超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豆芽中的 尿素含量

吳基任，梁鳳雅，林 青，楊茲偉，魏 靜，梁曉涵

（海南省食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（熱帶果蔬質(zhì)量與安全），海南海口 570314）

豆芽，也稱豆芽菜，又名芽心、大豆芽、如意菜等，被譽(yù)為“活體蔬菜”。豆芽容易消化，中醫(yī)理論認(rèn)為豆芽具有清熱解毒、健脾養(yǎng)肝的作用。豆芽含有豐富的鈣、鐵、鉀、鋅等微量元素及多種維生素、纖維素，適量食用可以預(yù)防口角發(fā)炎、便秘。豆芽一般采用水浸泡發(fā)芽、無(wú)土栽培。但是無(wú)良商販在豆芽生產(chǎn)的過(guò)程中常施用尿素，以提升豆芽產(chǎn)量及縮短生產(chǎn)周期[1]。人如果長(zhǎng)期食用含有大量尿素的豆芽，會(huì)在體內(nèi)生成亞硝酸鹽，可能增加人體患癌的可能性[2]。上述栽培方法不可避免地會(huì)產(chǎn)生尿素殘留物，但沒(méi)有引起注意，因?yàn)槿藗兏嗟仃P(guān)注豆芽上的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（6-芐基腺嘌呤和4-氯苯氧乙酸）殘留[3]。

尿素是一種高水溶性的有機(jī)化合物，具有低急性毒性，半數(shù)致死量（LD50）為15 g·kg-1。尿素進(jìn)入人體后會(huì)刺激胃腸道，引起惡心、嘔吐和腹瀉，長(zhǎng)期或反復(fù)攝入尿素可能導(dǎo)致不良生殖影響和目標(biāo)器官損傷。此外，尿素溶于水中時(shí)產(chǎn)生的氨分子是一種具有高度刺激性和毒性的分子，大鼠的半數(shù)致死量（LD50）為350 mg·kg-1。尿素的分子結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯的發(fā)色團(tuán)和熒光團(tuán)，因此目前測(cè)定尿素的分析方法需要進(jìn)行衍生，否則很難克服來(lái)自復(fù)雜基質(zhì)的干擾[4-5]。由于尿素是極性分子，在反相色譜中與樣品基質(zhì)中其他極性化合物的分離分辨率較低[6]，而在質(zhì)譜檢測(cè)中也不可避免地存在較強(qiáng)的基質(zhì)干擾或離子抑制[7]。研究表明，親水相互作用色譜法在極性化合物的分離中具有較高的分辨率[8-9]，為尿素反相色譜測(cè)定中遇到的問(wèn)題提供了解決方案。因此，本文研究了親水相互作用色譜-質(zhì)譜法測(cè)定尿素的可行性，并將該方法應(yīng)用于測(cè)定豆芽中的尿素含量。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品分為兩部分：一部分為自培，共16 批；另一部分樣品為課題組從農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買的豆芽，共16批。所有的樣品在采收或購(gòu)買當(dāng)天均按照GB 2763—2021 的規(guī)定進(jìn)行取樣，取得的樣品將其切碎，置于組織搗碎機(jī)內(nèi)搗碎勻漿，放入聚四氟乙烯瓶中，于 -18 ℃條件下保存直至測(cè)定。

1.2 儀器與試劑

Nexera X2 超高效液相（日本島津公司）；TRIPLE QTRAP 5500 三 重 四 極 桿 質(zhì) 譜 儀（ 美 國(guó)SCIEX 公司）；MS 3 digital 振蕩器（德國(guó)艾卡公司）；Centrifuge 5804R 高速離心機(jī)（德國(guó)艾本德公司）；DTA-33 超聲波提取器（湖北鼎泰恒勝公司）；Autovap S60 氮吹儀（美國(guó)ATR 公司）；XS-204 電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Simpliclty超純水制備儀（美國(guó)密理博公司）；陶瓷均質(zhì)子（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；ACQUITY UPLC BEH Amide 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），美國(guó)沃特斯公司）；0.22 μm 聚四氟乙烯微孔濾膜（天津領(lǐng)航實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；甲酸銨（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；尿素標(biāo)準(zhǔn)品（廣州佳途科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

尿素標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液：準(zhǔn)確稱取50 mg（精確到 0.1 mg）尿素標(biāo)準(zhǔn)品，加7.5 mL 去離子水溶解，用乙腈定容至50 mL，配制成1 mg·mL-1的尿素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，轉(zhuǎn)移到50 mL 棕色螺紋瓶，密封存貯于 -20 ℃冰箱中。

尿素標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確移取適量尿素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈-水（85 ∶15，V/V）溶液配制成1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品處理

準(zhǔn)確稱取2 g（精確至0.001 g）樣品于50 mL的具塞聚四氟乙烯離心管中，加入20 mL 乙腈-水（85 ∶15，V/V），2 粒陶瓷均質(zhì)子，超聲處理 5 min。在10 000 r·min-1下離心5 min，移取上清液至50 mL 容量瓶中，殘?jiān)俅渭尤?0 mL 乙腈-水（85 ∶15，V/V）重復(fù)提取一遍，合并上清液，最后用乙腈-水（85 ∶15，V/V）定容混勻，過(guò)0.22 μm 尼龍濾膜，上LC-MS/MS 測(cè)定。

1.3.3 尿素標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

使用1.3.2 處理方法獲得空白基質(zhì)液，將尿素標(biāo)準(zhǔn)工作液配制成系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 儀器分析條件

（1）色譜條件。色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Amide（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈 -0.5% 甲酸銨水溶液（85 ∶15，V/V），等度洗脫；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

（2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子（Electrospray Ionization，ESI）源；掃描模式：正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；碰撞氣：氮?dú)?；電噴霧電壓：4.0 kV；離子源溫度：300 ℃； 霧化 氣（Nebulizer Gas，GS1）：50 psi； 加熱 氣（Heating Gas，GS2）： 50 psi；氣簾氣（Curtain Gas，CUR）：20 psi；碰撞室入口電壓（Entrance Potential，EP）：10 V；碰撞室出口電壓（Collision Cell Exit Potential，CXP）： 16 V；優(yōu)化后的MRM 參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 液相、質(zhì)譜條件優(yōu)化

由于尿素是一種高極性的有機(jī)分子，它在經(jīng)典反相柱上的保留效果很差，無(wú)法與基質(zhì)峰進(jìn)行有效的分離。在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中，對(duì)Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm）、ACE Excel 3 C18（100 mm×2.1 mm，3 μm）和Phenomenex Kinetex XB-C18（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm）等反相柱進(jìn)行了測(cè)試；在所有被測(cè)試的反相柱上都觀察到了強(qiáng)烈的離子抑制和基質(zhì)效應(yīng)，這歸因于極性化合物的過(guò)早洗脫。最后，為了更好地保留被分析物以達(dá)到預(yù)期的分離效果，以ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色 譜柱（氨基色譜柱），乙腈-0.5%甲酸銨水為流動(dòng)相的親水相互作用色譜被成功地應(yīng)用于目標(biāo)化合物的分析。采用乙腈-0.5%甲酸銨水（85 ∶15，V/V）為流動(dòng)相，尿素的保留時(shí)間為2.01 min，每個(gè)樣品的運(yùn)行時(shí)間在5 min 以內(nèi)。

評(píng)估了在正負(fù)離子掃描模式下使用電噴霧電離（ESI）的可能性，結(jié)果表明，ESI 在正離子掃描模式下可以為分析物提供更高的MS 響應(yīng)靈敏度和穩(wěn)定性，從而提高了分析的性能。因此，本研究選擇了ESI 正離子模式。

2.2 方法特異性研究

通過(guò)對(duì)不同來(lái)源（自培、外購(gòu)）豆芽樣品的分析，確定了該方法的特異性，以評(píng)估可能的基質(zhì)干擾。對(duì)樣品前處理和儀器色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，以保證尿素保留時(shí)間不受干擾。結(jié)果表明，分析物的保留時(shí)間沒(méi)有受到干擾，見(jiàn)圖1。

圖1 樣品MRM 質(zhì)譜圖

2.3 線性范圍、檢出限、定量限、精密度

按1.3.4 的工作條件，對(duì)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線（10 ng·mL-1、25 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、500 ng·mL-1和1 000 ng·mL-1）進(jìn) 行 測(cè)定，以定量離子峰的峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)質(zhì)量濃度（ng·mL-1）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，校正方程為y=480.078 2x-9 826.133 08，回歸相關(guān)系數(shù)r＞0.998。通過(guò)對(duì)空白基質(zhì)連續(xù)添加標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，直到定量離子m/z=44.1 的SIM 峰值的信噪比達(dá)到3 ∶1 及10 ∶1 來(lái)確定方法的檢出限和定量限。方法的檢出限為0.1 mg·kg-1，定量限為0.3 mg·kg-1?！冻隹诠揞^食品中尿素殘留量的測(cè)定》（SN/T 1004—2013）[10]規(guī)定尿素定量限為1 mg·kg-1，本方法的定量限低于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法。用質(zhì)量濃度為20 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)行重復(fù)測(cè)定6 次，該方法的RSD（n=6）為3.4%。實(shí)驗(yàn)表明本方法的線性、重復(fù)性、檢出限滿足《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）[11]的相關(guān)要求。

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

將適量尿素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液添加到空白樣品，進(jìn)行1 mg·kg-1、5 mg·kg-1、10 mg·kg-13 個(gè) 水 平（n=6）加標(biāo)回收試驗(yàn)，平均回收率為86.1%～97.1%，方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%～6.5%，結(jié)果表明方法具有較高的精密度及重現(xiàn)性。

2.5 樣品測(cè)定

通過(guò)該方法對(duì)自培及農(nóng)貿(mào)采購(gòu)的32 批豆芽菜樣品進(jìn)行測(cè)定分析，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2 中可以看出所有樣品均有檢出尿素，使用SPSS 對(duì)自主栽培及農(nóng)貿(mào)采購(gòu)的豆芽樣品中尿素的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)自培及農(nóng)貿(mào)采購(gòu)兩組樣品之間的尿素含量沒(méi)有顯著性差異（P=0.664）。

表2 兩組樣品中尿素的檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究通過(guò)優(yōu)化樣品提取凈化條件和分離條件，建立了UPLC-MS/MS 法測(cè)定豆芽中尿素的方法。該方法前處理簡(jiǎn)單，具有較好的準(zhǔn)確度和靈敏性，定量限優(yōu)于現(xiàn)行有效的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。運(yùn)用該方法對(duì)自培、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)豆芽樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示所有的樣品均有檢出尿素，經(jīng)方差分析，自培及農(nóng)貿(mào)采購(gòu)兩組樣品之間的尿素含量沒(méi)有顯著性差異（P=0.664）。豆芽中的尿素有可能與豆芽生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的內(nèi)源性蛋白質(zhì)代謝有關(guān)[12]，這有待進(jìn)一步的研究以確定豆芽中尿素含量的本底值，為豆芽生產(chǎn)監(jiān)管提供科學(xué)的依據(jù)。