基于生物信息學(xué)分析構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子E2F1調(diào)控微RNA及其靶向基因網(wǎng)絡(luò)

朱文韜，曲浩寧，何群

（中國醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物信息教研室，沈陽 110122）

E2F是調(diào)控基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子家族，E2F1在1986年首次被ROVESDI發(fā)現(xiàn)，并由HELIN等從E2F家族中分離提出。E2F1是人體中重要的細(xì)胞周期正向調(diào)控因子，已有研究［1］發(fā)現(xiàn)E2F1在多種腫瘤如肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌中發(fā)揮促癌作用。

微RNA（microRNA，miRNA） 是一類長約 18～25個核苷酸的非編碼RNA，與mRNA 轉(zhuǎn)錄本的 3’-UTR結(jié)合，可以對靶基因的表達(dá)形式進(jìn)行調(diào)控［2］。它們對各種生物學(xué)過程具有調(diào)控作用，與細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化及細(xì)胞凋亡等有關(guān)，其表達(dá)作用方式受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控影響，近年來轉(zhuǎn)錄因子與miRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已成為研究熱點［3］。

然而，目前研究［4］多關(guān)注于E2F1及miRNA參與細(xì)胞通路，對E2F1與miRNA存在的內(nèi)在調(diào)控機制尚無研究闡明。本研究基于生物信息學(xué)分析，構(gòu)建TF-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，旨在為癌癥治療的藥物研發(fā)提供潛在的靶點。

1 材料與方法

1.1 泛基因組篩選存在E2F1差異表達(dá)的腫瘤

UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/） 是基于TCGA構(gòu)建的癌癥組織數(shù)據(jù)庫，用于分析癌癥OMICS數(shù)據(jù)的全面、交互式的Web資源。其使用javascript和CSS在Perl-CGI構(gòu)建了高質(zhì)量圖形。運用UALCAN進(jìn)行E2F1泛基組表達(dá)分析，篩選pan-cancer view泛基因組圖譜中存在E2F1表達(dá)差異的腫瘤。

1.2 E2F1調(diào)控miRNA靶基因篩選

1.2.1 差異表達(dá)miRNA篩選（differential expression miRs screening，DEG-miRNAs）：Oncomir是一個在線數(shù)據(jù)庫（http：//www.oncomir.org/），提供30種癌癥的miRNA表達(dá)譜。登陸Oncomir網(wǎng)站，分析E2F1存在差異表達(dá)腫瘤組的miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，下載各腫瘤組差異表達(dá)的miRNA數(shù)據(jù)。篩選條件為P≤ 0.05，score ＞50，將差異表達(dá)結(jié)果集合列為DEG-miRNAs。

1.2.2 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控數(shù)據(jù)庫（gene tranion regulation database，GTRD）-miRNAs的預(yù)測：GTRD（http：//gtrd.bio-uml.org/） 是一個通過ChIP-seq實驗鑒定的人類和小鼠轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點（transcription factor binding sites，TFBSs） 數(shù)據(jù)庫。從ENCODE和SRA中獲得原始ChIP-seq數(shù)據(jù)，并一致處理。利用GTRD，在transcription factor target genes中選擇物種（organism）：Human；轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor）：E2F1 QO1094；轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點（TF binding site location）：Promoter［-1 000，+100］，得到E2F1調(diào)控靶基因并從中篩選保留靶基因中的miRNA，設(shè)為GTRD-miRNAs數(shù)據(jù)集。

利用venny2.1.0網(wǎng)站（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），分別對每個腫瘤組的DEGmiRNAs和GTRD預(yù)測的E2F1靶基 因GTRD-miRs數(shù)據(jù)集取交集，設(shè)為每個腫瘤組潛在的E2F1靶基因Pre-miRNAs，將所有腫瘤組的共有Pre-miRNAs設(shè)置為E2F1最終的miRNA靶基因GTRD-miRNAs。

1.3 E2F1-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

1.3.1 Target-mRNAs的預(yù)測與分析：使用TargetScan（http：//www.targetscan.org/），TargetMiner（http：//www.mybiosoftware.com/targetminer-microrna-target-prediction.html），TarBase（http：//microrna.gr/tarbase/） 分別預(yù)測候選mRNA，并將預(yù)測結(jié)果進(jìn)行交集篩選，最終取得Target-miRNAs的靶基因集Target-mRNAs。將Target-mRNAs與DEGs進(jìn)行交集篩選，獲得候選Target-miRNAs的靶基因mRNA組。

1.3.2E2F1高表達(dá)腫瘤的基因差異表達(dá)分析：登陸TCGA數(shù)據(jù)庫，下載E2F1存在差異表達(dá)腫瘤組的mRNA-seq數(shù)據(jù)，利用R語言edgeR包進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，mRNA的篩選閾值為log2FC＞ 1.5且P＜0.01，并將表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，將表達(dá)下調(diào)的差異結(jié)果集合列為DEGs。

1.4 分析構(gòu)建可視化TF-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)

運用Cytoscape（3.7.1版本） 構(gòu)建可視化TF-miRNAmRNA可視化網(wǎng)絡(luò)。為分析其功能，進(jìn)一步運用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫對取得的靶基因mRNAs進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO） 分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes，KEGG） 通路分析，篩選條件均為P≤ 0.05。采用STRING（https：//stringdb.org/） 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建靶基因組的蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interactions，PPI），并應(yīng)用Cytoscape（3.7.1版本） 對STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建出的PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果進(jìn)行分析，將分析結(jié)果導(dǎo)入Metascpae構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步運用Cytoscape的Hubba插件對該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行樞紐基因功能富集。

2 結(jié)果

2.1 泛基因組中E2F1差異表達(dá)結(jié)果

存在E2F1表達(dá)差異的腫瘤組織共20個，其中E2F1表達(dá)上調(diào)的腫瘤組織18個，分別為BRCA、CESC、CHOL、COAD、ESCA、HNSC、KICH、KIRP、READ、PRAD、BLCA、KIRC、LIHC、LUAD、LUSC、THCA、STAD和UCEC，E2F1表達(dá)下調(diào)的腫瘤組織2個，分別為THYM和PCGC。見圖1。

圖1 E2F1轉(zhuǎn)錄因子在泛基因組中的表達(dá)狀況Fig.1 The figure illustrates the expression status of E2F1 transcription factor in the pan-genome

2.2 E2F1調(diào)控miRNA基因預(yù)測及其篩選結(jié)果

2.2.1 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測：GTRD數(shù)據(jù)庫預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子的靶基因，取得E2F1靶基因集24 467個，其中miRNA 543個，列為GTRD-miRNAs。

2.2.2 DEG-miRNAs預(yù)測結(jié)果：為了進(jìn)一步對E2F1調(diào)控miRNA靶基因進(jìn)行篩選，登陸OncomiR（http：//www.oncomir.org/），分析E2F1存在差異表達(dá)腫瘤組的miRNA表達(dá)情況，并下載各腫瘤組差異表達(dá)的miRNA。為進(jìn)一步縮小范圍，利用venny2.1.0對GTRD預(yù)測的GTRD-miRNAs和各腫瘤組對應(yīng)下調(diào)的miRNA取交集，篩選各腫瘤組中E2F1的潛在靶miRNA，列集合為Pre-miRNAs并分別與GTRD-miRNAs取交集并進(jìn)行可視化處理（圖2），將所取得的所有腫瘤組潛在靶miRNA與GTRD-miRNAs的共交集作為E2F1的候選miRNA，列為DEGs-miRNAs。

圖2 GTRD-miRNAs預(yù)測結(jié)果與泛基因組腫瘤差異基因交集結(jié)果Fig.2 The intersection results between the GTRD-miRNAs prediction results and the pan-genomic tumor difference genes

運用VENNY2.1.0將GTRD-miRNAs與DEG-miRNAs的預(yù)測結(jié)果與DEGs取交集，取得腫瘤組中表達(dá)上調(diào)的miRNA：hsa-miR-7，hsa-miR-9，hsa-miR-13，hsamiR-21，hsa-miR-22，hsa-miR-24，列為Target-miRNAs靶集，見表1。

表1 Target-miRNAs數(shù)據(jù)表Tab.1 Target-miRNAs data table

2.3 Target-mRNAs的交集預(yù)測與定位結(jié)果

使用TargetScan，TargetMiner，TarBase交集預(yù)測得到miRNA-7，miRNA-9，miRNA-14，miRNA-21，miRNA-22，miRNA-24的靶mRNAs分別為224個，444個，83個，74個，130個和72個。進(jìn)一步采用VENNY2.1.0將Target-miRNAs與DEGs取交集作為目標(biāo)miRNA基因簇的靶mRNAs。miRNA-7的mRNA靶基因12個，miRNA-9的mRNA靶基因12個，miRNA-14的mRNA靶基因2個，miRNA-21的mRNA靶基因14個，miRNA-22的mRNA靶基因30個，miRNA-24的mRNA靶基因16個，見表2。

表2 miRNA-mRNA數(shù)據(jù)表Tab.2 miRNAs-miRNAs data table

2.4 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的可視化構(gòu)建分析

為宏觀展現(xiàn)E2F1在泛基因組中的調(diào)控過程，進(jìn)一步對E2F1轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的miRNA-7，miRNA-9，miRNA-14，miRNA-21，miRNA-22，miRNA-24及受其調(diào)控的關(guān)鍵靶基因進(jìn)行可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，以圖譜展現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子泛基因組中E2F1通過下調(diào)miRNA參與基因表達(dá)調(diào)控的作用途徑，見圖3。

GO分析結(jié)果顯示，生物過程（biological process，BP） 層面上述基因組主要參與白血病抑制因子信號通路，癌胚素-M介導(dǎo)的信號通路，NK T細(xì)胞分化的調(diào)控，腎小球形態(tài)發(fā)生等生物學(xué)功能；細(xì)胞組成（cellular component，CC） 層面，主要參與細(xì)胞的孔復(fù)合體，異染色質(zhì)的構(gòu)成；細(xì)胞組成（molecular function，MF） 層面，基因組有與蛋白質(zhì)、受體結(jié)合的功能。下載導(dǎo)出GO富集分析結(jié)果，將上述所有功能節(jié)點導(dǎo)入Metascape進(jìn)行可視化分析，見圖4。

圖4 基于轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的KEGG與GO分析Fig.4 KEGG and GO analysis for transportation factor regulatory network

KEGG通路分析結(jié)果顯示，上述基因組主要參與micorRNAs in cancer（Hsa05206） 信號通路，該通路晝夜節(jié)律，朊病毒等信號代謝通路，共有9個樞紐基因參與此通路調(diào)節(jié)（P＜ 0.05）。

運用Cytoscape中CytoHubba插件篩選關(guān)鍵基因構(gòu)建相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖5），富集顯示排在前5位的樞紐基因分別為CD34、TGFBR2、MEF2C、SOX4和VCL。

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與Hubba分析Fig.5 PPI network construct and Hubba analysis

3 討論

E2F1是E2F轉(zhuǎn)錄因子家族的重要一員，參與人體生命活動中重要的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡環(huán)節(jié)，E2F1促進(jìn) S 期的細(xì)胞增多，同時通過p53依賴和非依賴途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［2］。近來研究［5-6］顯示，E2F1在多種腫瘤中過表達(dá)，其作用為促癌基因，且表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。

研究構(gòu)建的TF-miRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建展現(xiàn)了泛腫瘤組中6個抑制表達(dá)的miRNAs與其所調(diào)控靶基因之間的關(guān)系。miRNA-7參與多種細(xì)胞途徑，其正常表達(dá)多在腫瘤細(xì)胞中起抑癌作用。miRNA-7在腫瘤進(jìn)展和MDR調(diào)控中的作用已被驗證［7］；腫瘤細(xì)胞中miRNA-9的下調(diào)被證實限制了抗癌治療的有效性。miRNA-9在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)被證實與胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)［8-9］；miRNA-17基因簇被證實提升肝癌細(xì)胞的自我更新、增殖、遷移能力的功能［10］；miRNA-21的差異表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的高增殖、低凋亡、高侵襲和轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)［11］；miRNA-22在結(jié)消化系統(tǒng)癌癥患者血清中的表達(dá)下調(diào)現(xiàn)象與癌癥的臨床病理特征密切相關(guān)［12］；miRNA-24正常表達(dá)可靶向CARMA3抑制胃癌細(xì)胞的增殖、進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡［13］。上述miRNAs已被研究［14］證實與多種癌癥發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系，本研究構(gòu)建的KEGG通路亦可佐證此結(jié)論。然而，目前已有研究多針對單個miRNA調(diào)控展開，miRNAs基因簇在泛基因組腫瘤間的整體調(diào)控機制尚乏研究，其上游基因調(diào)控機制仍待探索。

GO結(jié)果顯示，相關(guān)基因組在生物學(xué)功能層面主要參與癌胚素-M介導(dǎo)的信號通路，該信號通路可調(diào)節(jié)基因激活、細(xì)胞存活、增殖和分化等生物功能。近年來，此通路研究熱度逐年上升［15］。KEGG分析結(jié)果顯示，上述miRNA通過降解靶mRNA或抑制蛋白翻譯來調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［16］。特異性miRNAs的上調(diào)（過表達(dá)） 可能導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)［17］，而其下調(diào)則會導(dǎo)致癌基因表達(dá)的增加［18］，這兩種情況都會導(dǎo)致細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的生長和發(fā)展。研究［19］顯示，不同癌癥中miRNA的表達(dá)存在很大差異。

本研究直觀展現(xiàn)了E2F1所調(diào)控的miRNAs在腫瘤中廣泛參與的復(fù)雜生理過程。通過構(gòu)建 TF-miRNAmRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為未來泛基因組癌癥治療藥物提供了治療靶點的理論基礎(chǔ)。同時為癌癥的預(yù)后分析、鑒別與診斷提供了潛在的應(yīng)用價值。