基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究血必凈注射液治療有機(jī)磷中毒的分子機(jī)制

鐘志濤，洪義，黃浩峰，趙敏

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院急診科，沈陽(yáng) 110004）

有機(jī)磷中毒是臨床常見(jiàn)的急危重癥，具有發(fā)病快、病情變化迅速、死亡率高等特點(diǎn)［1］。主要臨床表現(xiàn)為乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE） 活性嚴(yán)重降低，毒蕈堿樣、煙堿樣癥狀及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等癥狀，以及各種原因誘導(dǎo)的全身多臟器功能損傷。臨床上有機(jī)磷中毒采用復(fù)能劑、阿托品等對(duì)癥治療方案［2］。

血必凈注射液組方為紅花、赤芍、川芎、丹參和當(dāng)歸，具有活血化瘀、扶正固本、清熱解毒等功效，對(duì)全身炎癥反應(yīng)綜合征、膿毒血癥有一定的治療作用［3-4］。有研究［5］表明血必凈注射液能抑制有機(jī)磷中毒全身炎癥反應(yīng)、減輕心血管損傷、改善凝血功能等作用。血必凈注射液與血液凈化、復(fù)能劑等聯(lián)合使用能夠改善患者預(yù)后及減少并發(fā)癥的發(fā)生［6］。

目前，有機(jī)磷中毒重癥患者仍缺乏有效及時(shí)的藥物檢測(cè)方法，難以準(zhǔn)確調(diào)控“阿托品化”劑量。因此多種藥物聯(lián)合安全有效治療有機(jī)磷中毒尤為重要。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，對(duì)血必凈注射液與有機(jī)磷中毒的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)行分析，探討血必凈注射液治療有機(jī)磷中毒的分子機(jī)制，旨在為闡明血必凈注射液治療機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

以“紅花”“川芎”“赤芍”“丹參”和“當(dāng)歸”五味中藥材名稱(chēng)在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//tcmspw.com/tcmsp.php） “Herbname” 中進(jìn)行檢索，通過(guò)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）、類(lèi)藥性（druglike，DL） 對(duì)材料進(jìn)行整理獲得藥物活性成分，通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)收集的活性成分導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/） 中得到血必凈注射液藥物靶點(diǎn)的基因名稱(chēng)。以“organophosphorus pesticide poisoning”在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org） 和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.omim.org） 中檢索，收集有機(jī)磷中毒基因靶點(diǎn)并整理。

1.2 方法

1.2.1 交集靶點(diǎn)獲取：將血必凈注射液藥物活性成分靶點(diǎn)及有機(jī)磷中毒相關(guān)基因靶點(diǎn)導(dǎo)入在線(xiàn)工具Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），制作活性成分靶點(diǎn)和有機(jī)磷中毒靶點(diǎn)的韋恩圖，獲得其共同靶點(diǎn)基因，探究血必凈注射液對(duì)有機(jī)磷中毒治療的作用靶點(diǎn)。

1.2.2 活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：將血必凈注射液藥物活性成分、各類(lèi)藥物名稱(chēng)、相關(guān)靶點(diǎn)及有機(jī)磷中毒相關(guān)基因等導(dǎo)入Cytoscape3.7軟件，構(gòu)建活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape3.7軟件中“Network Analyzer”計(jì)算連接度值，連接度值越高，表示其在網(wǎng)絡(luò)圖中的重要性越大，可能在疾病治療中發(fā)揮的作用也越大。

1.2.3 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI） 網(wǎng)絡(luò)制作：在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//string-db.org）中導(dǎo)入藥物和疾病的交集靶點(diǎn)基因，以“homosapiens”為檢索物種，置信度≥0.4篩選數(shù)據(jù)，獲得并導(dǎo)出PPI網(wǎng)絡(luò)圖，將STRING數(shù)據(jù)庫(kù)檢索數(shù)據(jù)導(dǎo)出，整理并篩選出重要蛋白。

1.2.4 交集靶點(diǎn)的富集分析：在DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/） 中將1.2.1獲取的交集靶點(diǎn)基因?qū)氩⑦M(jìn)行檢索，進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO） 分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG） 通路富集分析，篩選整理排序前20位關(guān)系密切的相關(guān)富集分析結(jié)果，采用R-studio軟件制作成柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1 血必凈注射液的活性成分

以O(shè)B≥30%和DL≥0.18篩選TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中血必凈注射液藥物活性成分，最后得到125個(gè)活性成分。OB值排序前15位（從高到低） 的活性成分見(jiàn)表1。

表1 血必凈注射液部分活性成分Tab.1 Some active ingredients in Xuebijing injection

2.2 血必凈注射液與有機(jī)磷中毒交集靶點(diǎn)構(gòu)建

將血必凈注射液活性成分導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)獲得靶點(diǎn)217個(gè)，從GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索有機(jī)磷中毒獲得相關(guān)靶點(diǎn)279個(gè)，用Venny2.1繪制血必凈注射液與有機(jī)磷中毒交集靶點(diǎn)，最終得到69個(gè)共同靶點(diǎn)，這些共同靶點(diǎn)可能為血必凈注射液治療有機(jī)磷中毒的潛在靶點(diǎn)。

2.3 活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

在Cytoscape3.7軟件中導(dǎo)入血必凈注射液與有機(jī)磷中毒交集靶點(diǎn)關(guān)系，繪制活性成分-交集靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，見(jiàn)圖1。以連接度值大小排序，槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇位于前三位，分別為52、51、28，表明這3個(gè)活性成分可能是血必凈注射液治療有機(jī)磷中毒的重要核心藥物活性成分。PTGS1、AR、ACHE為排名前三位的交集靶點(diǎn)基因，連接度值分別為42、27、27，表明這3個(gè)靶點(diǎn)基因可能是重要的治療靶點(diǎn)基因，CHRM2、ESR1、OPRD1、PPARG、CASP3、SLC6A3等基因也有較大的連接度值。

圖1 血必凈注射液活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 The active ingredient-intersection target network of Xuebijing injection

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將血必凈注射液與有機(jī)磷中毒交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，獲得交集蛋白相互作用關(guān)系，見(jiàn)圖2。通過(guò)導(dǎo)出String數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)，根據(jù)Betweenness Centrality、Closeness Centrality的均值篩選，結(jié)果顯示AKT1、ALB、CAT、CASP3、JUN、VEGFA等靶點(diǎn)連接度值較大，這些靶點(diǎn)可能在治療有機(jī)磷中毒中發(fā)揮重要作用。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)分析圖Fig.2 Protein-protein interaction diagram

2.5 交集靶點(diǎn)的富集分析

在DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中導(dǎo)入交集靶點(diǎn)進(jìn)行分析，如圖3所示，得到GO富集分析 1 217個(gè)，KEGG代謝通路144條。生物過(guò)程（biological process，BP） 1 122個(gè)，其中化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)，氧化應(yīng)激反應(yīng)、活性氧反應(yīng)、抗生素反應(yīng)等富集程度較大；細(xì)胞組成（cellular component，CC） 28個(gè)，其中脂筏、膜微結(jié)構(gòu)域、囊腔、分泌顆粒內(nèi)腔等富集程度較大；分子功能（molecular function，MF） 67個(gè)，其中血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、氧化還原酶活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等富集程度較大。KEGG排名前20條通路見(jiàn)圖4，包括流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、乙型肝炎、結(jié)腸直腸癌、膀胱癌、IL-17信號(hào)通路、前列腺癌、內(nèi)分泌抵抗、糖尿病并發(fā)癥年齡-年齡信號(hào)通路、卡波濟(jì)肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、細(xì)胞凋亡、胰腺癌、鉑耐藥、美洲錐蟲(chóng)病、丙型肝炎、人類(lèi)巨細(xì)胞病毒感染、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、麻疹、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、弓形蟲(chóng)病、沙門(mén)氏菌感染等，血必凈注射液可能通過(guò)這些通路起到治療有機(jī)磷中毒的作用。

圖3 GO富集分析Fig.3 GO enrichment analysis

圖4 KEGG富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis

3 討論

利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)藥物與疾病潛在的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，能夠促進(jìn)藥物的研發(fā)和疾病的治療［7］。本研究結(jié)果顯示，有機(jī)磷中毒機(jī)制不限于對(duì)AChE的抑制，另一個(gè)重要機(jī)制是有機(jī)磷能誘導(dǎo)機(jī)體氧化損傷［8-9］。機(jī)體產(chǎn)生活性氧簇（reactive oxygen species，ROS） 造成臟器直接損傷，還可介導(dǎo)信號(hào)通路生成炎癥介質(zhì)，加重各器官損傷［10-11］。經(jīng)現(xiàn)代藥理證實(shí)，血必凈注射液具有改善微循環(huán)、抗炎、抗氧化、抑制炎癥介質(zhì)聚集與炎癥反應(yīng)等功效，有助于抑制血小板聚集、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)和改善血管內(nèi)皮功能［1，12］。

本研究發(fā)現(xiàn)血必凈注射液治療有機(jī)磷中毒的主要核心活性成分為槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇等。槲皮素可能通過(guò)多種途徑減少氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷。盧春鳳等［13］發(fā)現(xiàn)槲皮素能減少氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷，可能與提高下游抗氧化基因的表達(dá)有關(guān)，從而抑制肝細(xì)胞凋亡。李冬梅等［14］發(fā)現(xiàn)槲皮素通過(guò)下調(diào)心肌髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO） 活性和心肌NF-κB的表達(dá)，對(duì)心肌產(chǎn)生保護(hù)效果。BAO 等［15］用槲皮素處理H2O2誘導(dǎo)的大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞，能提高細(xì)胞的生存能力，減少細(xì)胞和海馬神經(jīng)元的凋亡，說(shuō)明槲皮素能減少PC-12細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡。

木犀草素是一種天然類(lèi)黃酮化合物，結(jié)構(gòu)中含有的酚羥基基團(tuán)有較強(qiáng)的還原性，從而使木犀草素具有抗氧化特性［16］。SEELINGER等［17］發(fā)現(xiàn)木犀草素可減少誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS） 的作用，降低iNOS的表達(dá)和一氧化氮（nitric oxide，NO） 產(chǎn)生。研究［18］發(fā)現(xiàn)木犀草素能夠抑制多種白細(xì)胞介素（interleukin，IL） 因子（IL-6等）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF） 等多種因子，增強(qiáng)IL-10的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用。

已有研究發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇在抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多個(gè)方面表現(xiàn)出良好的藥理作用。VALERIO等［19］認(rèn)為β-谷甾醇可以提高脂多糖誘導(dǎo)的J774A1巨噬細(xì)胞抗炎因子IL-10的活性，下調(diào)趨化因子、促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用。CHOI等［20］認(rèn)為β-谷甾醇減少NO合成，IL-1、腫瘤壞死因子等炎性細(xì)胞因子的分泌，抑制IL-6活性來(lái)發(fā)揮抗炎作用。

活性成分-交集靶點(diǎn)圖與PPI網(wǎng)絡(luò)圖顯示AKT1、ALB、CAT、CASP3、JUN、VEGFA等可能是血必凈注射液治療有機(jī)磷中毒的重要靶點(diǎn)蛋白，目前相關(guān)蛋白與血必凈注射液、有機(jī)磷中毒的研究較少。KEGG通路分析提示血必凈注射液治療有機(jī)磷中毒相關(guān)通路涉及流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗、細(xì)胞凋亡、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路等，這與現(xiàn)代藥理證實(shí)的部分作用相符合［1］，表明血必凈注射液可能通過(guò)多通路、多信號(hào)對(duì)有機(jī)磷中毒產(chǎn)生積極影響。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析了血必凈注射液與有機(jī)磷中毒的作用關(guān)系，從“多成分、多靶點(diǎn)”角度揭示了其可能的分子機(jī)制，認(rèn)為血必凈注射液可能通過(guò)作用于AKT1、ALB、CAT、CASP3、JUN、VEGFA等關(guān)鍵靶點(diǎn)基因，調(diào)控流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路等來(lái)發(fā)揮治療效果。本研究結(jié)論是基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)原理，通過(guò)提取數(shù)據(jù)庫(kù)信息整理、分析而獲得，與實(shí)際作用機(jī)制可能存在差異，因此需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。