米曲霉發(fā)酵廚余垃圾制備富酶產(chǎn)物的研究

賈 璇，郭 萌，冶榮霞，李 輝，李雪琪，劉曉佩，李鳴曉，戴 昕

1. 北京工商大學(xué)，中國輕工業(yè)清潔生產(chǎn)和資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048

2. 北京工商大學(xué)，國家環(huán)境保護(hù)食品鏈污染防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048

3. 中國環(huán)境科學(xué)研究院，環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100012

4. 南京萬德斯環(huán)?？萍脊煞萦邢薰?，江蘇 南京 211100

廚余垃圾是指居民日常生活和學(xué)校、公司等單位供餐，以及餐飲服務(wù)等活動(dòng)中產(chǎn)生的有機(jī)垃圾，在生活垃圾中占比為49.4%~64.5%. 廚余垃圾具有高油脂、高含水率、高有機(jī)質(zhì)和高鹽分“四高”屬性，并且含有多種微量元素，易腐敗和滋生細(xì)菌. 隨著我國垃圾分類政策的實(shí)施，廚余垃圾產(chǎn)量劇增，據(jù)報(bào)道，2020年我國廚余垃圾產(chǎn)量已達(dá)到1.2×10t. 廚余垃圾的高值化利用迫在眉睫，其中生物處理因其條件溫和、產(chǎn)物可控，成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn). Dienye等利用水果廢棄果皮和黑曲霉的遺傳特性菌株白化金藻()生產(chǎn)檸檬酸，發(fā)現(xiàn)白化金藻適合培養(yǎng)黑曲霉，具有較大的檸檬酸生產(chǎn)潛力，并可減少農(nóng)業(yè)環(huán)境污染. Jurado等研究認(rèn)為，接種菌劑可以強(qiáng)化在處理過程中整個(gè)微生物系統(tǒng)的生長及活性. Kwan等研究表明，真菌水解發(fā)酵干酪乳桿菌是將餐廚垃圾轉(zhuǎn)化為乳酸的有效途徑.

在廚余垃圾生物處理過程中，菌株的選取至關(guān)重要. 米曲霉分泌的豐富酶系能有效降解淀粉及蛋白質(zhì)原料，為其他微生物的生長代謝奠定基礎(chǔ). 目前，米曲霉已應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域，但在有機(jī)廢棄物資源化領(lǐng)域的研究剛剛起步. Mamo等發(fā)現(xiàn)，利用米曲霉產(chǎn)凝乳蛋白酶可提高丹伯干酪的生產(chǎn)率. Miyazawa等證明，半乳糖氨基半乳聚糖和α-1,3-葡聚糖都有助于米曲霉菌絲在液體培養(yǎng)中的聚集. 汪剛慧將米曲霉接種到餐廚垃圾中生產(chǎn)水解酶，利用生物酶強(qiáng)化污泥厭氧消化. Pleissner等在泡盛曲霉和米曲霉的深層發(fā)酵中，獲得了富含葡萄糖、磷酸鹽的水解產(chǎn)物. Pengthamkeerati等以木薯、甘蔗渣和污泥為培養(yǎng)基，接種米曲霉TISTR 3 605進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生α-淀粉酶. Balakrishnan等用食用油餅固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化了酸堿度、培養(yǎng)時(shí)間和溫度的條件，從而提高了米曲霉生產(chǎn)α-淀粉酶的速率.

目前，對(duì)米曲霉的研究僅局限于食品加工、生長特性、污泥的厭氧消化和富含營養(yǎng)物質(zhì)的水解產(chǎn)物等方向，對(duì)于不同米曲霉的生長特性和產(chǎn)酶規(guī)律尚有待研究. 因此，該研究以廚余垃圾為底物，通過對(duì)比兩株米曲霉的生長特性及其好氧發(fā)酵過程中的產(chǎn)酶規(guī)律，旨在為廚余垃圾高值化利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

廚余垃圾

廚余垃圾取自北京某大學(xué)食堂，將廚余垃圾中的骨頭、果核等大塊雜質(zhì)分揀出后，用粉碎機(jī)勻漿，過20目(0.85 mm)篩后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆? 廚余垃圾基本理化指標(biāo)如表1所示.

表 1 廚余垃圾基本理化指標(biāo)Table 1 Basic physical and chemical indexes of kitchen waste

米曲霉

所用米曲霉CGMCC3.4427 (簡稱“米曲霉C”)購于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，米曲霉BNCC142787 (簡稱“米曲霉B”)購于北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

米曲霉孢子液制備

將平板培養(yǎng)的米曲霉收集至無菌瓶中，用無菌水稀釋100倍后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，利用稀釋平板?jì)數(shù)法測(cè)得米曲霉B、米曲霉C的孢子懸浮液的濃度分別為90、85個(gè)/mL.

生長條件優(yōu)化

分別取米曲霉B和米曲霉C的孢子懸浮液5 mL接種到100 mL液體培養(yǎng)基(葡萄糖2%、蛋白胨1%、KHPO0.1%、MgSO0.05%、NaCl 0.05%)中，于38 ℃、120 r/min下培養(yǎng)，每隔24 h取出2 mL液體培養(yǎng)基，用濾紙過濾后將真菌菌絲體烘干后稱量，以菌絲體干質(zhì)量為縱坐標(biāo)、培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制米曲霉的生長曲線.

采用察氏固體培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h后進(jìn)行形態(tài)觀察，探究米曲霉B和米曲霉C在不同溫度(20、30、40、50 ℃)和pH(5、6、7)條件下的生長特性.

米曲霉酶源制備

接種米曲霉孢子懸浮液，研究不同培養(yǎng)方式(靜置、振蕩)和培養(yǎng)溫度(30、35、40 ℃)對(duì)兩株米曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶活性的影響. 為保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性且獲得更好的富酶產(chǎn)物，通過滅菌方式開展研究，避免土著生物的干擾.

設(shè)計(jì)10組試驗(yàn)，每組設(shè)3個(gè)平行. 每個(gè)錐形瓶內(nèi)稱取50 g破碎后的廚余垃圾，初始pH調(diào)至6，高溫滅菌并冷卻至室溫后，各接種1 mL米曲霉B、米曲霉C的孢子懸浮液，加入1 mL無菌水混合培養(yǎng)，每隔24 h取樣測(cè)定指標(biāo). 試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示.

表 2 廚余垃圾酶源制備試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Experimental design of preparation of enzyme source from kitchen waste

1.3 分析方法

總固體(TS)含量和揮發(fā)性固體(VS)含量采用恒重法測(cè)定；蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測(cè)定；淀粉含量、溶解性碳水化合物含量分別采用酸水解法和蒽酮法進(jìn)行測(cè)定；pH使用pH計(jì)測(cè)量；蛋白酶、淀粉酶活性分別采用微生物蛋白水解酶、淀粉水解酶ELISA試劑盒測(cè)定.

2 結(jié)果與分析

2.1 米曲霉的生長特性分析

米曲霉生長曲線

絲狀真菌類的微生物與細(xì)菌類的微生物不同，其菌體的生長主要由菌絲體的延伸完成. 米曲霉B和米曲霉C在察氏培養(yǎng)基中的生長曲線如圖1所示，結(jié)果表明，兩株米曲霉的生長曲線均分為對(duì)數(shù)期(0~48 h)、穩(wěn)定期(48~96 h)和衰亡期(96~120 h). 在培養(yǎng)初期，米曲霉逐漸適應(yīng)環(huán)境開始生長，培養(yǎng)液中出現(xiàn)肉眼可見的菌絲，隨后菌絲體生長速率加快，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，菌絲開始不斷地增長和增厚，菌液中開始出現(xiàn)黏液狀菌絲，72 h后米曲霉進(jìn)入生長衰亡期，由于菌絲體自溶，菌絲體干質(zhì)量開始減少. 張曉琦發(fā)現(xiàn)，在pH為5、溫度為35 ℃、轉(zhuǎn)速為140 r/min、56 h條件下米曲霉生長曲線也呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì). 試驗(yàn)結(jié)果顯示，米曲霉B和米曲霉C的干質(zhì)量分別在72和48 h達(dá)到最大值，分別為0.120和0.111 g.

圖 1 兩種米曲霉的生長曲線Fig.1 Growth curve of two Aspergillus oryzae

米曲霉形態(tài)特征

每種真菌都有最適合其生長的溫度，且pH直接影響細(xì)胞外酶的活性和微生物的代謝. 米曲霉B和米曲霉C在不同溫度(20、30、40、50 ℃)和pH(5、6、7)條件下培養(yǎng)72 h后的形態(tài)特征分別如圖2、3所示. 米曲霉在察氏固體培養(yǎng)基上形成菌落較快，培養(yǎng)初期生出孢子，初為嫩黃色，繼而轉(zhuǎn)到黃綠色，米曲霉的生長可分為3個(gè)階段：孢子發(fā)芽期、菌絲生長期、產(chǎn)孢子期.

由圖2、3可見，在20 ℃下，米曲霉B和米曲霉C生長緩慢；在30和40 ℃、培養(yǎng)72 h下，米曲霉B、米曲霉C的生長速率在pH為6時(shí)生長最佳，其中40 ℃下的生長速率快于30 ℃；在50 ℃、培養(yǎng)72 h下，米曲霉B和米曲霉C分別在pH為5、6的條件下有菌絲體產(chǎn)生，其余pH下米曲霉不生長. 米曲霉B和米曲霉C菌株在培養(yǎng)后期呈黃綠色，其中米曲霉B顏色偏綠，菌絲較長，容易結(jié)塊，孢子多；米曲霉C顏色偏黃，菌絲較短，結(jié)塊較少，孢子較多.

圖 2 米曲霉B在不同溫度和pH下的生長情況Fig.2 Growth of Aspergillus oryzae B under different temperatures and pH conditions

圖 3 米曲霉C在不同溫度和pH下的生長情況Fig.3 Growth of Aspergillus oryzae C under different temperatures and pH conditions

由米曲霉的形態(tài)分析可知，米曲霉的菌絲體由分割的分枝菌絲所構(gòu)成，從菌絲體中生出分生孢子，孢子均呈圓形. 相對(duì)于其他情況，兩株米曲霉分別在30 ℃和40 ℃、pH為6時(shí)生長最好，米曲霉B生長速率較快，產(chǎn)孢子較早.

2.2 不同培養(yǎng)方式對(duì)米曲霉產(chǎn)酶的影響

在米曲霉培養(yǎng)過程中，不同培養(yǎng)方式對(duì)米曲霉菌絲體的形成、形態(tài)和發(fā)酵產(chǎn)酶都有一定影響. 因此，探究在靜置培養(yǎng)與振蕩培養(yǎng)下米曲霉的產(chǎn)酶效果，選取A-1、A-2、A-3、A-4處理組進(jìn)行分析.

培養(yǎng)方式對(duì)蛋白酶活性的影響

蛋白酶活性是表征廚余垃圾固態(tài)發(fā)酵酶源制備過程中酶活變化的重要參數(shù)，蛋白酶是催化其他蛋白質(zhì)中肽鍵水解的一大類酶，可高效快速水解廚余垃圾中的蛋白質(zhì)，將其轉(zhuǎn)化為游離氨基酸.

如圖4所示，在38 ℃下靜置培養(yǎng)的A-1組以及振蕩培養(yǎng)的A-3組中蛋白酶活性均呈上升-下降-

圖 4 不同培養(yǎng)方式下米曲霉產(chǎn)蛋白酶活性隨時(shí)間的變化情況Fig.4 Changes of protease activity of Aspergillus oryzae in different culture methods with tim

上升的趨勢(shì). 米曲霉菌絲適應(yīng)新環(huán)境時(shí)吸收充足營養(yǎng)，新陳代謝加快，分泌大量酶. 在24 h時(shí)，A-1、A-3組的蛋白酶活性分別為50.30、53.65 U/g，可以得出，轉(zhuǎn)速影響霉菌菌絲體的形成及形態(tài)，振蕩(120 r/min)培養(yǎng)下米曲霉B的蛋白酶活性高于靜置培養(yǎng)；在24~96 h內(nèi)，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，A-1、A-3組的蛋白酶活性達(dá)到一定值后呈下降趨勢(shì)，96 h時(shí)分別降至33.05、19.99 U/g，可能是因?yàn)闋I養(yǎng)物的耗盡和大量代謝廢物的產(chǎn)生，形成了大量的休眠孢子，最終降低了酶的活性；96~120 h內(nèi)蛋白酶活性升高，120 h時(shí)分別升至45.99、63.85 U/g.

在38 ℃下靜置培養(yǎng)的A-2組以及振蕩培養(yǎng)的A-4組的蛋白酶活性在0～48 h內(nèi)呈上升趨勢(shì)，48 h時(shí)分別升至79.19、92.57 U/g，A-4組的蛋白酶活性高于A-2組，48 h時(shí)達(dá)到第1個(gè)峰值，原因可能是振蕩培養(yǎng)的方式能夠更好地使廚余垃圾與米曲霉充分接觸，混合均勻，故能更好地促進(jìn)米曲霉的菌體生長，進(jìn)而促進(jìn)其孢子增殖，可以推斷，振蕩培養(yǎng)可以提高米曲霉的產(chǎn)酶速率；在48～72 h內(nèi)，A-2、A-4組的蛋白酶活性呈下降趨勢(shì)，由于蛋白酶的不斷溶出，環(huán)境內(nèi)酶量達(dá)到環(huán)境容納量(值)使其競(jìng)爭(zhēng)加強(qiáng)，酶活性下降. 在72～96 h內(nèi)，A-2、A-4組中蛋白酶活性升高，在96 h時(shí)達(dá)到第2個(gè)峰值(109.65 U/g)，可能是因?yàn)椋浊狗€(wěn)定生長且廚余垃圾中的營養(yǎng)物質(zhì)還未消耗盡，隨著時(shí)間的延長，米曲霉繼續(xù)吸收環(huán)境內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)蛋白酶溶出. 由此可見，振蕩培養(yǎng)可加強(qiáng)米曲霉菌絲體的形成和生長速率，加快其繁殖，促進(jìn)酶分泌，使米曲霉B和米曲霉C的蛋白酶活性分別提高26.94%、38.46%，明顯優(yōu)于靜置培養(yǎng).

培養(yǎng)方式對(duì)淀粉酶活性的影響

淀粉酶活性是表征廚余垃圾酶源制備過程酶活變化的主要參數(shù)，淀粉酶可將淀粉和糖原轉(zhuǎn)化為單糖或低聚糖等可發(fā)酵性糖，為米曲霉及其他微生物提供碳素營養(yǎng)，淀粉酶活性的增加可以使發(fā)酵過程中微生物獲得更多的碳源，促進(jìn)碳代謝.

由圖5可見，在0~24 h內(nèi)，A-1、A-2、A-3、A-4組的淀粉酶活性均上升，其中A-2組數(shù)值最大，為84.07 U/g；在24~48 h內(nèi)，A-1、A-3組的淀粉酶活性繼續(xù)上升，A-2、A-4組的淀粉酶活性呈下降趨勢(shì)，在48 h時(shí)，A-1、A-3組的淀粉酶活性分別為64.98、52.64 U/g，由于米曲霉C生長較快，產(chǎn)生孢子較早，產(chǎn)酶快，分解速率快，這兩組的淀粉酶活性低于A-2、A-4組，可見，無論是振蕩培養(yǎng)還是靜置培養(yǎng)，米曲霉B的淀粉酶活性均低于米曲霉C；在48~72 h內(nèi)，4個(gè)處理組的淀粉酶活性均呈下降趨勢(shì)，表明隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，菌絲體不斷地?cái)嗔雅c溶解，新陳代謝速率減慢，使淀粉酶活性降低；在72~120 h內(nèi)，A-1、A-3、A-4組的淀粉酶活性呈上升趨勢(shì)，至120 h時(shí)，A-3組的淀粉酶活性達(dá)到最高值，為137.92 U/g. 綜上，在振蕩條件下，兩株米曲霉在廚余垃圾中產(chǎn)淀粉酶能力更強(qiáng)，淀粉酶活性分別提高54.65%、43.76%，反應(yīng)底物中有大量可利用的溶解性有機(jī)物質(zhì)，伴隨著微生物迅速繁殖充分吸收營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)而大量分泌淀粉酶，促使反應(yīng)體系中淀粉酶含量增加.

圖 5 不同培養(yǎng)方式下米曲霉產(chǎn)淀粉酶活性隨時(shí)間的變化情況Fig.5 Changes of amylase activity of Aspergillus oryzae in different culture methods with tim

2.3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)米曲霉產(chǎn)酶的影響

溫度是影響酶的重要因素之一. 較高的溫度會(huì)對(duì)微生物的代謝活動(dòng)產(chǎn)生一些不利影響，還會(huì)抑制真菌生長. 由節(jié)得出，在振蕩培養(yǎng)下兩株米曲霉的產(chǎn)酶活性優(yōu)于靜置培養(yǎng)，基于此，探究不同溫度(30、35、40 ℃)對(duì)米曲霉B和米曲霉C產(chǎn)酶的影響.

培養(yǎng)溫度對(duì)蛋白酶活性的影響

由圖6可見，在0~120 h內(nèi)，B-1、B-3、C-1、C-2、C-3組中的蛋白酶活性均呈上升-下降-上升-下降的趨勢(shì). 在0~24 h內(nèi)，兩種米曲霉進(jìn)入新環(huán)境發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，使蛋白酶活性均呈上升趨勢(shì)，且米曲霉B的蛋白酶活性在30 ℃時(shí)升至64.23 U/g；在24~48 h內(nèi)，隨溫度的升高，B-2、B-3、C-3組蛋白酶的催化速率增加，活性較高，且48 h時(shí)B-3組的蛋白酶活性(66.64 U/g)最佳；在48~72 h內(nèi)，B-1、C-1、C-2組蛋白酶繼續(xù)溶出，蛋白酶活性上升，B-2、B-3、C-3組蛋白酶活性下降，在72 h時(shí)C-2組蛋白酶活性升至63.55 U/g. 在72~120 h內(nèi)，B-2、C-3組蛋白酶活性呈先升后降的趨勢(shì)，且96 h時(shí)C-3組蛋白酶活性達(dá)到峰值(64.02 U/g)，米曲霉C蛋白酶活性在96 h時(shí)達(dá)到了穩(wěn)定期峰值. 隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，營養(yǎng)物逐漸耗盡，菌體自溶，菌體不再產(chǎn)生孢子，蛋白酶活性下降. B-1、B-3、C-2組蛋白酶活性呈下降趨勢(shì)，C-1組則呈先降后升的趨勢(shì).

圖 6 不同培養(yǎng)溫度下米曲霉B和米曲霉C產(chǎn)蛋白酶活性隨時(shí)間的變化情況Fig.6 Changes of protease activity of Aspergillus oryzae B and Aspergillus oryzae C with time at different culture temperatures

綜上，米曲霉B在40 ℃下培養(yǎng)48 h時(shí)蛋白酶活性(66.64 U/g)最高，米曲霉C在40 ℃下培養(yǎng)96 h時(shí)的蛋白酶活性(64.02 U/g)最高.

培養(yǎng)溫度對(duì)淀粉酶活性的影響

由圖7可見，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，B、C兩組淀粉酶活性均呈上升-下降-上升-下降的趨勢(shì)，分別降至99.10 U/g(B-1組)、99.41 U/g(B-2組)、101.68 U/g(B-3組)、106.33 U/g(C-1組)、105.43 U/g(C-2組)、96.57 U/g(C-3組). 0～120 h內(nèi)，B-1組在30 ℃下培養(yǎng)48 h時(shí)淀粉酶活性(129.44 U/g)達(dá)到最高；C-3組在40 ℃下培養(yǎng)96 h時(shí)淀粉酶活性(131.11 U/g)達(dá)到最高.

圖 7 不同培養(yǎng)溫度下米曲霉B和米曲霉C產(chǎn)淀粉酶活性隨時(shí)間的變化情況Fig.7 Changes of amylase activity of Aspergillus oryzae B and Aspergillus oryzae C with time at different culture temperatures

在0~48 h內(nèi)，由于米曲霉的快速生長和生長代謝活動(dòng)，淀粉酶活性迅猛增長. 48~72 h內(nèi)淀粉酶活性降低的原因可能是，隨著生長時(shí)間的延長，菌絲不斷溶解和斷裂. 72~96 h內(nèi)淀粉酶活性升高的原因可能是，雖然處于穩(wěn)定期，但也有部分米曲霉菌絲體產(chǎn)生，96~120 h，由于米曲霉進(jìn)入衰敗期，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的耗盡導(dǎo)致淀粉酶活性降低.

綜上，米曲霉B在30 ℃下培養(yǎng)48 h時(shí)淀粉酶活性達(dá)到最高，米曲霉C在40 ℃下培養(yǎng)96 h時(shí)淀粉酶活性達(dá)到最高. 但從整個(gè)淀粉酶活性周期綜合來看，米曲霉B的淀粉酶活性高于其他各組，故米曲霉B的淀粉酶活性優(yōu)于米曲霉C.

3 結(jié)論

a) 米曲霉B和米曲霉C分別在30 ℃和40 ℃、pH為6時(shí)生長速率最佳；與靜置培養(yǎng)相比，振蕩培養(yǎng)可使米曲霉B和米曲霉C的蛋白酶活性分別提高26.94%、38.46%；淀粉酶活性分別提高54.65%、43.76%. 可見，振蕩培養(yǎng)顯著加強(qiáng)米曲霉菌絲體的形成和生長速率，加快其繁殖，促進(jìn)淀粉酶和蛋白酶分泌，明顯優(yōu)于靜置培養(yǎng).

b) 廚余垃圾好氧發(fā)酵過程中，米曲霉B和米曲霉C產(chǎn)生蛋白酶與淀粉酶的潛在能力相當(dāng). 在120 r/min、40 ℃條件下，米曲霉B、米曲霉C的蛋白酶活性分別在48 h、96 h時(shí)達(dá)到最大，分別為66.64、64.02 U/g. 隨溫度的升高，蛋白酶催化的速率加快，活性升高，當(dāng)溫度過高時(shí)，酶活性受到抑制，同時(shí)隨著時(shí)間的延長，菌體不再產(chǎn)生孢子，導(dǎo)致活性下降；在120 r/min下，30 ℃培養(yǎng)48 h、40 ℃培養(yǎng)96 h時(shí)，米曲霉B、米曲霉C產(chǎn)淀粉酶活性分別達(dá)到最高，為129.44、

131.11 U/g.

c) 米曲霉B可在更溫和的條件下實(shí)現(xiàn)產(chǎn)酶，采用其好氧發(fā)酵廚余垃圾制備的富酶產(chǎn)物可以為目前廚余垃圾處理提供一種經(jīng)濟(jì)、可行、處理能效高的生物酶制劑，為廚余垃圾全量高值化利用提供技術(shù)支撐.