燕麥鐮孢菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

漆永紅， 曹素芳， 李雪萍， 李敏權(quán)*

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所， 甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院林果花卉研究所， 甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院， 甘肅 蘭州 730070)

青稞(Hordeumvulgare‘nudum’)莖基腐病是青稞苗期和成株期生長(zhǎng)中的一種主要病害之一。苗期田間地上癥狀主要表現(xiàn)為，有明顯的發(fā)病中心、植株長(zhǎng)勢(shì)弱、不同程度發(fā)黃或萎蔫，嚴(yán)重時(shí)會(huì)出現(xiàn)缺埂斷壟、禿斑和整株死亡，根及莖基部變褐縊縮或腐爛等；成株期植株感染莖基腐病后表現(xiàn)為穗白、粒癟、莖桿發(fā)褐或黑紅、根及莖基部縊縮發(fā)干或腐爛等[1]。該病害病原菌主要有燕麥鐮孢菌(Fusariumavenaceum)、木賊鐮孢菌(Fusariumequiseti)、銳頂鐮孢菌(Fusariumacuminatum)、柔毛鐮孢菌(Fusariumflocciferum)和Fusariumlangsethiae等，其中燕麥鐮孢菌為優(yōu)勢(shì)病原菌[1]。青稞莖基腐病田間癥狀表現(xiàn)多樣，其癥狀常因環(huán)境條件、發(fā)病階段、寄主與品種及生育時(shí)期的不同而呈現(xiàn)較大變化。當(dāng)田間癥狀不典型或診斷者經(jīng)驗(yàn)不足時(shí)，僅依據(jù)田間病害癥狀有時(shí)不易準(zhǔn)確判別。因此，建立快速、準(zhǔn)確檢測(cè)青稞莖基腐病菌的方法對(duì)及時(shí)有效的控制該病害有重要的意義。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是Mori等[2]研發(fā)的一種新型核酸擴(kuò)增方法，針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，在鏈置換DNA酶(Bst DNA polymerase)作用下，60～65℃恒溫?cái)U(kuò)增，30～80 min能夠?qū)⑸倭靠截悢?shù)的目的基因擴(kuò)增至109個(gè)[3]。LAMP反應(yīng)產(chǎn)物不僅可以通過濁度儀、real-time PCR儀以及凝膠電泳儀進(jìn)行檢測(cè)，還可以通過SYBR Green I、鈣黃綠素和羥基萘酚藍(lán)等[4-5]染色后用肉眼觀察顏色變化來判斷。LAMP檢測(cè)具有操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、靈敏度高、產(chǎn)物易檢測(cè)等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于真菌、細(xì)菌、病毒、線蟲等病原微生物的檢測(cè)[6-12]，已成功建立了假禾谷鐮孢菌[13]、大麗輪枝菌[14]、番石榴焦腐病[15]等檢測(cè)技術(shù)，關(guān)于青稞莖基腐病燕麥鐮孢菌LAMP檢測(cè)方法未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以燕麥鐮孢菌為目標(biāo)菌，建立以熒光染料SYBR Green I為指示劑的LAMP檢測(cè)技術(shù)用于青稞莖基腐病菌的快速檢測(cè)，為燕麥鐮孢菌的檢測(cè)及其青稞莖基腐病的診斷提供一種新的技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

青稞莖基腐病病株(圖1)采自甘肅省甘南州臨潭縣，同時(shí)采集發(fā)病根際周圍土樣，室內(nèi)分離病原菌，保存于本研究室。

圖1 青稞莖基腐病Fig.1 Naked barley crown rot disease

主要試劑：Bst2.0 DNA聚合酶、熒光染料SYBR Green I、MgSO4、dNTP等，購(gòu)自天根生物科技有限公司。

1.2 菌株培養(yǎng)和基因組DNA提取

菌株用常規(guī)的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)?；蚪MDNA提取采用E. Z. N. ATM. HP Fungal DNA Kit試劑盒(OMEGA Bio-tek)的具體步驟進(jìn)行。

1.3 病原菌ITS序列的擴(kuò)增及LAMP引物的設(shè)計(jì)

對(duì)青稞莖基腐病菌ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增(94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸80 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存)、PCR產(chǎn)物用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收、測(cè)序(北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司)，獲得其病菌燕麥鐮孢菌的ITS序列。應(yīng)用LAMP設(shè)計(jì)軟件primer software PrimerExplorer V4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.Html;Eiken Chemical Co.,Japan)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，包括2條外引物F3和B3，2條內(nèi)引物FIP、BIP(表1)。

表1 設(shè)計(jì)的LAMP引物序列Table 1 Necleotide sequences of LAMP primers

1.4 LAMP反應(yīng)體系的建立

在60～65℃范圍內(nèi)對(duì)反應(yīng)溫度進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)時(shí)間1 h，以確定LAMP引物的最佳反應(yīng)溫度。優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系：10×Isothermal Amplification Buffe (1～3 μL)，100 m M MgSO4(0.5～2) μL，F(xiàn)IP Primer (0.5～1.5) μL，BIP Primer (0.5～1.5) μL，F(xiàn)3 Primer (0.5～1.5) μL，B3 Primer (0.5～1.5) μL，10 mM dNTP (2.0～4.0) μL，模板DNA (2.0～4.0) μL，8 000 U·mL-1的Bst2.0 DNA聚合酶(0.5～1.5) μL，加ddH2O (8.0～11.0) μL至總25 μL體系。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 擴(kuò)增結(jié)果判斷方法

反應(yīng)結(jié)束后取3 μL產(chǎn)物，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，若出現(xiàn)連續(xù)階梯狀條帶，則判定為陽(yáng)性；未出現(xiàn)條帶，則判定為陰性。同時(shí)加入0.5 μL熒光染料SYBR Green I，通過肉眼觀察LAMP反應(yīng)液是否發(fā)生顏色變化來判斷結(jié)果，陽(yáng)性反應(yīng)為黃綠色，陰性反應(yīng)為橘色。

1.6 燕麥鐮孢菌LAMP檢測(cè)體系的特異性驗(yàn)證

選擇7個(gè)不同地區(qū)來源(表2)的燕麥鐮孢菌菌株DNA作為模板，同時(shí)以ddH2O替代目標(biāo)菌的DNA模板為陰性對(duì)照，以燕麥鐮孢菌相近種尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporium)和其他3個(gè)非鐮孢菌(Phytophthorainfestans、Botrytiscinerea、Rhizoctoniasolani)的基因組DNA為模板作為對(duì)照，進(jìn)行LAMP反應(yīng)，觀察反應(yīng)管顏色變化和2%瓊脂糖凝膠電泳是否出現(xiàn)階梯狀條帶來判定結(jié)果，試驗(yàn)重復(fù)3次。

表2 青稞莖基腐病燕麥鐮孢菌菌株及其來源Table 2 Fusarium avenaceum causing naked barley crown rot disease and their locality

1.7 燕麥鐮孢菌LAMP檢測(cè)體系的靈敏度驗(yàn)證

采用10倍濃度系列稀釋法將提取的青稞莖基腐病燕麥鐮孢菌DNA進(jìn)行梯度稀釋，使其質(zhì)量濃度梯度依次為100 ng·μL-1、10 ng·μL-1、1 ng·μL-1、100 pg·μL-1、10 pg·μL-1，分別取2 μL作為模板進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后觀察反應(yīng)管顏色變化和2%瓊脂糖凝膠電泳是否出現(xiàn)階梯狀條帶來判定結(jié)果。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 田間發(fā)病組織中燕麥鐮孢菌的檢測(cè)

供試24份青稞莖基腐病疑似病害樣本采自甘肅省甘南州卓尼縣和臨潭縣，每份樣品取200 mg病組織，按照E. Z. N. ATM. HP Fungal DNA Kit試劑盒說明書提取發(fā)病組織DNA，將其作為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，以燕麥鐮孢菌純DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，滅菌水作為陰性對(duì)照。

1.9 土壤中燕麥鐮孢菌檢測(cè)的靈敏度

在燕麥鐮孢菌平板中加5 mL無菌水，輕輕刮下鐮孢菌的孢子，制備孢子懸浮液。取每份不含燕麥鐮孢菌的土樣(該土樣經(jīng)燕麥鐮孢菌LAMP檢測(cè)呈陰性) 1 g，放入2 mL的EP管中，分別添加不同數(shù)量的孢子(40 000、4 000、400、40、4個(gè))。按照E. Z. N. ATM. HP Fungal DNA Kit提取試劑盒說明書提取土壤樣品總DNA，將其作為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，并以燕麥鐮孢菌純DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，滅菌水作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP反應(yīng)體系的建立

優(yōu)化后用于檢測(cè)青稞莖基腐病燕麥鐮孢菌的LAMP最佳反應(yīng)體系25 μL：10×Isothermal Amplification Buffe 2.5 μL，100 mM MgSO41.5 μL，F(xiàn)IP Primer 1 μL，BIP Primer 1 μL，F(xiàn)3 Primer 1 μL，B3 Primer 1 μL，10 mM dNTP 3.5 μL，模板DNA 2.5 μL，8 000 U·mL-1的Bst2.0 DNA聚合酶1 μL，ddH2O 10 μL。通過反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化，確定LAMP引物最佳反應(yīng)溫度為65℃。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 1 h，80℃ 20 min。肉眼觀察燕麥鐮孢菌LAMP反應(yīng)液陽(yáng)性為黃綠色，而對(duì)照產(chǎn)物為橘色，呈陰性(圖2A)。2%瓊脂糖凝膠電泳顯示，陽(yáng)性出現(xiàn)連續(xù)階梯狀條帶，而陰性未出現(xiàn)條帶(圖2B)。

圖2 燕麥鐮孢菌LAMP反應(yīng)體系的建立Fig.2 The detection of F. avenaceum by LAMP注：(A)LAMP反應(yīng)體系顏色變化；(B)2%瓊脂糖凝膠電泳(1：燕麥鐮孢菌；2：陰性對(duì)照)Note：(A) The specificity of LAMP for F. avenaceum was detected by SYBR Green I;(B) 2.0% agarose gel electrophoresis. Lane M:DL 2 000 DNA marker;Lane 1:F. avenaceum;Lane 2:Negative control.

2.2 特異性檢測(cè)

7個(gè)不同地理來源的青稞莖基腐病燕麥鐮孢菌LAMP檢測(cè)均顯示黃綠色，而陰性對(duì)照(CK)和其它 4個(gè)病原菌LAMP檢測(cè)均顯示橘色(圖3A)。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，陽(yáng)性均出現(xiàn)梯度條帶，陰性對(duì)照和其它4個(gè)病原菌則沒有出現(xiàn)任何條帶(圖3B)。以上結(jié)果表明，該LAMP引物能夠特異性的檢測(cè)不同地理來源的青稞莖基腐病燕麥鐮孢菌。

圖3 燕麥鐮孢菌LAMP特異性檢測(cè)Fig.3 Specificity of LAMP detection for different F. avenaceum strains

2.3 靈敏度驗(yàn)證

以10 pg為模板時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物仍然可顯示黃綠色(圖4A)，說明該LAMP反應(yīng)體系可以檢測(cè)到10 pg的燕麥鐮孢菌DNA。2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，100 ng～10 pg模板DNA均可出現(xiàn)梯度條帶，而對(duì)照ddH2O模板未出現(xiàn)條帶(圖4B)。

圖4 燕麥鐮孢菌LAMP靈敏度檢測(cè)Fig.4 Sensitivity of LAMP assay to detect serially diluted genomic DNA from 100 ng to 10 pg with F. avenaceum

2.4 田間發(fā)病組織中燕麥鐮孢菌的檢測(cè)

20份甘肅省甘南州卓尼縣和臨潭縣青稞莖基腐病疑似病害樣本提取的DNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，13份為陽(yáng)性，其中卓尼縣5份(圖5)，臨潭縣8份(圖6)。同時(shí)對(duì)陽(yáng)性的樣本進(jìn)行組織分離，分離獲得的菌株經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和ITS測(cè)序鑒定為燕麥鐮孢菌。以上結(jié)果表明，該技術(shù)能夠排除寄主植物及其他非目標(biāo)菌的干擾，快速、準(zhǔn)確地從青稞發(fā)病組織中檢測(cè)出燕麥鐮孢菌。LAMP檢測(cè)技術(shù)用于燕麥鐮孢菌的檢測(cè)和青稞莖基腐病的快速診斷。

圖5 甘肅省甘南州卓尼縣青稞莖基腐病LAMP檢測(cè)Fig.5 LAMP assay for diseased naked barley from Zhuoni county注：1～10：發(fā)病樣品；11：陽(yáng)性對(duì)照；12：陰性對(duì)照，下同Note：Tuber 1-10:Diseased naked barley samples;Tuber 11:Positive control;Tuber 12:Negative control,the same as below

圖6 甘肅省甘南州臨潭縣青稞莖基腐病LAMP檢測(cè)Fig.6 LAMP assay for diseased naked barley from Lintan county

2.5 土壤中燕麥鐮孢菌的檢測(cè)靈敏度

圖7表明，1號(hào)陽(yáng)性對(duì)照，2～5號(hào)燕麥鐮孢菌40 000、4 000、400、40個(gè)孢子懸浮液LAMP檢測(cè)均呈黃綠色的陽(yáng)性反應(yīng)，表明LAMP技術(shù)在每克土壤中檢測(cè)的靈敏度為40個(gè)燕麥鐮孢菌孢子。5號(hào)燕麥鐮孢菌4個(gè)孢子懸浮液LAMP檢測(cè)呈橘色的陰性反應(yīng)，表明LAMP檢測(cè)對(duì)土壤中4個(gè)燕麥鐮孢菌孢子懸浮液未檢測(cè)到，6號(hào)陰性對(duì)照呈現(xiàn)橘色。本方法可用于土壤中攜帶燕麥鐮孢菌的高靈敏度檢測(cè)。

圖7 土壤中燕麥鐮孢菌的檢測(cè)Fig.7 Sensitivity of the LAMP assay in soil containing different number of spores注：1號(hào)：陽(yáng)性對(duì)照；2～6號(hào)：40 000、4 000、400、40、4個(gè)孢子懸浮液；7號(hào)：陰性對(duì)照Note：Tuber 1:Positive control;Tuber 2-6:Soil with different amount of spores 40 000,4 000,400,40 and 4,respectively;Tuber7:Negative control

3 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，以ITS為靶標(biāo)的普通PCR分子檢測(cè)[16]、RAPD-PCR方法[17]、巢式PCR技術(shù)[18,19]、實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)[20-21]、IGS-PCR[22]等用于不同病原菌的檢測(cè)，但這些檢測(cè)方法需要的檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，準(zhǔn)確性和靈敏度偏低。本試驗(yàn)以熒光染料SYBR Green I為指示劑，首次建立了青稞莖基腐病燕麥鐮孢菌LAMP快速檢測(cè)方法，本方法的建立與應(yīng)用為燕麥鐮孢菌的檢測(cè)及其青稞莖基腐病的診斷提供一種新的技術(shù)。

LAMP技術(shù)已成功用于尖孢鐮孢菌[23]、木賊鐮孢菌和禾谷鐮孢菌[24]等多種植物病原菌的檢測(cè)。紀(jì)睿等[25]利用LAMP技術(shù)檢測(cè)雪松疫霉根腐病菌(Phytophthoralateralis)，在靈敏度檢測(cè)中，最低檢測(cè)限為 100 pg·μL-1。張吉紅等[26]采用LAMP建立了煙草環(huán)斑病毒檢測(cè)法，60℃擴(kuò)增60 min，整個(gè)檢測(cè)過程約1.5 h。本試驗(yàn)首次利用LAMP技術(shù)進(jìn)行了燕麥鐮孢菌的檢測(cè)。與PCR技術(shù)相比，本試驗(yàn)中LAMP檢測(cè)技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)引物特異性強(qiáng)。在LAMP體系中，4條引物特異性識(shí)別靶標(biāo)基因的6個(gè)區(qū)域，而在PCR體系中只有2條引物識(shí)別2個(gè)區(qū)域。本試驗(yàn)應(yīng)用LAMP設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)4條引物，包括2條外引物F3、B3和2條內(nèi)引物FIP、BIP，7個(gè)不同地理來源的青稞莖基腐病燕麥鐮孢菌LAMP檢測(cè)均呈黃綠色(陽(yáng)性)，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)均出現(xiàn)梯度條帶，而對(duì)照和其他病原菌均呈橘色(陰性)，電泳檢測(cè)沒有條帶。(2)檢測(cè)靈敏度高。LAMP技術(shù)檢測(cè)靈敏度比普通PCR技術(shù)高10～1000倍。本試驗(yàn)靈敏度驗(yàn)證結(jié)果表明，LAMP反應(yīng)液檢測(cè)靈敏度在DNA水平達(dá)到10 pg，2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，100 ng～10 pg的模板DNA均出現(xiàn)梯度條帶。(3)反應(yīng)速度快。PCR一般需要3～6 h，本試驗(yàn)優(yōu)化的LAMP反應(yīng)體系最佳反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 1 h，80℃ 20 min。(4)直接用肉眼觀察結(jié)果。本試驗(yàn)LAMP技術(shù)在反應(yīng)完成后加入熒光染料SYBR Green I，通過肉眼觀察LAMP反應(yīng)液是否發(fā)生顏色變化來判斷結(jié)果，陽(yáng)性反應(yīng)為黃綠色，陰性反應(yīng)為橘色。(5)準(zhǔn)確性高。本試驗(yàn)中，擴(kuò)增產(chǎn)物的陰陽(yáng)性，加入熒光染料SYBR Green I顏色變化檢測(cè)的結(jié)果和凝膠電泳是否出現(xiàn)梯度條帶完全吻合。(6)不易污染。熒光染料SYBR Green I可以在LAMP反應(yīng)前加入到反應(yīng)液中，可以有效避免反應(yīng)后開蓋加入熒光染料造成的污染問題。

本試驗(yàn)LAMP技術(shù)對(duì)疑似病害樣本提取的DNA進(jìn)行檢測(cè)，只需要提取青稞發(fā)病部位的總DNA就可以檢測(cè)到燕麥鐮孢菌的有無，該技術(shù)能夠檢測(cè)出青稞發(fā)病組織中的燕麥鐮孢菌，排除了病害樣本上含有多種微生物，手工不易分離純化到目標(biāo)菌的人為因素影響。另外，本試驗(yàn)LAMP技術(shù)在土壤中檢測(cè)的靈敏度為每克土壤40個(gè)燕麥鐮孢菌孢子，土壤檢測(cè)靈敏度很高。與普通PCR相比，本試驗(yàn)在燕麥鐮孢菌ITS特異序列基礎(chǔ)上建立了青稞莖基腐病菌LAMP簡(jiǎn)便、靈敏、快速和準(zhǔn)確的方法，為生產(chǎn)上青稞莖基腐病診斷和防治提供重要的實(shí)用價(jià)值。

本試驗(yàn)僅對(duì)引起青稞莖基腐病的優(yōu)勢(shì)病原菌燕麥鐮孢菌進(jìn)行了LAMP快速檢測(cè)，然而在實(shí)際生產(chǎn)中，引起青稞莖基腐病的病原菌種類很多，為了全面、系統(tǒng)、準(zhǔn)確檢測(cè)青稞莖基腐病的病原菌，在今后的研究中應(yīng)該建立多重病原菌LAMP快速分子檢測(cè)技術(shù)。

4 結(jié)論

首次建立了青稞莖基腐病燕麥鐮孢菌LAMP快速檢測(cè)技術(shù)，最佳反應(yīng)溫度為65℃，LAMP反應(yīng)液檢測(cè)靈敏度在DNA水平達(dá)到10 pg·μL-1，土壤靈敏度檢測(cè)為每克土壤40個(gè)燕麥鐮孢菌孢子。本方法的建立與應(yīng)用為燕麥鐮孢菌的檢測(cè)及其青稞莖基腐病的診斷提供了一種新技術(shù)。