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    主養(yǎng)“海蜇-縊蟶”生態(tài)養(yǎng)殖池塘細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征及其環(huán)境驅(qū)動因子

    2022-03-22 03:54:50何洛迪馬悅欣尹東鵬
    微生物學(xué)雜志 2022年6期
    關(guān)鍵詞:菌門沉積物群落

    陳 杰, 何洛迪, 魏 杰, 趙 文, 馬悅欣, 王 宇, 張 灣, 尹東鵬

    (大連海洋大學(xué) 遼寧省水生生物學(xué)重點實驗室,遼寧 大連 116023)

    綜合養(yǎng)殖是利用生物不同的營養(yǎng)生態(tài)位,使養(yǎng)殖系統(tǒng)中的營養(yǎng)物質(zhì)多次反復(fù)利用而提高其利用率的一種養(yǎng)殖模式[1],也稱生態(tài)養(yǎng)殖。近年來,主養(yǎng)“海蜇-縊蟶”的生態(tài)養(yǎng)殖模式在遼東地區(qū)得到了推廣和普及,如遼寧省東港市2019年海水池塘養(yǎng)殖面積約0.67×104hm2,其中池塘立體養(yǎng)殖面積超0.47×104hm2,產(chǎn)值過億元[2]。目前,對該模式生態(tài)養(yǎng)殖研究主要圍繞食物網(wǎng)關(guān)系[3-4]、生源要素即碳、氮和磷[5]、懸浮顆粒物和有機(jī)碳[6]等方面展開,對細(xì)菌群落的研究鮮有報道。細(xì)菌群落可以反映養(yǎng)殖環(huán)境的健康狀況,并參與生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動[7]。同時養(yǎng)殖生物也受到細(xì)菌群落的影響,如某些有益菌可參與水質(zhì)調(diào)控,將氨、亞硝酸鹽和硫化氫這類有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化為低毒或無毒結(jié)構(gòu),以利于養(yǎng)殖生物生存與生長[8];此外,某些致病菌在達(dá)到其適宜生長條件時會呈爆發(fā)性增長導(dǎo)致養(yǎng)殖生物疾病發(fā)生[9]。因此,研究養(yǎng)殖池塘中細(xì)菌群落特征,能更好地監(jiān)測養(yǎng)殖環(huán)境和防控養(yǎng)殖生物發(fā)生疾病。有關(guān)養(yǎng)殖池塘細(xì)菌群落多樣性的研究多集中于傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式,如暗紋東方鲀(Takifuguobscurus)[10]、大黃魚(Larimichthyscrocea)[11],南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)[12],凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[13]等單一生物養(yǎng)殖池塘的細(xì)菌群落多樣性,而對生態(tài)養(yǎng)殖池塘的報道較少[14-16]。本研究采用16S rDNA高通量測序技術(shù),研究“海蜇-縊蟶”生態(tài)養(yǎng)殖池塘水體與沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征及其主要環(huán)境驅(qū)動因子,旨在為海水生態(tài)養(yǎng)殖模式微生態(tài)環(huán)境調(diào)控提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 綜合養(yǎng)殖池塘概況 試驗養(yǎng)殖池塘位于遼寧省東港市北井子鎮(zhèn)(39°84′99″N;123°82′89″E),池塘面積120 hm2,平均水深1.99 m。以海蜇和縊蟶為主要養(yǎng)殖種類,4月投放體長3~5 cm蟶子苗45筐,20~30萬粒/筐,投放1 cm左右蝦苗70萬尾;5月放3~5 cm規(guī)格海蜇苗90萬尾和7~8 cm規(guī)格牙鲆魚苗10萬尾。投喂餌料為碎末玉筋魚、沙蠶和人工配合飼料。

    1.1.2 主要試劑與儀器設(shè)備 鉬酸銨(天津市化工三廠有限公司),氯化銨、硫酸銨、硫酸錳和EDTA二鈉(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)。便攜式多參數(shù)水質(zhì)分析儀(HQ30d,美國Hach公司);采水裝置為水生80型采水器;采泥裝置為蚌斗式采泥器;抽濾所需設(shè)備及用具為循環(huán)水式多用真空泵(SHZ-D(Ⅲ),河南省予華儀器有限公司);玻璃過濾器(T-50,天津市津騰實驗設(shè)備有限公司);微孔濾膜(孔徑0.2 μm,直徑25 mm,上海興亞凈化材料廠)。

    1.2 方法

    1.2.1 樣品采集及處理 為了全面掌握細(xì)菌群落的動態(tài)變化情況,2021年4月至8月對養(yǎng)殖池塘進(jìn)行水樣和沉積物樣品采集,每月一次。每個池塘采用3點采樣法,即進(jìn)水口、中間和出水口三個位點。分別于每個位點表(水下0.5 m)、中、底(距底0.5 m)三層采水,由于池塘水深變化不大,采用混合采集方式,分層采水5 L混合,取500 mL混合水樣裝入已滅菌采樣瓶中,依次命名為ZCW4、ZCW5、ZCW6、ZCW7、ZCW8;同時每個位點采集池塘底部表層(5 cm內(nèi))沉積物,分別取5 mL混合泥樣裝入已滅菌EP管內(nèi)。養(yǎng)殖周期內(nèi)共采集樣品30個。水樣和沉積物于低溫冰箱儲存,盡快運(yùn)回實驗室處理。室內(nèi)水樣經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,將過濾后的濾膜和沉積物分裝于1.5 mL離心管中,經(jīng)液氮處理5 min后于-80 ℃冰箱保存。

    1.2.3 高通量測序及數(shù)據(jù)分析 水樣和沉積物樣品由北京諾禾致源生物公司進(jìn)行高通量測序。采用CTAB法對樣本基因組DNA進(jìn)行提取,細(xì)菌16S rDNA基因V3~V4片段的擴(kuò)增引物為515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3′)。下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾和質(zhì)控后按照97%一致性進(jìn)行OTUs聚類,再進(jìn)行物種注釋和分類。構(gòu)建測序文庫后在NovoMagic平臺上進(jìn)行多樣性分析、UPGMA聚類分析和Spearman相關(guān)分析等。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 養(yǎng)殖池塘細(xì)菌群落多樣性

    30個樣品共得到平均有效序列657 428條,按照97%的相似性構(gòu)建OTUs并獲得注釋信息的Tags數(shù)目平均為28 216個。水體中OTUs數(shù)目為786~2 141,平均為1 579個;沉積物中OTUs數(shù)目為3 515~4 729,平均為4 045個。水體與沉積物中細(xì)菌分布花瓣圖(圖1)所示,水體中不同月份OTUs共享數(shù)目為288個,而沉積物中OTUs共享數(shù)目為2 035個。

    圖1 養(yǎng)殖池塘水體與沉積物中細(xì)菌分布花瓣圖Fig.1 Distribution of bacteria in water and sediment of aquaculture pondA:水樣,B:沉積物樣品,數(shù)字4~8分別代表采樣月份A:the water sample,B:the sediment sample, and the numbers 4-8 represent the sampling months respectively

    利用Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)比較分析養(yǎng)殖池塘水體與沉積物中細(xì)菌多樣性(表1)。結(jié)果表明,沉積物中細(xì)菌多樣性指數(shù)均明顯高于水體中細(xì)菌多樣性,從時間上來看,5月水體與沉積物中細(xì)菌多樣性指數(shù)均最高,而8月則最低。

    表1 養(yǎng)殖池塘水體與沉積物中細(xì)菌多樣性指數(shù)Table 1 Bacterial diversity index in water and sediment of aquaculture pond

    物種注釋養(yǎng)殖池塘共發(fā)現(xiàn)細(xì)菌112門、173綱、361目、526科、1 076屬、494種,對OTUs豐富度前10的門水平物種相對豐度進(jìn)行UPGMA聚類分析(圖2),結(jié)果表明,浮游細(xì)菌和沉積物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似度低,各聚為一類。變形菌門、擬桿菌門和未分類的菌門為水體與沉積物中共有優(yōu)勢菌門。其中,水體中細(xì)菌優(yōu)勢門類主要為變形菌門46%、藍(lán)細(xì)菌門16%、擬桿菌門11%、放線桿菌門8%和未分類的菌門7%;沉積物中細(xì)菌優(yōu)勢門類主要為變形菌門22%、未分類的菌門16%、脫硫桿菌門14%、擬桿菌門12%、彎曲桿菌門6%、酸桿菌門(Acidobacteriota)4%和厚壁菌門2%。

    圖2 養(yǎng)殖池塘水與沉積物中細(xì)菌門水平上的物種相對豐度Fig.2 Relative abundance of species at the level of bacterial phylum in aquaculture pond water and sediment

    水體中優(yōu)勢菌門變形菌門為α-變形菌,其包含的優(yōu)勢屬分別為Planktomarina(4月為4.7%、5月為4.14%)、慢桿菌屬(Lentibacter)(5月為7%、6月為8.55%)、HIMB11(6月為5.06%、7月為10.35%)、荔枝菌屬(Litorimicrobium)(6月為7.7%、8月為3.29%)、海命菌屬(Marivita)(4月為5.26%、5月為5.78%、6月為1.5%)、雷辛格氏菌屬(Leisingera)(6月為1.83%、7月為7.22%、8月為3.33%)和CladeIa(4月為9.36%、5月為9.15%、6月為9.4%、7月為3.22%和8月為6.99%),以上除CladeIa外均為紅細(xì)菌目(Rhodobacterales)。沉積物中變形菌門為γ-變形菌,其包含的優(yōu)勢菌群分別為伍斯菌屬(Woeseia)(4月為4.26%、5月為6.16%、6月為3.15%、7月為1.36%和8月為3.93%)、弧菌屬(Vibrio)(4月為1.88%)、麗弧菌屬(Aliivibrio)(4月為1.87%)、假單胞菌屬(Pseudomonadaceae)(7月為5.36%)和MND1(6月為2.23%)。

    2.2 細(xì)菌群落與環(huán)境因子的相關(guān)性

    用Spearman相關(guān)研究環(huán)境因子與門水平菌群間相互關(guān)系,得到兩兩之間的相關(guān)性和顯著性(圖3)。在OTUs豐富度前10的菌群門類中,變形菌門、藍(lán)細(xì)菌門和放線桿菌門與TN呈顯著正相關(guān)(P<0.05),與TP呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05);未分類菌門與TN呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),與TP呈極顯著正相關(guān)(P<0.01);彎曲桿菌門與TN呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),與TP呈顯著正相關(guān)(P<0.05);脫硫桿菌門與TN呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),厚壁菌門與TP呈顯著正相關(guān)(P<0.05),其他門類與環(huán)境因子相關(guān)性不明顯。

    圖3 養(yǎng)殖池塘細(xì)菌門水平Spearman相關(guān)性分析Fig.3 Spearman correlation analysis of bacterial phyla level in aquaculture pond縱向為環(huán)境因子,橫向為菌群門類,中間熱圖對應(yīng)的值為Spearman相關(guān)系數(shù),介于-1~1之間,r>0為正相關(guān),r<0為負(fù)相關(guān),*表示有顯著性差異(P<0.05),**表示極顯著差異(P<0.01)The vertical is environmental factors, the horizontal is flora, and the corresponding value of the intermediate heat map is Spearman correlation coefficient, which is between - 1-1,r>0 is positive correlation, r<0 is negative correlation, * indicates significant difference (P<0.05), * * indicates very significant difference (P<0.01)

    3 討 論

    本研究池塘沉積物主要采集表層底泥,其微生物與水體中環(huán)境因子相互作用密切相關(guān),基于此,本研究比較分析了在同一水環(huán)境下水中與沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異。通過16S rDNA高通量測序結(jié)果表明,“海蜇-縊蟶”生態(tài)養(yǎng)殖池塘沉積物中細(xì)菌多樣性指數(shù)明顯高于水體中浮游細(xì)菌多樣性,這與現(xiàn)有研究報道相一致[18-19]。分析原因,主要由于養(yǎng)殖池塘中動物糞便、餌料殘渣和代謝物質(zhì)等多富集于沉積物中[20],給細(xì)菌提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和適宜的環(huán)境條件,使其大量生長繁殖。

    變形菌門和擬桿菌門是水體與沉積物共有優(yōu)勢菌群,變形菌門普遍存在于海洋環(huán)境中,且在數(shù)量上占有絕對優(yōu)勢。這可能是一方面基于現(xiàn)代分子序列數(shù)據(jù)分析,原核生物中變形菌的規(guī)模和數(shù)量是最大和最多的分支[21];另一方面由于養(yǎng)殖環(huán)境中氮磷濃度較高,而變形菌具有脫氮除磷的功能,參與水質(zhì)調(diào)控,維持養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能[22-24]。本研究結(jié)果表明,水體中變形菌的主要類群為α-變形菌綱紅細(xì)菌目,此類細(xì)菌是一類紫色非硫細(xì)菌,通過自身的光合色素(葉綠素a和類胡蘿卜素),利用硫化氫、硫代硫酸鈉和分子氫進(jìn)行光合自養(yǎng),也能用不同基質(zhì)做碳源進(jìn)行異養(yǎng)光合代謝[25]。γ-變形菌為沉積物中變形菌的主要類群,其能利用不同類型和濃度的碳源,參與厭氧氨氧化過程[25]。因此,變形菌在養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)過程中扮演著重要角色。擬桿菌門為水體和沉積物中共有的第二大優(yōu)勢菌門,能分解有機(jī)物和參與碳循環(huán)[26],擬桿菌門中黃桿菌(Flavobacteria)為優(yōu)勢菌群,除對養(yǎng)殖環(huán)境有積極影響外,也可能造成威脅,在高氨氮低溶氧條件下可使魚類誘發(fā)疾病[27]。水中藍(lán)細(xì)菌門未鑒定的Chloroplast菌群豐度也位居前列,在中國明對蝦研究中也有報道[28],譯為“葉綠體”,因此推測其可參與光合作用。沉積物中彎曲桿菌門主要為硫卵菌(Sulfurovum),這是一類硫氧化化能細(xì)菌,在有機(jī)物高度富集的海洋沉積物的硫、氮和氫循環(huán)中起關(guān)鍵作用[12]。此外,值得注意的是沉積物中脫硫桿菌門也占有較大優(yōu)勢,且出現(xiàn)于整個養(yǎng)殖周期。它是一種嚴(yán)格厭氧硫化細(xì)菌,在缺氧條件下轉(zhuǎn)化硫化氫,對環(huán)境和養(yǎng)殖生物造成威脅[29]。

    生物與環(huán)境相互作用,共同維持生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能。研究表明,化學(xué)需氧量和有機(jī)碳是影響夏季仿刺參養(yǎng)殖池塘水體細(xì)菌群落構(gòu)成的主導(dǎo)環(huán)境因子[13],pH、溫度和溶氧量是影響中華絨螯蟹養(yǎng)殖池塘水體菌群結(jié)構(gòu)與功能的主要環(huán)境因子[30],斑點叉尾鮰養(yǎng)殖池塘沉積物菌群結(jié)構(gòu)與透明度和溶解性懸浮物顯著相關(guān)[27]。氮和磷是生物生長所需的主要兩類元素[31],且海洋浮游細(xì)菌對氮磷的需求高[32]。本研究結(jié)果也表明,水體中優(yōu)勢菌群變形菌、藍(lán)細(xì)菌和放線桿菌與總氮呈顯著正相關(guān),與總磷呈顯著負(fù)相關(guān);沉積物中優(yōu)勢菌群為未分類的菌門、脫硫桿菌和彎曲桿菌與總氮呈顯著負(fù)相關(guān),與總磷呈顯著正相關(guān)。由此可看出,總氮和總磷是影響“海蜇-縊蟶”養(yǎng)殖池塘細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征的主要環(huán)境驅(qū)動因子。然而,這些菌群與氮、磷如何相互作用還需進(jìn)一步深入探究。

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