xiàn)先誘導后抑制的變化趨勢。馮艷艷等在研究氟苯尼考對脊尾白蝦()的免疫與抗氧化功能時也發(fā)現(xiàn)，低、中劑量的氟苯尼考對SOD、CAT有誘導作用，高劑量時則起到抑制作用。楊洪波也發(fā)現(xiàn)TAP對松浦鏡鯉()脾臟NOS活力的影響，隨著濃度增加具有先誘導后抑制的現(xiàn)象。上述研究與本實驗結(jié)果一致。SOD、CAT、NOS活性的誘導，可能由于TAP刺激機體產(chǎn)生大量的活性氧簇，為了清除過多的氧自由基，活性增強；而隨著藥物濃度的增加或在高劑量的長時間作用下，產(chǎn)生的氧自由基超出了機體能清除的范圍，TAP不能被完全排出體外，氧自由基攻擊抗氧化系統(tǒng)，導致肝臟和脾臟代謝功能下降，SOD、CAT、NOS活性被抑制。

MDA是反映機體氧化應激性能的重要指標，能體現(xiàn)脂質(zhì)過氧化程度。吝思琪等采用浸泡的方式研究了不同濃度(5、10 mg/L)的恩諾沙星對卵形鯧鲹抗氧化功能的影響，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的升高，腎臟MDA含量顯著升高。王琨等報道，當魚類肝臟、脾臟等實質(zhì)器官發(fā)生病變時，機體會發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，造成組織細胞的死亡，MDA含量顯著升高。本研究也發(fā)現(xiàn)，中華鱉肝臟和脾臟MDA含量與藥物濃度成正比，其含量的升高是脂質(zhì)過氧化反應增強、脂質(zhì)過氧化物增多的表現(xiàn)，說明高劑量的TAP對中華鱉的肝臟和脾臟可產(chǎn)生一定的損傷作用。

3.3 TAP對中華鱉組織損傷的影響

MAITA等報道以TAP200 mg/(kg·d)體重的飼喂雄性大白鼠，4周后通過組織學觀察可見精原細胞和精細胞的大量退行性變化，可引起繁殖障礙。MAGGINI等用TAP150 mg/(kg·d)的對ASHP小鼠進行肌肉注射3周，發(fā)現(xiàn)肺組織粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體片段發(fā)生改變。本研究通過組織病理對中華鱉8個不同組織器官觀察發(fā)現(xiàn)，在16.7 mg/kg劑量組時，中華鱉腸道、肝臟、腎臟、脾臟、心臟、精巢、睪丸、肌肉與對照組相比，并無顯著的病理變化，而隨著給藥劑量的增加，TAP對中華鱉以上各組織的損傷逐漸加重。表現(xiàn)為腸絨毛脫落，腎結(jié)構(gòu)模糊，肝血竇擴張、大量炎性細胞浸潤，脾臟小梁動脈出現(xiàn)炎癥，心肌纖維萎縮、崩解，精巢和睪丸生殖細胞質(zhì)消失，肌纖維斷裂、肌束間隙增大。本研究結(jié)果與MAITA等、MAGGINI等的報道相似，說明過量服用TAP對中華鱉各個組織器官均可造成嚴重的損傷，在養(yǎng)殖過程中應嚴格遵守規(guī)范的用藥劑量。

綜上所述，高劑量的TAP對中華鱉具有較強的毒性，對血液生理生化、組織免疫酶活性均產(chǎn)生抑制作用，導致機體的抗氧化功能下降。從病理組織學也可以看出，高劑量TAP對中華鱉的消化器官、排泄器官、循環(huán)器官、免疫器官、生殖器官均可造成嚴重的損傷，具有一定的生殖毒性。雖然在整個試驗過程中未發(fā)現(xiàn)中華鱉的死亡現(xiàn)象，但如果中華鱉長期過量使用TAP，可能會對其生長、生殖產(chǎn)生危害。因此，在實際的中華鱉疾病預防和治療過程中，應該嚴格控制TAP的用藥劑量，謹防過度使用或者濫用，以免對中華鱉機體造成損傷。