碳酸鹽礦化菌的篩選與鑒定

王其霖 王李忻 單 航 談榮想 羅 強 尹軍霞

(紹興文理學院 生命科學學院，浙江 紹興 312000)

自然界中某些微生物可以通過其自身的生命活動，與周圍環(huán)境介質之間不斷循環(huán)發(fā)生酶化作用生成CO32-，并在有Ca2+存在的環(huán)境下形成具有膠結作用的方解石晶體，此類菌種為碳酸鹽礦化菌[1].碳酸鹽礦化菌在礦化過程中能形成具有膠結功能的碳酸鹽，所以碳酸鹽礦化菌可用于建筑裂縫的修復、水泥基材料表面的防護和加固，石質文物和景觀的保護、沙基材料的膠結等[2]；碳酸鹽礦化菌在沉積碳酸鹽的過程中還能捕獲放射性元素和重金屬離子，可用其來修復和凈化放射性元素、重金屬污染的土壤或地下水[3-6]，王維大等的研究發(fā)現(xiàn)一株耐氰碳酸鹽礦化菌還可固化含氰金礦尾渣中易遷移態(tài)的重金屬鉛向碳酸鹽結合態(tài)轉化[7]，碳酸鹽礦化菌的研究具有廣闊的應用前景.國內在碳酸鹽礦化菌方面的研究起步較晚，且研究主要集中在較少的幾種微生物上，很多研究者國外菌種保藏中心購買菌株用于研究，這大大制約了我國的碳酸鹽礦化菌的開發(fā)應用.本研究試圖從廢棄建筑垃圾,建筑工地等環(huán)境中分離高效沉積CaCO3的碳酸鹽礦化菌，為新的碳酸鹽礦化菌資源的開發(fā)應用奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 樣品來源

從紹興周邊建筑工地、房屋拆建以及重金屬污染板結地等采集土壤樣品.

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，乙酸鈉2，KH2PO42，NaCl5，尿素20，pH7.5；篩選培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨1，氯化鈉5，磷酸二氫鉀2，尿素2，葡萄糖0.1，0.2%的酚紅溶液4 mL，瓊脂20，pH7.5；種子培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨10，氯化鈉5，pH7.5；基礎發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨1，氯化鈉5，磷酸二氫鉀2，尿素2，葡萄糖0.1，pH7.5.

1.3 富集培養(yǎng)

取1 g土樣接種到富集培養(yǎng)基中，30 ℃ 150 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h.

1.4 菌種分離

將富集培養(yǎng)液用無菌水稀釋至合適濃度,取合適的稀釋液0.1 mL涂布至篩選培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)48 h.

1.5 菌種初篩

挑取菌落周圍變紅色的菌株點種在篩選平板上，每個平板上點3處，30 ℃培養(yǎng)48 h，測量各平板菌落周圍變色圈直徑與菌落直徑的比值并平均，選取變色圈和菌落直徑比值大的菌株進行劃線分離純化后,接種至斜面培養(yǎng)24 h后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.6 菌種復篩

挑取2環(huán)初篩菌株接種至100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中,30 ℃，150 r/min培養(yǎng)48 h，每株菌平行接種2瓶.其中一瓶，加入3 g CaC12，混勻5 min，8 000 r/min離心10 min，去除上清液，在沉淀物中滴加稀鹽酸，產生明顯氣泡的則說明沉淀為碳酸鈣[8].另一瓶則用來檢測菌株的碳酸鈣沉積量和單位體積產率.

碳酸鈣單位體積產率參考錢春香等的方法[9].碳酸鈣沉積量參考竹文坤等的方法[10].

選取碳酸鈣沉積量和碳酸鈣單位體積產率較大的1株菌，進一步純化3代后，斜面保藏備用.

1.7 菌種鑒定

菌種形態(tài)和生理生化鑒定參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[11]；16S rDNA測序參照李蕓等的方法[12].

2 結果與分析

2.1 高效碳酸鹽礦化菌的分離

從混合土樣中分離到10株碳酸鹽礦化菌，分別從1-10編號.

2.2 菌株的初篩

10株菌的初篩結果見表1.

表1 菌株的初篩結果

10株菌在平板上變色圈和菌落直徑比值范圍在1.53～2.60之間，說明10株菌都具有較強的碳酸鹽礦化能力，選取比值超過1.70的2號、3號、5號、6號、7號5株菌進行復篩.

2.3 菌株的復篩

5株菌的培養(yǎng)沉淀物滴加稀鹽酸后，離心管中均有大量的氣泡產生，說明5株菌的沉淀物都含大量碳酸鈣.具體復篩結果見表2.

表2 5株菌的碳酸鈣沉積量和單位體積產率

5株菌中，2號菌的碳酸鈣沉積量最高(0.303 g)，單位體積產率達12.8%，只比5號菌(命名為SZW5)的單位體積產率低0.5%(表2)，所以2號菌沉積碳酸鈣的能力最強，將2號菌命名為SZW2，并對其進行鑒定.

2.4 菌株鑒定

2.4.1 形態(tài)特征

SZW2在篩選平板上培養(yǎng)兩天后，整個平板由黃變紅，菌落光滑，無色透明，直徑約5 mm.革蘭氏染色陰性，大小0.5～0.8 μm×1～2 μm，球桿狀，單個、成雙或短鏈狀排列,見圖1與圖2.

圖1 SZW2在篩選平板上的菌落形態(tài)

圖2 SZW2革蘭氏染色

2.4.2 生化特征(見表3)

表3 SZW2生理生化特征

2.4.3 16S rDNA測序和系統(tǒng)發(fā)育分析

由電泳圖可見,擴增得到的目的片段長約1.5 kb左右,PCR反應體系無細菌污染(圖3)，寶生物工程(大連)有限公司DNA測序,確定擴增的16S rDNA片段長度為1 451 bp，GenBank中核酸數(shù)據(jù)進行BLAST分析,利用ClustalX1.8.1進行比對,MEGA4軟件按Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4，圖中可見菌株SZW2位于Klebsiellapneumoniae分支上,經(jīng)同源性比較發(fā)現(xiàn)SZW2與Klebsiellapneumoniae(KY417867)的序列相似性達100%,結合形態(tài)和生理生化特征，SZW2被鑒定為肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae).

圖3 PCR產物電泳圖

圖4 SZW2的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

碳酸鹽礦化菌可用于建筑物和古跡裂縫的修復、沙土的加固、石質材料的保護和強化等領域[1-2]，也可用于土壤或地下水中重金屬污染的修復和凈化[7,13-14]，所以碳酸鹽礦化菌的研究一直是國際上研究的熱點，已報道的碳酸鹽礦化菌主要有芽孢桿菌、硫酸鹽還原菌、粘細菌、藍細菌等，以芽孢桿菌為主，如嗜堿芽孢桿菌[15]、巴斯德芽孢桿菌[16]、巨大芽孢桿菌[17]、蘇云金芽孢桿菌[18]、巴氏芽孢桿菌[19]等.本研究從紹興周邊建筑工地、房屋拆建以及重金屬污染板結地等土壤樣品中分離到5株高效沉積碳酸鈣的菌株，其中2號菌(命名為SZW2)的碳酸鈣沉積能力最強，經(jīng)形態(tài)、生理生化和分子鑒定，SZW2為肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae).目前尚未見有關肺炎克雷伯菌沉積碳酸鈣方面的報道，本研究豐富了碳酸鹽礦化菌的菌種資源庫，為該菌的進一步開發(fā)利用奠定了基礎.