DEHP對斑馬魚仔魚HPG和HPA軸相關功能基因表達的影響

劉 飛，王 凡，鄭雅婷，李萌萌，冉娜娜，高曉楊，石亞男，朱娜娜，程惠敏，楊 瑞

(洛陽師范學院，河南洛陽 471934)

鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)是一種鄰苯二甲酸型乙酰丙烯類的化學物質(zhì)。因其成本低廉、可塑性較強、相容性高、兼容效果好等優(yōu)點，被廣泛應用于醫(yī)用產(chǎn)品(醫(yī)療器材、一次性外科消毒手套等)、日常用品(玩具、雨衣等)中，來增強塑料制品的可塑性。DEHP通過范德瓦爾斯力或氫鍵與塑料分子形成不穩(wěn)定的結構，因此，它容易通過清洗等方式進入空氣、水體或其他物質(zhì)之中。在高溫制作或者燃燒塑料制品過程中，DEHP由于蒸汽壓低也可通過煙塵等方式釋放到環(huán)境之中。隨著我國對DEHP這類鄰苯二甲酸類化學物質(zhì)重視程度加強，有關地表水中含有DEHP的研究被不斷報道出來。魚類處于水生捕食鏈中較高營養(yǎng)級，并且終生生活在水中，極易受到水中環(huán)境污染物的影響，因此，開展DEHP對魚類影響的研究是很有必要的。

斑馬魚()是一種與人類基因有著高度同源性，被廣泛應用于毒理學、病理學及藥理學研究中的理想模式生物。已有研究表明，DEHP對斑馬魚具有內(nèi)分泌、免疫、遺傳、肝臟等毒性。然而在魚類整個生命周期中，一般認為魚的早期生命階段(從受精卵生長發(fā)育至仔魚階段)是對外在污染物的干擾作用的最敏感階段，主要是由于這一階段的魚為補償因污染物干擾作用而引發(fā)體內(nèi)一系列生化反應的能力與成魚相比較弱。目前發(fā)現(xiàn)DEHP對斑馬魚這一生命階段影響的研究較少，僅發(fā)現(xiàn)DEHP可導致斑馬魚胚胎/仔魚發(fā)育畸形甚至死亡，干擾下丘腦-垂體-甲狀腺(HPT)軸從而致使甲狀腺激素升高。

DEHP與天然甲狀腺激素3,30,5-三碘-L-甲狀腺原氨酸(T3)的某些生理功能類似，其代謝產(chǎn)物結構與內(nèi)源性雌激素具有一定的相似性，所以，DEHP對內(nèi)分泌系統(tǒng)干擾的影響深受關注。研究環(huán)境污染物對魚類內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響，主要研究其對魚類三條主要內(nèi)分泌軸[下丘腦-垂體-性腺軸(HPG軸)、下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)、HPT軸]的影響。因此，本實驗開展DEHP斑馬魚胚胎/仔魚階段HPG軸和HPA軸的相關功能基因表達影響的研究，以期揭示其對斑馬魚內(nèi)分泌干擾的分子機制。

1 材料與方法

1.1 斑馬魚的繁殖

2月齡野生型斑馬魚經(jīng)過本實驗室養(yǎng)殖到5月齡性成熟后進行繁殖。養(yǎng)殖期間，溫度保持在26～28 ℃，每天投喂3次新鮮孵化的豐年蟲。斑馬魚的繁殖過程如下：選擇健康成熟的雄性和腹部膨大的雌性斑馬魚作為親本，繁殖前一晚將雌雄親本按1∶1放置在斑馬魚繁殖交配盒(上海海圣生物實驗設備有限公司)中，并用隔板隔開，避光過夜。次日清晨開燈并將隔板抽去。40 min后，吸出交配盒中雜質(zhì)，用魚卵撈網(wǎng)(上海海圣生物實驗設備有限公司)收集魚卵，放置于培養(yǎng)皿中，用海鹽水清洗胚胎，然后用體視顯微鏡觀察，剔除不正常的胚胎。將盛有胚胎的培養(yǎng)皿暴露于(27±1)℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行胚胎暴露實驗。

1.2 斑馬魚的胚胎毒性實驗

實驗前，用丙酮作為助溶劑將DEHP配制成高濃度的母液。實驗中所用相應濃度的暴露液由高濃度母液經(jīng)胚胎培養(yǎng)水稀釋而得，暴露液中的丙酮小于暴露液體積的0.01‰。DEHP暴露處理液的名義濃度依次為10、30和300 μg/L，對照組為0.01‰ 丙酮。使用150 mm的培養(yǎng)皿作為實驗的暴露容器，每個濃度設置5個生物學平行，每個培養(yǎng)皿加入50 mL暴露液，200枚發(fā)育正常的胚胎，然后再將其放在光照培養(yǎng)箱中進行暴露實驗，暴露實驗期間用一次性吸管及時吸出停止發(fā)育或者死亡的胚胎和仔魚。在胚胎受精后96 h，吸除培養(yǎng)皿中雜質(zhì)，用專用魚苗撈網(wǎng)隨機撈取各培養(yǎng)皿中的仔魚50尾，吸干水分后，置于裝有RNA保存液(RNAlater)的EP管中，4 ℃過夜后再放置在-80 ℃冰箱中保存，以備后續(xù)實驗所用。

1.3 斑馬魚仔魚的總RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄

取出上述裝有斑馬魚仔魚樣品的EP管，待樣品解凍后，依據(jù)RNA提取試劑盒(上海飛捷生物技術有限公司)上的步驟提取各樣品中的總RNA，抽提完成后測定各樣品的/值，結果顯示均在1.8～2.0之間，同時，用凝膠電泳分析顯示28 S的亮度和寬度是18 S的2倍左右，表明RNA質(zhì)量較好。

按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(東洋紡反轉(zhuǎn)錄試劑盒)中的步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，對于濃度不在100～250 ng/μL的RNA樣品，在反轉(zhuǎn)錄之前用DNase/RNase-free ddHO進行不同比例稀釋，然后用超微量分光光度計測定其濃度。反轉(zhuǎn)錄過程中，首先65 ℃預變性5 min，以提高后續(xù)反轉(zhuǎn)錄效率。將變性后的RNA樣品與5X RT Buffer、RT Enzyme Mix、Primer Mix和Nuclease-free Water配置成20 μL的反轉(zhuǎn)錄反應體系，混勻后放置于梯度PCR儀中進行反轉(zhuǎn)錄反應。

1.4 Real-Time PCR

斑馬魚β-actin(內(nèi)參)、HPG軸和HPA軸的相關功能基因(19、2、3、-、-和-基因；、、2、、和基因)的引物序列來自于相關文獻報道，詳見表1。

表1 PCR所用基因的引物序列

根據(jù)實時熒光定量試劑盒(德國DBI生物科技公司)中操作步驟，將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA樣本與相應基因上下游引物、Bestar SybrGreen qPCR mastermix和無菌ddHO配成20 μL的RT-qPCR反應體系，混勻后，放到實時熒光定量PCR儀中對各基因進行擴增。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用2法對RT-qPCR反應后獲得的Cq值進行分析，運用Excel 2016分析計算各目的基因mRNA的相對表達量。然后再利用SPSS 13.0軟件進行One-Way ANOVA分析，并用最小顯著差數(shù)法(LSD法)分析對照組和處理組之間的差異。若<0.05，則表示差異顯著；<0.01，則表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 DEHP對斑馬魚早期發(fā)育階段HPG軸相關基因表達的影響

DEHP對斑馬魚早期生命階段生殖軸的相關功能基因(19、2、3、-、-和-基因)表達影響的RT-qPCR結果見圖1。與垂體相關的芳香化酶基因19、下丘腦相關的促性腺激素釋放激素基因3、垂體相關的雌激素受體基因-和-在DEHP質(zhì)量濃度為30 μg/L時表達量顯著升高，依次升高了116%、191%、132%和267%；下丘腦相關的促性腺激素釋放激素基因2在各DEHP處理組表達量顯著升高，依次升高了82%，208%和91%。垂體中的卵泡刺激素基因-在各DEHP處理組表達量無顯著差異。以上結果表明，DEHP顯著升高了斑馬魚早期生命階段HPG軸的相關功能基因的表達。

圖1 DEHP對斑馬魚仔魚HPG軸的相關基因表達的影響(n=5)

2.2 DEHP對斑馬魚早期發(fā)育階段HPA軸相關基因表達的影響

DEHP對斑馬魚早期生命階段腎上腺軸的相關功能基因(、、2、、和基因)表達影響的RT-qPCR結果見2。HPA軸的相關功能基因(基因除外)在各DEHP處理組表達量顯著降低，其中，下丘腦和垂體相關的阿黑皮素原基因依次降低了68%、68%和55%，垂體中鹽皮質(zhì)激素受體基因依次降低了75%、78%和57%，腎上腺中的黑素腎上腺皮質(zhì)激素2受體基因2依次降低了46%、79%和55%，下丘腦中的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素基因依次降低了76%、82%和65%，垂體中的糖皮質(zhì)激素受體基因依次降低了52%、54%和72%。垂體中的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素結合蛋白基因在各DEHP處理組表達量無顯著差異。以上結果表明，DEHP顯著降低了斑馬魚早期生命階段HPA軸的相關功能基因的表達。

圖2 DEHP對斑馬魚仔魚HPA軸的相關基因表達的影響(n=5)

3 討論

魚類生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)控主要就是通過魚類的HPG軸完成，主要過程為：首先由下丘腦依據(jù)機體生理功能的需要釋放不同類型的促性腺激素釋放激素(GnRHs)作用于魚類的垂體的相應部位上，后者通過合成并釋放促性腺激素(GTH)作用于性腺，進而有效調(diào)控魚類的生殖。魚類的促性腺激素依據(jù)功能的不同又可分為促黃體素(LH)和促卵泡激素(FSH)。19、-和-是生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)中性激素合成相關功能基因，主要是在性腺和腦中表達。由于DEHP代謝產(chǎn)物結構與內(nèi)源性雌激素具有一定的相似性，因此，通過測定HPG軸的相關功能基因表達量可探討DEHP對斑馬魚早期生命階段生殖內(nèi)分泌干擾的分子機制。

2和3是促性腺激素釋放激素家族中的重要成員，其中3僅魚類中發(fā)現(xiàn)。2和3對魚類生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)起重要作用，其靶器官為垂體，通過2和3的合成與釋放來調(diào)控垂體中FSH和LH的合成與釋放，進而抑制或促進性腺激素的合成與釋放。本研究中，DEHP處理組的2和3表達量上升，這可能會導致性激素的合成發(fā)生改變。19是芳香化酶，是細胞色素p450中的一種，在魚類生殖內(nèi)分系統(tǒng)中主要作用是催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，在雌激素的合成中起到關鍵作用。在本研究中，與對照組相比，30 μg/LDEHP處理組19表達量顯著性升高，這可能會導致E2/11KT比例增加。ERs是與雌激素特異性結合的受體分子，二者的結合是雌激素生理作用發(fā)揮的前提，進而調(diào)控生物體生殖等生理過程。本研究中，-和-的表達量在30 μg/LDEHP處理組顯著性升高，進一步表明了DEHP能夠?qū)е掳唏R魚胚胎/仔魚E2/11KT比例增加。另有研究表明，HPG軸和HPT軸間存在著交互作用，賈盼盼的研究報道了DEHP增加了斑馬魚胚胎/仔魚HPT軸和TH濃度相關基因的表達。因此，DEHP也有可能通過HPT軸間接作用于HPG軸從而導致HPG軸的相關功能基因的表達。以上這些結果表明，DEHP不僅可以直接作用于斑馬魚胚胎/仔魚的HPG軸，也可間接作用于HPG軸，影響其相關功能基因的表達，從而干擾魚類的生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)。

HPA軸是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要組成部分，下丘腦受到刺激會分泌促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(Crh)，Crh可以誘導垂體釋放促腎上腺皮質(zhì)激素(Acth)，進而作用于腎上腺皮質(zhì)合成糖皮質(zhì)激素(主要是皮質(zhì)醇)；Crh還可促使Acth的前體阿黑皮素原(Pomc)水解。Acth也可作用于黑素腎上腺皮質(zhì)激素2受體(Mc2r)，加速腎上腺糖皮質(zhì)激素的合成和分泌。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素結合蛋白(Crhbp)能夠與Crh結合使其失活，從而影響機體的內(nèi)分泌。鹽皮質(zhì)激素受體基因()和糖皮質(zhì)激素受體基因()都屬于類醇激素受體,是HPA軸負反饋的主要調(diào)控者。目前，關于DEHP對斑馬魚HPA軸的影響的研究尚未被報道。本研究中，斑馬魚胚胎暴露于DEHP 4 d之后，、、、2和基因表達水平在DEHP處理組顯著降低，說明在DEHP的刺激下，斑馬魚下丘腦基因的表達量下降，其誘導垂體釋放的Acth下降，同時，的下降也促使Acth的前體Pomc水解，進而反饋于Pomc，使基因轉(zhuǎn)錄水平下降。另外，下降的Acth調(diào)節(jié)Mc2r的合成，致使2基因表達的降低，進而影響腎上腺糖皮質(zhì)激素的合成和分泌。DEHP的刺激也抑制了斑馬魚和基因的表達量，下降的和也會負反饋調(diào)控HPA軸。有研究顯示，化學物質(zhì)可以通過降低斑馬魚體內(nèi)E2的濃度來降低皮質(zhì)激素的濃度，而本研究的結果顯示DEHP可能會增加斑馬魚體內(nèi)的E2的濃度，這表明DEHP對斑馬魚早期生命階段的HPA軸的影響并沒有通過對HPG軸的影響而間接作用于HPA軸，可能是通過直接作用于HPA軸而引起的。

4 結論

通過DEHP對斑馬魚的胚胎/仔魚階段的暴露實驗發(fā)現(xiàn)，DEHP導致HPG軸上相關基因顯著上調(diào)，HPA軸上相關基因顯著下調(diào)。這表明DEHP對斑馬魚胚胎/仔魚階段的2個主要內(nèi)分泌分子通路的影響將會導致內(nèi)分泌功能的改變，從而可能影響斑馬魚的后期生長發(fā)育。