適用于乳房組織工程的支架材料及制備工藝

祝旭龍 劉鑫淼 吳姝涵 李建輝

【提要】 乳房組織工程被認為是乳房重建的終極方案。乳房是特殊的軟組織，支架材料作為組織工程的三大要素之一，在乳房組織工程當中顯得尤為重要。理想的支架材料應(yīng)具備與目標組織相似的物理和生化特性，適宜的生物化學和物理環(huán)境，能夠調(diào)節(jié)種子細胞對特定組織工程要求的響應(yīng)。生物材料的特性（例如機械和化學功能性）影響細胞黏附、增殖和分化等行為，所以理想的支架應(yīng)具有良好的生物相容性，從而防止長期免疫反應(yīng)的發(fā)生。此外，良好的生物支架應(yīng)具備適宜的多孔結(jié)構(gòu)，以利于血管生成并為細胞的增殖分化提供營養(yǎng)物質(zhì)。以上與支架的材料選擇及制備工藝都有直接的關(guān)系，本文列舉了可用于乳房組織工程研究的支架材料，并根據(jù)乳房組織特性選擇相關(guān)制備工藝進行介紹。

乳腺癌是全球女性發(fā)病率最高的癌癥之一，且呈逐年升高的趨勢[1]。乳腺癌導致的乳房缺失或畸形，極大地影響了患者的身心健康和生活質(zhì)量。此外，乳腺葉狀腫瘤、肉芽腫性乳腺炎等良性乳腺病，也會造成患側(cè)乳房的較大缺損或畸形。以重建為目的的乳房組織工程，基于以上醫(yī)源性因素及較高的發(fā)生率，獲得了較高的關(guān)注度。由于人體對生物材料的各種反應(yīng)相當復雜，所以對材料的設(shè)計、選擇、改性、復合和制造等環(huán)節(jié)均是十分關(guān)鍵的，最終應(yīng)形成乳房組織相似甚至相同的三維結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和功能。天然高分子材料普遍生物特性好但機械性能低；人工合成高分子材料支架最主要的優(yōu)勢在于精確的可操控性，包括可以人為控制分子量、形狀、孔隙率、微細結(jié)構(gòu)、機械彈力強度等。然而，人工合成支架的降解產(chǎn)物可能導致局部環(huán)境的pH 值變化進而產(chǎn)生炎癥。同時，人工合成材料的質(zhì)地相對堅硬，與正常乳房組織存在差異，導致乳房重建術(shù)后愈合延遲和許多并發(fā)癥的發(fā)生[2]。來源于脂肪組織的脫細胞支架（Decellularization of adipose tissues，DAT）具有天然的優(yōu)勢，具備低免疫原性、良好的生物學性能及機械性能，可模擬天然細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，為種子細胞的黏附、生長、增殖提供了三維環(huán)境，具有促脂肪生長和促血管新生作用。目前的支架材料普遍難以生產(chǎn)較大體積的脂肪組織，難以同時實現(xiàn)脂肪組織結(jié)構(gòu)的正確模擬和血管通道網(wǎng)的系統(tǒng)集成[3]。

1 天然高分子材料

1.1 透明質(zhì)酸

1934 年，首次從牛眼玻璃體液中分離出一種新的糖胺聚糖[4]，即透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid，HA），具有優(yōu)異的生物特性。目前，HA 基支架以水凝膠、網(wǎng)片和海綿等形式被廣泛應(yīng)用于組織工程研究中[5-7]。有研究通過直接注射，將主要含有非動物源性的穩(wěn)定性透明質(zhì)酸（Non-animal stabilized hyaluronic acid，NASHA）醫(yī)用材料Macrolane 植入患者乳房進行安全性研究。結(jié)果表明，植入后雖能取得良好的美容效果，但受區(qū)發(fā)生紅腫、疼痛等不良反應(yīng)[8]。此外，直接注射HA進行乳房重建時，部分患者會產(chǎn)生乳房腫塊和皮下結(jié)節(jié)，不僅會降低美容效果，而且將干擾對影像結(jié)果的判斷而妨礙乳腺腫瘤的早診早治[9]。因此，單純可直接注射的HA 材料應(yīng)用于乳房重建的安全性及適用范圍亟待考究。目前最為常見的是利用HA 與理想的天然或人工材料復合改性，以達到取長補短的目的。Chang 等[10]制備的HA-明膠冷凍凝膠復合支架，具有高延展性、柔韌性佳的力學性質(zhì)，也具有高孔隙率、孔徑大、高溶脹比及親水性等理化性質(zhì)。體內(nèi)和體外試驗均表明該支架促進脂肪干細胞等成脂肪細胞黏附、增殖、分化，有利于脂肪組織的新生并促進血管化。雖然HA 來源的材料應(yīng)用于乳房重建并沒有較為成熟的研究及策略，但其具有高度生物相容性、黏附性、保水性及力學穩(wěn)定性，同時其來源豐富、價格低廉、易于加工，這些特性有利于工程化脂肪的構(gòu)建，有待于進一步的研究及改良。

1.2 殼聚糖

殼聚糖是通過甲殼素的脫乙?；@得的，甲殼素是甲殼類動物、軟體動物和昆蟲的外骨骼以及真菌的細胞壁上發(fā)現(xiàn)的一種聚合物，醫(yī)用殼聚糖（Medical chitosan，MC）作為一種抗粘連劑，被用來降低乳房重建術(shù)后包膜攣縮的發(fā)生率[11]。Li 等[12]的動物研究發(fā)現(xiàn)，MC 可通過抑制組織金屬蛋白酶（TIMPs）的表達和破壞ECM 的形成來減少包膜的厚度，證明了MC 有可能降低乳房重建手術(shù)后早期發(fā)生包膜攣縮的風險。研究表明，殼聚糖/膠原、殼聚糖/PLGA 等復合多孔支架，具有良好的生物相容性，其在體內(nèi)、體外試驗中對脂肪干細胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）的增殖分化有促進作用，并能在小鼠體內(nèi)形成新的脂肪組織，有望成為脂肪組織工程的生物支架材料[13-14]。由于殼聚糖具有良好的組織相容性、降解速率可調(diào)節(jié)、易于加工制作，且具有抗菌、抗氧化等生物特性，也常用作皮膚、軟組織、骨組織再生的支架材料或輔料[15-16]。

1.3 膠原

膠原蛋白是細胞外基質(zhì)的一種結(jié)構(gòu)蛋白。除軟骨組織外，所有組織都含有人體內(nèi)最豐富的Ⅰ型膠原纖維，皮膚、軟組織中還含有較多的Ⅲ型及Ⅵ型膠原[17]。膠原是天然ECM 中含量最豐富的蛋白質(zhì)，作為組織工程學支架材料具有非常高的仿生潛力[18]。同樣的，在乳房組織工程方面，Ⅰ型膠原支架能夠支持長達24 周的脂肪生成[19]。Davidenko 等[20]采用冷凍干燥技術(shù)制備了3D 多孔膠原-透明質(zhì)酸支架，這些支架能夠支持3T3-L1 前脂肪細胞的增殖和分化，增強了功能基因表達，不僅能生成脂肪組織，還增強了乳腺脂肪組織的體外發(fā)育能力。為了適應(yīng)臨床需求，尤其是乳腺癌術(shù)后乳房重建等較為復雜的內(nèi)部環(huán)境，Baldwin 等[21]研制出一種單寧酸/膠原珠狀注射材料，利用單寧酸具有抗癌和抗菌的特性，聯(lián)合膠原復合成支架。結(jié)果表明，不僅脂肪組織及新生血管能隨著植入材料的降解而逐漸形成，實驗動物也未出現(xiàn)植入排斥、細菌感染、死亡等現(xiàn)象。與其他材料支架相比，膠原蛋白支架的優(yōu)點是抗原性低、生物相容性好、生物可降解。然而，由于純膠原支架的機械強度較低、降解速率較快，很難將其單獨用作支架材料，所以膠原通常與其他天然或人工合成材料復合制作組織工程支架。

1.4 其他天然材料

絲素蛋白是蠶絲的主要組成部分，具有兩性荷電的特殊性能和良好的生物相容性及生物降解性，易于塑形，是一種理想的醫(yī)用材料。Hanken 等[22]的研究顯示，絲素蛋白支架對人體脂肪前體細胞具有優(yōu)異的細胞相容性且可促進脂肪分化；在絲素蛋白纖維上表達的生長因子VEGF 和FGF-2 可能對前脂肪細胞產(chǎn)生潛在的積極影響，在脂肪組織工程和再生醫(yī)學中擁有應(yīng)用潛力。

明膠是膠原部分水解而得到的一類大分子蛋白質(zhì)，因其良好的生物相容性、低免疫原性，已被廣泛加工成支架材料，且其與脂肪軟組織相似的固體機械性能是脂肪組織重建所必需的。Sutrisno 等[23]設(shè)計研究了一種黑磷納米片（BPNSs）和明膠的雙功能復合支架，以殺死乳腺癌細胞并誘導脂肪組織重建。實驗結(jié)果顯示，BP-明膠復合支架和明膠對照支架均能夠使脂肪細胞黏附、存活及增殖，而復合支架具有良好的生物相容性，降解產(chǎn)物無毒，且能夠促進hMSCs 的成脂分化，有望成為殺傷乳腺癌細胞和促進脂肪組織重建的新平臺。

海藻酸鹽是一種可自然生物降解的聚合物，可以將種子細胞封裝其內(nèi)以形成可注射的水凝膠或預(yù)成型的支架。Yang等[24]利用層粘連蛋白修飾海藻酸鹽，將ADSC、人參皂苷Rg1與材料混合，通過生物電噴霧制備成為可注射納米微球凝膠（ADSC-G-LAMS）。將復合材料注射至乳房缺損模型，通過模擬脂肪形成的胚胎環(huán)境，促進了大鼠脂肪組織再生，同時Rg1 的釋放誘導了血管的形成，提高了ADSC 及脂肪細胞的存活率。ADSC-G-LAMS 微球可以較好地負載干細胞和血管生成因子，有望用于腫瘤切除術(shù)后的乳房重建。

2 人工合成高分子材料

2.1 聚乳酸-羥基乳酸共聚物

聚乳酸-羥基乙酸共聚物（Poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）由兩種單體——乳酸和羥基乙酸按比例聚合而成，具有完全可生物降解性，其體內(nèi)降解的最終代謝產(chǎn)物為水和CO2，不在體內(nèi)蓄積，幾乎沒有毒副作用，是FDA 批準用于臨床的少數(shù)合成聚合物之一。PLGA 及其組成部分PLA 應(yīng)用均較廣泛[25]。當ADSCs 在含有成脂因子的PLA 支架上培養(yǎng)時，脂肪生成轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，且有大量脂質(zhì)積聚[26]。Chhaya等[27]利用PLA 乳房支架進行了裸鼠模擬試驗，結(jié)果顯示PLA支架憑借良好的機械性能承受了組織收縮力而不損失任何質(zhì)量，24 周后移植區(qū)域生成了大量來源于宿主的脂肪細胞，移植區(qū)域炎癥反應(yīng)較輕，脂肪組織間纖維化組織相對較少。Kim 等[28]制備了PLGA/氫氧化鎂復合支架，移植后顯示出較好的抗炎及促血管生成作用，在此基礎(chǔ)上自體脂肪組織移植，明顯降低了移植脂肪的吸收率。另有研究表明，以PLGA支架為基礎(chǔ)的工程脂肪組織可成功再生硬膜外脂肪，減少椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕的形成[29]。PLA、PLGA 具有絕佳的生物相容性，應(yīng)用范圍廣泛，但也存在降解速度慢、疏水性和柔韌性差等缺點[30-31]。

2.2 聚己內(nèi)酯

聚己內(nèi)酯（Polycaprolactone，PCL）相較于PLGA 具有更好的柔韌性，降解更加緩慢，被廣泛用于醫(yī)用生物降解材料及藥物控制釋放體系。Lee 等[32]將脂肪基質(zhì)細胞分別接種至天然纖維蛋白支架與PCL 支架表面，發(fā)現(xiàn)PCL 支架上的脂肪組織再生良好，脂肪生成基因的表達顯著增加。然而，未經(jīng)修飾的PCL 通常是疏水性的，不利于種子細胞黏附，且其緩慢和不穩(wěn)定的降解阻礙了組織的替換。因此，為了滿足不同組織構(gòu)建的需要，PCL 需與其他材料復合來控制支架的性能，從而使支架的降解與新發(fā)生的組織發(fā)育相一致，滿足乳房重建時脂肪生成與血管生長兩大關(guān)鍵因素。Sawadkar 等[33]利用不同比例的天然材料與PCL 復合制造支架以研究其生物活性，通過研究成脂關(guān)鍵基因PPARγ 的表達，指出PCL 基復合材料有利于脂肪生成，且篩選出PCL-膠原-纖維蛋白復合材料是促血管生成能力最強的材料?？傊?，PCL 材料與其他材料復合，可使其兼具合適的機械強度和良好的生物相容性，有利于乳房組織的工程化構(gòu)建。

2.3 其他合成材料

聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）水凝膠由于良好的生物相容性、可溶性及降解產(chǎn)物無毒等，被廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域。Brandl 等[34]證明了PEG 水凝膠在移植后可促進前脂肪細胞增殖和分化，具有作為脂肪組織工程支架材料的潛能。

聚氨酯（Polyurethane，PU）材料以其原料來源豐富、分子結(jié)構(gòu)多樣化、可修飾的性質(zhì)，被制備為性能各異的多用途組織工程支架。Wittmann 等[35]將可生物降解的聚己內(nèi)酯基PU支架與穩(wěn)定的纖維蛋白凝膠相結(jié)合，用于生成體積穩(wěn)定的脂肪組織結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，該材料在體內(nèi)、外均可以促進脂肪組織發(fā)育，并具有良好的促血管生成作用。Wiggenhauser 等[36]也證實了PU 在脂肪組織工程領(lǐng)域的潛力，發(fā)現(xiàn)PU 泡沫支架上纖維組織生成和脂肪再生較PCL 支架更加明顯。

醫(yī)用聚丙烯（Polypropylene，PP）因結(jié)構(gòu)多樣化及良好的理化，被廣泛用于外科領(lǐng)域。Cheng 等[37]制備了一種ADSCs 復合聚丙烯網(wǎng)狀支架，將其植入雌兔腹壁并進行評估，結(jié)果表明復合支架誘導產(chǎn)生的慢性炎癥反應(yīng)較單一支架更輕，表明了復合支架優(yōu)異的細胞相容性，并可降低早期炎癥反應(yīng)及纖維化程度。由于傳統(tǒng)的單一PP 支架較易引起免疫排斥及局部炎癥，目前已有研究傾向于用其他物質(zhì)（如聚多巴胺等）來改善支架本身的生物相容性[38]。

3 脫細胞脂肪組織基質(zhì)

3.1 DAT 的誘導成脂作用

經(jīng)過脫細胞處理后，脂肪脫細胞組織基質(zhì)（DAT）常被用作生物支架，如可注射凝膠、干燥粉末、多孔泡沫、生物墨水等[39]。DAT 在皮下植入后形成脂肪組織的能力已在不同的動物模型中得到證實，現(xiàn)有研究表明天然DAT 及其衍生物均具有誘導脂肪生成的作用[40]。作為脂肪組織工程中最重要的種子細胞——人脂肪源性干細胞（HASC），能夠在DAT 支架中良好地生長分化并促進脂肪的生成。DAT 本身具有招募宿主基質(zhì)/干細胞促進脂肪生成的潛能，含HASC 的DAT 植入小鼠體內(nèi)后更加能夠誘導脂肪組織的形成[41-43]。由于DAT 天然的機械強度較差，聯(lián)合其他材料可以改變DAT 的機械強度、彈性等力學性能，從而能夠加強DAT 的成脂誘導能力[44-45]。另外，通過表面改性也能促進DAT 的應(yīng)用。Cheung 等[46]用甲基丙烯酸酷硫酸軟骨素（Methacrylated chondroitin sulphate，MCS）交聯(lián)DAT，發(fā)現(xiàn)交聯(lián)后的DAT 誘導成脂能力得到加強。Lu 等[47]用碳化二亞胺（1-ethyl-3-carbodiimide，EDC）和經(jīng)基唬拍酞亞胺（N-hydroxysuccinimide）交聯(lián)堿性成纖維細胞生長因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF），發(fā)現(xiàn)交聯(lián)bFGF 的小鼠DAT 血管化更好，表達更高的成脂相關(guān)蛋白。Adam 等[48]發(fā)現(xiàn)，交聯(lián)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的DAT 其成脂能力與種植ASCs 的DAT 類似，均優(yōu)于單純DAT 支架植入。對于乳房組織工程而言，DAT 支架由于來源于脂肪而具有先天的優(yōu)勢，其良好的生物相容性及適宜的分子構(gòu)成均是其他材料無法比擬的[49]。

3.2 DAT 的來源選擇

Haddad 等[50]對比研究了不同脂肪組織庫來源的DAT，并用MRI 評估效果，發(fā)現(xiàn)來源于乳房和腹部的DAT 的填充效果均優(yōu)于單純?nèi)榉恐窘M織填充。由于從人體直接獲取相應(yīng)的組織來進行相關(guān)的醫(yī)學實驗存在倫理問題，所以從動物體內(nèi)獲取脂肪組織是目前較為常用的手段，因為豬等哺乳動物與人類有著相似的解剖學和生理特性[51]。此外，不同部位的脂肪也存在一定的差異。Lin 等[52]通過實驗比較了來自豬皮下組織（SDAT）和內(nèi)臟脂肪組織（VDAT）的DAT 的成脂能力，結(jié)果顯示VDAT 支架在體內(nèi)的脂肪生成效果優(yōu)于SDAT 支架。培養(yǎng)人脂肪源性干細胞（ADSCs）的體內(nèi)試驗結(jié)果顯示，VDAT組的脂肪再生率高于SDAT 組，說明豬內(nèi)臟脂肪組織是制備DAT 的優(yōu)秀候選組織。但目前脫細胞技術(shù)尚在研究發(fā)展階段，經(jīng)各種技術(shù)處理產(chǎn)生的DAT 的質(zhì)量及產(chǎn)量較低，且目前尚無任何一種方法能夠在完全去除免疫源性物質(zhì)的同時保留完整的細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，這仍需進一步探索研究。

表1 天然材料的優(yōu)缺點

表2 人工合成材料的優(yōu)缺點

4 乳房組織工程支架的制備工藝

4.1 3D 打印

3D 打印技術(shù)是一種通過計算機輔助，并以多次逐層沉積的方式將生物材料、生長及分化因子和種子細胞等功能組件，按照需求精確定位并加工制造的一種增材制備工藝[53]。在乳房重建術(shù)前評估方面，有研究使用MRI 并通過3D 打印對乳房植入物進行更精確的體積分析，從而用于術(shù)前觸覺反饋及手術(shù)指導[54]。MRI 與3D 打印技術(shù)結(jié)合也被應(yīng)用于術(shù)前建模，以更好地預(yù)估乳腺癌保乳手術(shù)的切除范圍。3D 打印可以制備體積形狀適宜、孔徑均勻的支架材料。Tytgat 等[55]將甲基丙烯酰胺明膠（Gel-MA）和甲基丙烯化κ-角叉菜膠（Car-MA）合成為混合凝膠，通過3D 打印技術(shù)將其制備成為乳房支架，研究顯示其力學性能接近于天然乳腺組織。Luo等[56]使用3D 打印技術(shù)制作了海藻酸鹽-聚多巴胺（Alg-PDA）支架并植入乳腺癌小鼠體內(nèi)。實驗表明，Alg-PDA 支架的彈性模量和柔韌性與正常乳腺組織相似；具有良好的光熱效應(yīng)，可有效殺死癌細胞；支持乳腺上皮細胞的增殖。如果這種支架可用于乳房重建，將降低局部乳腺癌復發(fā)的風險，提升整形美容效果。張聚良等[57]首次利用3D 打印技術(shù)實施保乳手術(shù)。通過MRI 模擬乳腺腫瘤切除術(shù)后缺損數(shù)據(jù)并構(gòu)建三維圖像，利用3D 打印技術(shù)制備PCL 支架，將支架直接填充乳房創(chuàng)腔，術(shù)后未出現(xiàn)感染、血腫等并發(fā)癥。填充物在2 年時間內(nèi)逐漸降解，并有肉芽組織逐漸向填充物內(nèi)部生長，填充物周圍血供豐富，組織相容性及美容效果良好[58]。

但是，3D 打印制備的乳房支架嚴重受制于打印機精度和“墨水材料”，目前適用于3D 打印的材料并不廣泛，其理化性質(zhì)的設(shè)置，對所種植的種子細胞影響巨大，也將間接影響脂肪組織再生和血供的形成[59]。臨床中，不同年齡、不同個體層次的乳腺組織力學模量不同，3D 打印的精度直接影響支架材料的柔性，也是未來亟待解決的難題。

4.2 靜電紡絲

靜電紡絲技術(shù)主要依靠納米纖維堆積，是制造柔性材料的常用技術(shù)[60]。其技術(shù)原理是在電紡噴嘴尖端和接地收集器之間施加電場，液滴在噴嘴的末端形成微球。隨著電場強度的增加，尖端的微球伸長，形成稱為泰勒錐的錐形形狀，并從尖端延伸得到纖維絲[61]。Unnithan 等[62]開發(fā)了一種基于靜電斥力電紡原理并復合了CMMA（羧貝甜菜堿-甲基丙烯酸甲酯）共聚物的新型3D 靜電紡絲支架（CMMA 3NF），發(fā)現(xiàn)該支架可以促進前脂肪細胞的附著、增殖及分化，證實了其在乳房組織工程和美容整形外科領(lǐng)域的適用性。靜電紡絲支架擁有較好的力學性能，但支架孔隙率不易調(diào)節(jié)、產(chǎn)品產(chǎn)量較低，且單一技術(shù)較難直接實現(xiàn)三維立體結(jié)構(gòu)。

4.3 冷凍干燥

冷凍干燥又稱升華干燥。將材料溶液的溫度降至冰點，再通過固體溶液升華制備成所需支架。Frydrych 等[63]通過冷凍干燥法制備得到了大而靈活的三維多孔PLLA 支架，具有高度互聯(lián)的開孔結(jié)構(gòu)、91%～92%的高孔隙率及109～141 μm的孔徑。實驗證明，利用冷凍干燥法制作的PGS/PLLA 共混支架具有與天然脂肪組織相似的力學性能、理想的多孔結(jié)構(gòu)及親水性能。凍干法的優(yōu)點在于有利于創(chuàng)建大體積多孔的材料支架；缺點在于需要模具來限定材料形狀，且處理過程中無法保證樣品的原有生物活性。

5 總結(jié)與展望

以脂肪組織工程為基礎(chǔ)的乳房組織工程，旨在能夠恢復并長期保持與正常乳房組織相似的三維結(jié)構(gòu)與生理功能，減少重建術(shù)后的并發(fā)癥，提升乳房的整形美容效果。支架材料及其制備工藝是乳房組織工程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為了克服單組份材料的局限性，目前人體組織再生設(shè)計較為依賴于兩種或兩種以上材料的組合，如天然與合成材料結(jié)合。合成材料主要提供機械強度和可紡性，而支架組分中的天然材料提供細胞識別信號，對細胞存活和增殖至關(guān)重要。作為脂肪組織工程的理想種子細胞，對ADSCs 分化能力、免疫調(diào)節(jié)能力及缺損修復機制的研究也是乳房組織工程研究的關(guān)鍵。ADSCs 聯(lián)合DAT 具有良好的促進成脂和血管化能力，值得更加深入的研究與改良[41]。相信在臨床醫(yī)學、分子生物學、材料科學、理工科學等交叉學科的不斷合作中，組織工程必將成為乳房重建最為理想的修復方式。