缺氧條件下Netrin-1通過(guò)激活PI3K/AKT通路誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化*

張曉涵 遲淑娜 徐征鵬

(濱州醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院婦科腫瘤，山東 煙臺(tái) 264000)

宮頸癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率和致死率僅次于乳腺癌，嚴(yán)重危害著女性健康。隨著宮頸癌危險(xiǎn)因素暴露的增加，宮頸癌發(fā)病率逐年增高且呈年輕化趨勢(shì)[1-2]。宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程復(fù)雜，涉及多種病理過(guò)程，侵襲和轉(zhuǎn)移是宮頸癌患者死亡的主要原因[3-4]。宮頸癌患者的預(yù)后與腫瘤是否浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)的作用尤為重要[5-6]。EMT是一個(gè)涉及上皮細(xì)胞極化的生物學(xué)過(guò)程，可使細(xì)胞呈間充質(zhì)細(xì)胞表型，同時(shí)賦予細(xì)胞遷移、侵襲、抗凋亡等能力以及ECM(細(xì)胞外基質(zhì))成分的產(chǎn)生[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，低氧微環(huán)境會(huì)改變腫瘤細(xì)胞的代謝方式，誘導(dǎo)細(xì)胞代謝發(fā)生適應(yīng)性變化，并調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中信號(hào)傳導(dǎo)和代謝通路，此外，低氧微環(huán)境還可通過(guò)上調(diào)EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子激活與EMT信號(hào)通路，從而誘發(fā)EMT[9]。Netrin-1是最早在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的可溶性神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子，在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中促進(jìn)細(xì)胞黏附和遷移，具有調(diào)控血管生成和類似血管表皮生長(zhǎng)因子的作用[10]。Netrin-1還被視為致癌基因, 促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，在許多腫瘤組織中高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，Netrin-1能促進(jìn)結(jié)直腸癌、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[11-12]。但目前Netrin-1是否在低氧誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞EMT中發(fā)揮作用文獻(xiàn)鮮少?；诖耍狙芯吭噲D探究Netrin-1在低氧誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞EMT中的作用及其機(jī)制，為宮頸癌治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人正常上皮細(xì)胞HaCaT(CL-0090)及人宮頸癌細(xì)胞系CasKi(CL-0048)購(gòu)自Procell公司，人宮頸癌細(xì)胞系SiHa(TCHu113)、Hela(TCHu187)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。二氧化鈷購(gòu)自廣州金華大化學(xué)試劑公司，胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司，DMEM培養(yǎng)基和RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，胰酶購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，總RNA提取試劑TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，Primescript RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京智杰遠(yuǎn)科技有限公司，qPCR引物由金唯智生物科技有限公司合成。Netrin-1敲低載體Si-Netrin-1 (siRNA-Netrin-1)、Si-NC (siRNA-negative control) 等由吉瑪基因公司負(fù)責(zé)構(gòu)建，Lipofectamine 2000購(gòu)自日本TaKaRa公司，一抗GAPDH(5174)、E-cadherin(14472)、Vimentin(5741)、AKT(4691)、p-AKT(4060)均購(gòu)自CST公司，Netrin-1(ab126729) 購(gòu)自Abcam公司。羊抗鼠IgG二抗和羊抗兔IgG二抗均購(gòu)自武漢博士德公司，ECL試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌細(xì)胞系SiHa、Hela，人正常上皮細(xì)胞HaCaT用DMEM(含10%FBS)培養(yǎng)基，人宮頸癌細(xì)胞系CasKi用RPMI-1640(含10%FBS)培養(yǎng)基，置于5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃過(guò)夜培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)備用。細(xì)胞分為常氧組和低氧組，低氧組應(yīng)用二氧化鈷處理，終濃度為150 μmol/L，常氧組應(yīng)用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 人宮頸癌細(xì)胞系SiHa細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用胰酶消化、計(jì)數(shù)，然后接種于6孔板，培養(yǎng)24 h以備轉(zhuǎn)染。嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000 試劑盒說(shuō)明書分別轉(zhuǎn)染Si-NC、Si-Netrin-1至SiHa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果，并通過(guò)qPCR和蛋白質(zhì)印記法檢測(cè)各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

1.4 qPCR檢測(cè)Netrin-1的表達(dá) 采用TRIzol一步法分別提取待測(cè)細(xì)胞中總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度和純度，隨后采用Primescript RT試劑逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)，取1 μg逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板行qPCR，反應(yīng)體系(20 μL)為：2 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μL SYBR Green Mix、0.4 μL ROX Reference Dye、上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL、6 μL ddH2O。預(yù)變性95℃、5 min，94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸 1 min，循環(huán)45次后進(jìn)行終延伸完成PCR。采用 2-△△Ct法計(jì)算目的基因Netrin-1表達(dá)量。以GAPDH為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

表1 qPCR引物序列

1.5 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)Netrin-1、E-cadherin、Vimentin、AKT等蛋白表達(dá)水平 胰酶消化人宮頸癌細(xì)胞，離心5 min，PBS溶液洗滌，棄上清，重復(fù)3次。提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。每組取50 μg進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白條帶，用電轉(zhuǎn)移法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜；次日，TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h；TBST洗滌3次后加入 ECL 化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯影，然后在凝膠成像儀上觀察拍照。

1.6 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞遷移能力 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，按5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后觀察培養(yǎng)皿底部細(xì)胞融合率達(dá)90%，用200 μL槍頭垂直于細(xì)胞平面劃“十”字，PBS清洗細(xì)胞2次，更換培養(yǎng)液，24 h后在光學(xué)顯微鏡下觀察相同位置劃痕愈合情況并拍照。

1.7 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞侵襲能力 取24孔板，置入Transwell小室，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋Matrigel(體積稀釋比例為1∶8)，每個(gè)小室的上室內(nèi)加入50 μL稀釋后的Matrigel，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜；次日取出小室，吸出上室和下室內(nèi)剩余的培養(yǎng)液；將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞消化離心，用PBS洗滌細(xì)胞2次，用無(wú)血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，在每個(gè)小室上室內(nèi)加入3×104個(gè)細(xì)胞/200 μL的細(xì)胞懸液，下室內(nèi)加入500 μL含10% FBS的完全培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室，用棉簽將上室底部的細(xì)胞擦拭掉，用PBS洗滌小室底面3次，4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，再次PBS洗滌小室底面3次，1%結(jié)晶紫染色30 min，光學(xué)顯微鏡(Nikon TS100，日本Nikon公司產(chǎn)品)下觀察并拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，采用GraphPad 7.0軟件進(jìn)行相關(guān)圖片繪制。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Netrin-1在宮頸癌細(xì)胞系中呈高表達(dá) qPCR結(jié)果顯示，相對(duì)于正常人上皮細(xì)胞HaCaT，Netrin-1基因在宮頸癌細(xì)胞系SiHa(P<0.001)、Caski(P<0.01)、Hela(P<0.01)中均高表達(dá)(圖1A)。Western Blot結(jié)果顯示，相對(duì)于正常人上皮細(xì)胞HaCaT，Netrin-1蛋白表達(dá)水平在宮頸癌細(xì)胞系SiHa、Caski、Hela中明顯升高(圖1B)，且在細(xì)胞系SiHa、Caski中表達(dá)水平較高，并選取SiHa、Caski細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。上述結(jié)果表明，Netrin-1在宮頸癌細(xì)胞中異常高表達(dá)，可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。

圖1 Netrin-1在宮頸癌細(xì)胞株中高表達(dá)

2.2 低氧條件下SiHa、Caski經(jīng)歷上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程 Western Blot結(jié)果顯示，相對(duì)于常氧組，低氧組SiHa、Caski細(xì)胞中的上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin顯著下調(diào)，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin顯著上調(diào)(圖2A)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)于常氧組，宮頸癌細(xì)胞系SiHa、Caski在低氧條件下顯示出更強(qiáng)的細(xì)胞侵襲能力(圖2B)。細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SiHa、Caski細(xì)胞在低氧條件下?lián)碛斜瘸Ｑ踅M更快的細(xì)胞損傷愈合能力(圖2C)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SiHa、Caski細(xì)胞在低氧條件下培養(yǎng)時(shí)上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin下調(diào)，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin上調(diào)，細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。

圖2 低氧條件下SiHa、Caski經(jīng)歷上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程

2.3 低氧條件下誘導(dǎo)Netrin-1在SiHa、Caski細(xì)胞中表達(dá)升高 Western Blot結(jié)果顯示，相對(duì)常氧組，SiHa、Caski細(xì)胞在低氧條件培養(yǎng)24 h后Netrin-1蛋白表達(dá)水平顯著升高(圖3A)。qPCR檢測(cè)SiHa、Caski細(xì)胞中Netrin-1表達(dá)結(jié)果顯示，相對(duì)于常氧組，Netrin-1基因在在低氧組被顯著上調(diào)(圖3B)。上述結(jié)果表明，SiHa、Caski細(xì)胞在低氧條件培養(yǎng)24 h后，Netrin-1在基因及蛋白水平顯著上調(diào)(均P<0.01)。

圖3 低氧誘導(dǎo)條件下Netrin-1在SiHa、Caski細(xì)胞中表達(dá)升高

2.4 敲低Netrin-1抑制低氧條件誘導(dǎo)的SiHa細(xì)胞侵襲、遷移能力 Western Blot結(jié)果顯示，相對(duì)于Control組，Netrin-1在SiHa細(xì)胞中被成功敲低(圖4A)。并且發(fā)現(xiàn)在低氧條件下敲低Netrin-1可以顯著上調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin的表達(dá)，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin被顯著下調(diào)(P<0.05、P<0.001，圖4B)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低Netrin-1基因，可以抑制低氧條件下SiHa細(xì)胞的侵襲能力(圖4C)。細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)于Control組，Netrin-1敲低組細(xì)胞損傷愈合能力顯著減弱(圖4D)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低Netrin-1可抑制低氧條件誘導(dǎo)的SiHa細(xì)胞侵襲、遷移能力。

圖4 敲低Netrin-1可抑制低氧條件誘導(dǎo)的SiHa細(xì)胞侵襲、遷移能力

2.5 敲低Netrin-1常氧組SiHa細(xì)胞的侵襲、遷移能力無(wú)顯著性變化 Western Blot結(jié)果顯示，敲低Netrin-1，常氧組SiHa細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)沒(méi)有顯著性變化(圖5A)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，常氧培養(yǎng)條件下，與Control組和Si-NC組相比，Si-Netrin-1組細(xì)胞的侵襲能力無(wú)顯著性改變(P>0.05，圖5B)。細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Netrin-1基因的敲低，對(duì)SiHa細(xì)胞的遷移能力無(wú)顯著影響(圖5C)。上述結(jié)果表明，常氧培養(yǎng)條件下敲低Netrin-1，SiHa細(xì)胞的侵襲、遷移能力無(wú)顯著性變化(P>0.05)。

圖5 敲低Netrin-1正常氧氣組SiHa細(xì)胞的侵襲、遷移能力無(wú)顯著性變化

2.6 缺氧條件下Netrin-1通過(guò)激活PI3K/AKT通路誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 Western Blot結(jié)果顯示，相對(duì)于常氧組，低氧條件下AKT蛋白表達(dá)在宮頸癌細(xì)胞系SiHa中沒(méi)有變化(P>0.05)，但是其磷酸化形式p-AKT顯著升高，當(dāng)在低氧條件下敲低Netrin-1，p-AKT水平卻被顯著下調(diào)(P<0.05, 圖6A)。正常氧氣培養(yǎng)條件下，在宮頸癌細(xì)胞系SiHa中敲低Netrin-1對(duì)AKT蛋白及其磷酸化形式p-AKT沒(méi)有顯著性影響(P>0.05，圖6B)。上述結(jié)果表明，在正常氧氣培養(yǎng)條件下，敲低Netrin-1對(duì)PI3K/AKT通路沒(méi)有影響，但是在低氧條件下，敲低Netrin-1可以抑制PI3K/AKT通路的激活。

圖6 缺氧條件下Netrin-1通過(guò)激活PI3K/AKT通路誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

3 討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征，宮頸癌患者的不良預(yù)后與侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)，轉(zhuǎn)移以直接侵犯和淋巴轉(zhuǎn)移為主，晚期可轉(zhuǎn)移到肺、腎等[13]。EMT作為上皮源性腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要步驟，與腫瘤浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在結(jié)直腸癌、乳腺癌、甲狀腺癌等癌細(xì)胞中，從上皮細(xì)胞到間充質(zhì)細(xì)胞的表型改變?cè)谵D(zhuǎn)移過(guò)程中起決定性作用[14-15]。盡管在診斷和篩查技術(shù)以及疫苗的使用方面有所改進(jìn)，宮頸癌仍然是全世界女性與癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。具有EMT表型的原發(fā)性宮頸癌顯示出腫瘤進(jìn)展、侵襲、轉(zhuǎn)移和上皮完整性畸變[16]。缺氧是宮頸癌和其他類型癌癥患者不良臨床預(yù)后有力且獨(dú)立的指標(biāo)，研究人員發(fā)現(xiàn)缺氧相關(guān)的蛋白質(zhì)組的變化可以通過(guò)誘導(dǎo)EMT而增加了癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。這些變化伴隨著間質(zhì)標(biāo)記Vimentin的上調(diào)以及上皮標(biāo)記E-cadherin的下調(diào)，表明缺氧條件下宮頸癌細(xì)胞中EMT的發(fā)生。本研究證明宮頸癌細(xì)胞系SiHa、Caski經(jīng)含有二氧化鈷的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞中E-cadherin被顯著下調(diào)，Vimentin被顯著上調(diào)，證實(shí)發(fā)生了EMT，同時(shí)遷移及侵襲能力顯著增強(qiáng)，表明低氧誘導(dǎo)SiHa、Caski發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并且提高了宮頸癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。

Netrin-1是Netrin家族中最有特色的配體，是一種高度保守的可溶性蛋白，越來(lái)越多的證據(jù)表明，Netrin-1不僅參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育[18]，而且在多種人類癌癥細(xì)胞中高表達(dá)，如Netrin-1在肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，并在低氧條件下，通過(guò)激活NF-κB誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化并促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲；在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞高表達(dá)，通過(guò)UNC5A受體激活NF-κB促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)[19]；Netrin-1通過(guò)EMT增強(qiáng)細(xì)胞侵襲、遷移和血管生成模擬物，從而引發(fā)非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移潛力。本研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于正常上皮細(xì)胞，Netrin-1在宮頸癌細(xì)胞系SiHa、Caski、Hela中均顯著過(guò)表達(dá)。并且經(jīng)低氧條件處理后，細(xì)胞內(nèi)Netrin-1蛋白表達(dá)水平提高，敲低Netrin-1可抑制由低氧誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞EMT過(guò)程，并使細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力降低；而在常氧條件下，敲低Netrin-1對(duì)細(xì)胞EMT過(guò)程及侵襲轉(zhuǎn)移能力沒(méi)有明顯影響。這表明Netrin-1在低氧誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞的EMT過(guò)程中發(fā)揮正向調(diào)控功能，促進(jìn)細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。

在低氧微環(huán)境中細(xì)胞因子、趨化因子、G蛋白偶聯(lián)受體等可激活 PI3K/ AKT/MTOR、MAPK和NF-κB信號(hào)通路。PI3K/ AKT/MTOR 信號(hào)通路在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中處于高活性狀態(tài)，也正是因?yàn)檫@條通路的激活，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。研究表明FAK是Netrin-1的重要下游分子，可在磷酸肌醇3激酶(PI3K)/ AKT和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑中相互作用，從而誘導(dǎo)EMT[20]。此外，在周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷中，Netrin-1介導(dǎo)的Schwann 細(xì)胞遷移與p38 MAPK和PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)低氧誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞中AKT蛋白水平不變，p-AKT水平增加，PI3K/AKT通路被激活，在宮頸癌細(xì)胞SiHa中敲低Netrin-1后，p-AKT恢復(fù)到原來(lái)水平，AKT通路激活效應(yīng)被抑制。而在正常氧氣條件下，敲低Netrin-1對(duì)PI3K/AKT通路沒(méi)有明顯影響。從而證實(shí)了低氧條件下Netrin-1通過(guò)PI3K/AKT促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的EMT過(guò)程。

4 結(jié)論

Netrin-1在宮頸癌細(xì)胞系中異常高表達(dá)，并且低氧條件可誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞中Netrin-1的表達(dá)升高，從而激活PI3K/AKT通路促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程。