不同性狀脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)的制備及研究進(jìn)展

胡鈺玲 祁佐良

【提要】 近年來，組織工程作為一種新興的治療手段在整形和修復(fù)重建中的應(yīng)用越來越受到臨床和基礎(chǔ)研究的重視。然而，目前常見的支架存在可塑性低或生物相容性差等缺點(diǎn)，尋求一種理想的支架材料仍是目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。脂肪組織脫細(xì)胞外基質(zhì)（Decellularized adipose tissue，DAT）是指脂肪組織通過一系列脫細(xì)胞處理后得到的無細(xì)胞提取物，可模擬天然脂肪細(xì)胞外基質(zhì)的特性，具有良好的生物相容性及可調(diào)節(jié)性，有望作為新型的組織工程支架應(yīng)用于整形和修復(fù)重建等領(lǐng)域。本文將從DAT 的特點(diǎn)、不同性狀脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法及研究進(jìn)展等方面進(jìn)行綜述。

支架作為組織工程最主要的組成之一，不僅可以為細(xì)胞和生長(zhǎng)因子提供載體，還可以對(duì)細(xì)胞的黏附、增殖、分化等起到重要的調(diào)節(jié)作用。目前，應(yīng)用廣泛的支架主要分為兩類，一是人工合成的高分子支架，如聚乳酸及聚乳酸聚乙醇酸共聚物等；二是天然的生物類支架，如透明質(zhì)酸、膠原蛋白[1]、殼聚糖等[2]。前者生物相容性差，降解產(chǎn)物易使人體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致纖維包裹或表面皮膚潰瘍等不良后果，且合成的高分子支架制備工藝復(fù)雜，需通過交聯(lián)等手段添加生長(zhǎng)因子或蛋白質(zhì)以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)生物功能。后者雖有著良好的生物相容性和可降解性，但機(jī)械性能差且難以進(jìn)一步通過化學(xué)手段改性。因此，尋找一種新型組織工程支架是目前相關(guān)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。脂肪組織脫細(xì)胞外基質(zhì)（Decellularized adipose tissue，DAT）作為天然的組織成分，被認(rèn)為有著良好的生化特性，是新型生物支架的理想材料。本文聚焦于DAT 近幾年來的研究，對(duì)DAT 的特點(diǎn)和不同性狀脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法及研究進(jìn)展等進(jìn)行綜述。

1 脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)的特點(diǎn)

脂肪組織作為人體重要的構(gòu)成部分，在人體廣泛分布，來源豐富，獲取方便，臨床上吸脂手術(shù)后丟棄的脂肪組織更是脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)的豐富來源。脂肪組織在經(jīng)過反復(fù)的物理、化學(xué)或酶處理后，可有效去除含免疫原性的細(xì)胞成分，故具有較好的生物相容性，即使異體移植也幾乎不會(huì)產(chǎn)生組織排斥和過敏反應(yīng)[3-4]。此外，DAT 支架保留了細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）所擁有的天然結(jié)構(gòu)及膠原蛋白、層粘連蛋白和生長(zhǎng)因子等重要生物活性成分，相較于其他合成的高分子支架，更能模擬天然的組織微環(huán)境，且無需人為添加外源性生長(zhǎng)因子[5]。已有研究表明，DAT 不僅可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供良好的支持結(jié)構(gòu)和空間，還可以通過黏附、招募宿主的干細(xì)胞促進(jìn)脂肪和血管生成，相較于單純的脂肪組織移植，混合應(yīng)用同種異體脂肪的基質(zhì)進(jìn)行軟組織重建可以獲得更好的體積保留率[3，6-8]。同時(shí)，DAT 支架適應(yīng)力和可調(diào)節(jié)性極強(qiáng)，可以被制備成粉末、水凝膠、薄片等不同的物理形態(tài)和體積，或通過特殊手段改變其生物或物理性狀，從而滿足臨床的多種需求，是一種極具潛力的組織工程支架。

2 脫細(xì)胞基質(zhì)的制備

ECM 作為脂肪組織的重要結(jié)構(gòu)，具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)，且對(duì)細(xì)胞行為的調(diào)節(jié)具有關(guān)鍵作用[9-10]。理想的脫細(xì)胞技術(shù)是指在脂肪ECM 的基礎(chǔ)上進(jìn)一步去除所有細(xì)胞成分，在減少機(jī)體免疫排斥反應(yīng)的同時(shí)保留原始ECM 的結(jié)構(gòu)和組成完好無損。目前常用的脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法包括以下幾類。

2.1 物理法

脂肪組織通過反復(fù)的凍融循環(huán)、高速攪拌、機(jī)械切碎或研磨等方法可以有效破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，溶解細(xì)胞。在低溫中操作有助于保持DAT 支架的生物活性，使之在均質(zhì)化的同時(shí)不會(huì)對(duì)DAT 的微觀結(jié)構(gòu)和天然膠原纖維造成破壞。在制備過程中冷凍的溫度、DAT 溶液濃度和研磨時(shí)間等，均會(huì)對(duì)產(chǎn)物的性狀產(chǎn)生不同影響。較高的冷凍溫度和較低的DAT 濃度可提高支架的孔隙率并降低其黏度，而較低的溫度則會(huì)使支架產(chǎn)生較小的孔徑，這可能與加工過程中形成的冰晶大小有關(guān)[11-12]。研究表明，種子細(xì)胞的空間分布依賴于支架的孔徑大小，孔徑大的支架能允許更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣通過，細(xì)胞黏附力和分化能力通常較好，細(xì)胞分布也更為均勻，適合細(xì)胞生長(zhǎng)的三維支架孔徑一般為50～400 μm[13-14]。此外，DAT顆粒的尺寸可以通過增加或減少研磨時(shí)間來控制，增加研磨時(shí)間往往能獲得更小尺寸的DAT 顆粒，而相較于大尺寸的DAT 顆粒，較小尺寸的DAT 顆粒和較高密度的種子細(xì)胞被認(rèn)為更能刺激脂肪細(xì)胞的再生[15]。

2.2 化學(xué)法

一些低滲或高滲的溶液可以通過其滲透壓導(dǎo)致細(xì)胞裂解，破壞DNA 和蛋白質(zhì)之間的相互作用，但難以徹底清楚殘余的細(xì)胞碎片[16]。為了進(jìn)一步去除ECM 中的脂質(zhì)和細(xì)胞碎片，通常需用化學(xué)洗滌劑進(jìn)行清洗。這些洗滌劑大致分為離子型洗滌劑和非離子型洗滌劑兩類。前者包含月桂酰肌氨酸鈉、十二烷基硫酸鈉和脫氧膽酸鈉等，具有破壞蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間相互作用的能力，可用來進(jìn)一步破壞細(xì)胞膜，但可能會(huì)產(chǎn)生蛋白質(zhì)變性等不良結(jié)果，且后期難以徹底去除[5]。后者主要是指Triton X-100，是組織去細(xì)胞化中應(yīng)用最廣泛的非離子洗滌劑，可以干擾脂質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的相互作用，去除殘留的脂質(zhì)，對(duì)組織影響溫和，有助于保持組織的原始結(jié)構(gòu)和組成完整[17-18]。然而，再溫和的洗滌劑成分也不可避免地會(huì)對(duì)基質(zhì)成分產(chǎn)生破壞，特別是十二烷基硫酸鈉已被證明可以與ECM 相互作用，改變其結(jié)構(gòu)并顯著影響細(xì)胞的活性[19-20]。Morissette 等[11]于2018 年首創(chuàng)了一種無洗滌劑的脫細(xì)胞方式，既保持了脂肪ECM 的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和組成，又避免了殘留洗滌劑的相關(guān)細(xì)胞毒性，并能以凍干形式長(zhǎng)期儲(chǔ)存。此外，應(yīng)用異丙醇、乙醇、磷酸三丁酯或酸堿等有機(jī)溶劑進(jìn)行極性萃取，也可以進(jìn)一步溶解細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)成分，去除多余脂質(zhì)[8，18，21]。

2.3 生物酶消化法

目前常用的消化酶有脂肪酶、蛋白水解酶、核酸酶等。脂肪酶可用于去除DAT 中的殘留脂質(zhì)，但效率不及異丙醇[17，22]。胰蛋白酶作為最常用的蛋白水解酶通常與螯合劑乙二胺四乙酸合用，以進(jìn)一步分解細(xì)胞膜蛋白[23]。胰蛋白酶的特異性高，易被血清中和，長(zhǎng)時(shí)間孵育能更有效去除細(xì)胞成分，不易造成殘留，但也會(huì)在一定程度上破壞ECM，故需嚴(yán)格控制其作用時(shí)間[24]。核酸酶，如脫氧核糖核酸酶或核糖核酸酶，則能作用于磷酸二酯鍵，水解細(xì)胞中的核苷酸，達(dá)到降低產(chǎn)物免疫原性的作用，在去細(xì)胞化的過程中被常規(guī)使用[25-26]。

目前所報(bào)道的脫細(xì)胞方案均步驟繁瑣，且差異巨大。不同的去細(xì)胞方案可以顯著影響脫細(xì)胞基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生化特性，如何簡(jiǎn)化脫細(xì)胞方案并有目的性地控制DAT 的性能，使其能特異性地應(yīng)用于臨床，仍是目前亟需解決的難題和挑戰(zhàn)。

3 不同性狀脂肪脫細(xì)胞基質(zhì)的研究進(jìn)展

3.1 粉末狀/顆粒狀

Choi 等[27]將組織經(jīng)均質(zhì)化、離心、冷凍干燥、研磨等操作后制備得到粉末狀DAT。粉末狀DAT 可作為可注射支架通過細(xì)針注射，減少了侵入性外科手術(shù)的需求，以最大限度地減少患者在進(jìn)行軟組織缺損治療時(shí)產(chǎn)生的不適和感染、瘢痕形成等不良風(fēng)險(xiǎn)，減輕患者的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。其特殊的疏松質(zhì)地和多孔結(jié)構(gòu)極大增加了支架的表面積，有利于脂肪干細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)。將脂肪干細(xì)胞接種在粉末狀DAT 上注射入裸鼠體內(nèi)8 周后，可觀察到周圍血管生成及細(xì)胞內(nèi)的脂滴聚集，且支架無明顯吸收，證實(shí)了粉末狀DAT 在體內(nèi)能成功構(gòu)建出成熟的脂肪組織[28]。

3.2 片狀/泡沫狀

與粉末狀/顆粒狀不同，片狀/泡沫狀DAT 是具有二維或三維立體結(jié)構(gòu)的支架。將DAT 澆鑄在表面模具中冷凍干燥即可得到片狀DAT[29]。該支架能與人成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞成功整合，有望用于局部組織缺陷或損傷的治療[30]。Lee 等[31]使用DAT 片作為敷料，治療大鼠背部的全層皮膚傷口，結(jié)果顯示傷口愈合率、上皮形成率和微血管密度均顯著高于普通傷口敷料。由殼聚糖膜和DAT 薄片組成的雙層復(fù)合敷料不但可以誘導(dǎo)肉芽組織和表皮的再生，減少瘢痕形成，并具有優(yōu)異的抗菌能力[32]。此外，Dunne 等[33]利用圓片狀DAT 在體外建立了3D 環(huán)境下的乳腺癌細(xì)胞模型，為研究乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移/侵襲、形態(tài)和藥物反應(yīng)提供了更好的仿生環(huán)境。與片狀支架相比，泡沫狀支架更側(cè)重于提供一種三維結(jié)構(gòu)。Yu 等[12]使用α淀粉酶酶酶解DAT，并通過冷凍干燥后在模具內(nèi)溶解的技術(shù)和電噴霧兩種方式來制備疏松多孔的DAT 泡沫，作為軟組織再生和傷口愈合的生物支架。得益于特殊的3D 結(jié)構(gòu)，DAT泡沫可以支持宿主細(xì)胞的快速浸潤(rùn)，加快支架重塑和再吸收，使支架能更好地整合到宿主組織中，達(dá)到促進(jìn)血管和脂肪生成的目的。泡沫狀DAT 的適應(yīng)性強(qiáng)，可以根據(jù)所選的特定模具制造成各種幾何形狀。相較于原始的DAT，高度加工后的DAT 泡沫可以更有效地誘導(dǎo)體內(nèi)的血管生成，但同時(shí)加快了其再宿主體內(nèi)的降解速率，12 周便可被完全吸收[34]。

3.3 水凝膠

水凝膠具有高度多孔的結(jié)構(gòu)和可調(diào)節(jié)性，在軟組織工程化構(gòu)建中備受關(guān)注，粉末狀或顆粒狀的DAT 可經(jīng)胃蛋白酶消化，或進(jìn)一步與聚合物載體結(jié)合形成可注射的復(fù)合凝膠[35-36]。在小鼠體內(nèi)注射DAT 水凝膠后，無論是否種植了脂肪干細(xì)胞，自第2 周開始都可以觀察到脂肪生成的趨勢(shì)，且隨著時(shí)間的推移，該趨勢(shì)更加明顯[10]。研究發(fā)現(xiàn)，DAT 中所含的Ⅰ型膠原蛋白在合適的pH 和溫度下可以聚合形成水凝膠網(wǎng)，寡聚氨酯的加入可以適當(dāng)?shù)卣T導(dǎo)這種聚合，提高植入物的體積保留率，保持細(xì)胞活力并阻止成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)的收縮[37]。Tan等[38]發(fā)現(xiàn)，與聚N-異丙基丙烯酰胺混合制備的水凝膠具有熱敏性，可在體溫下自組裝。Jeon 等[39]進(jìn)一步證明了將聚N-異丙基丙烯酰胺和貽貝黏合蛋白摻入DAT 水凝膠中，可以靶向地向組織缺損部位遞送包封的干細(xì)胞，達(dá)到長(zhǎng)期促進(jìn)血管形成和脂肪誘導(dǎo)的作用。此外，DAT 水凝膠還可通過注射，用于增強(qiáng)癱瘓聲帶的聲功能[40]，或顯著增強(qiáng)股骨缺損小鼠的體內(nèi)骨再生[41]。

4 結(jié)論與展望

近年來，天然衍生的生物材料在一系列組織工程應(yīng)用中均顯示出巨大的前景。對(duì)于整形和修復(fù)重建等領(lǐng)域而言，一種可定向設(shè)計(jì)性狀的工程化的軟組織替代物具有重要價(jià)值。研究表明，軟組織填充物的機(jī)械性能尤為重要，顯著影響種子細(xì)胞的生物學(xué)反應(yīng)[42]。在理想狀態(tài)下，軟組織填充物應(yīng)該柔韌、富有彈性，能模擬周圍的天然組織，以最大限度地適應(yīng)機(jī)體環(huán)境，減少炎癥和瘢痕形成。

去細(xì)胞化的脂肪組織具有保存完好的三維結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能，與天然組織具有高度相似性，生物相容性好，能為脂肪干細(xì)胞的脂肪性分化提供良好微環(huán)境，在組織工程及大體積的軟組織重建中有著極大的應(yīng)用潛力?；蚝偷鞍踪|(zhì)研究表明，DAT 可以增強(qiáng)PPARγ 和CEBPα 等脂肪生成的主要調(diào)控基因和蛋白質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)，而無需額外添加外源性因子[23]。同時(shí)，DAT 所含的一些天然組分，如層粘連蛋白和纖連蛋白等，也早已被證實(shí)在器官發(fā)生和傷口愈合過程中起著至關(guān)重要的作用，為軟組織缺陷、皮膚傷口愈合、骨骼缺損等多種臨床疾病的治療提供了新的思路。除了在體內(nèi)臨床應(yīng)用外，DAT 在體外研究中也有潛在的用途。DAT 的仿生特性使其能夠非常接近地模擬體內(nèi)微環(huán)境，是一種理想的三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，可用于干細(xì)胞的體外培養(yǎng)，為生理學(xué)和疾病的研究提供支持。此外，DAT 支架具有強(qiáng)大的適應(yīng)性和可調(diào)控性，除了其本身固有的生化組成和結(jié)構(gòu)外，將原始DAT 進(jìn)一步交聯(lián)聚合不僅可以調(diào)控支架的降解速率，還可以使其獲得更優(yōu)良的力學(xué)特性和生物學(xué)特性，降低免疫反應(yīng)，提高對(duì)酶的抵抗性，更好地模擬天然脂肪組織[7，43-45]。生物材料的特性對(duì)脂肪組織工程至關(guān)重要，如何有目的性地選擇交聯(lián)劑以優(yōu)化DAT，以及改性后的DAT 支架在體內(nèi)是否具備穩(wěn)定性和安全性，仍需進(jìn)一步研究。近年來，3D 打印技術(shù)的出現(xiàn)使DAT 支架的三維結(jié)構(gòu)更加多樣化。Pati 等[46]開發(fā)了一種基于DAT 的新型生物墨水，可將種子細(xì)胞預(yù)先封裝于其中，用于在體外打印出具有脂肪生成或軟骨生成潛力的組織類似物。與3D打印技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用可以有目的地操控DAT 支架，使之具有特定形狀和結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)特定組織類型的形成，也可用于制作高保真的體外模型，用于細(xì)胞生物學(xué)、人體生理學(xué)或疾病病理學(xué)的研究。

目前所報(bào)道的這些脫細(xì)胞方案仍不成熟，操作流程繁瑣，成本高產(chǎn)量低，且制備過程中不可避免地需要用到一些對(duì)機(jī)體有刺激性的溶液，無法大規(guī)模應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)和臨床。如何優(yōu)化脫細(xì)胞策略，使其能在最短的處理時(shí)間內(nèi)最大程度地減少ECM 的宏觀變化，確保支架的長(zhǎng)期穩(wěn)定性和低免疫原性，是現(xiàn)階段研究的一大難點(diǎn)。另外，不同報(bào)道所采用的脫細(xì)胞方式均有不同，導(dǎo)致制備的DAT 組分及性狀也差異巨大。要實(shí)現(xiàn)DAT 工業(yè)化生產(chǎn)和大規(guī)模臨床應(yīng)用，當(dāng)務(wù)之急是標(biāo)準(zhǔn)化脫細(xì)胞化流程，建立DAT 的規(guī)范化評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。若能克服上述難點(diǎn)與挑戰(zhàn)，在未來我們有望根據(jù)宿主組織特定的物理和生化特性設(shè)計(jì)出特異性的DAT 支架，為整形和修復(fù)重建領(lǐng)域的發(fā)展開辟新的途徑。