10種農(nóng)業(yè)化學品對柑橘內(nèi)生菌枯草芽孢桿菌L1-21的影響

李詠梅， 蔣佳容， Shahzad MUNIR， 何鵬飛， 吳毅歆， 謝金思， 潘祖賢， 何鵬搏， 何月秋*

1云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，云南 昆明 650201； 2云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術學院,云南 昆明650201

柑橘CitrusreticulataBlanco在生長期間，各種病蟲害，如紅蜘蛛TetranychusurticateKoch、潛葉蛾PhyllocnistiscitrellaStainton、蚜蟲Aphiscitricolavan der Goot、鳳蝶PapilioxuthusL.、薊馬ScirtothripscitriMoulton、木虱DiaphorinacitriKuwayama等發(fā)生普遍。在我國南方，紅蜘蛛幾乎無越冬現(xiàn)象，年發(fā)生20多代，危害極其嚴重。又如柑橘潰瘍病、瘡痂病、黃龍病給柑橘產(chǎn)業(yè)造成了巨大損失。為控制潰瘍病和瘡痂病，橘農(nóng)不得不大量施用廣譜殺菌劑，如銅制劑的波爾多液、氫氧化銅、喹啉銅等；為控制柑橘黃龍病，常噴施吡蟲啉、辛硫磷、高效氯氰菊酯、噻蟲嗪防治傳病媒介——柑橘木虱DiaphorinacitriKuwayama(陳國慶等，2012； 宋曉兵等，2015)。為了節(jié)約時間和降低勞動強度，用戶常將不同農(nóng)藥混用(華飛雯，2016； 吳志華，2015)，或者大量施用保險藥，從而出現(xiàn)濫用、亂用農(nóng)藥現(xiàn)象。

柑橘植株體內(nèi)存在大量的內(nèi)生菌，包括真菌、細菌和放線菌等(鄭雪芳等，2012； Munir etal.,2018)。這些內(nèi)生菌經(jīng)過與柑橘長期共同進化，成為健康植株不可或缺的一部分。然而，人們在噴施各類化學農(nóng)藥時，主要針對目標病蟲害，并未考慮內(nèi)生菌。采用廣譜性農(nóng)藥單施或者2種及2種以上藥劑混施，不可避免地殺死大量有益內(nèi)生菌?？莶菅挎邨U菌BacillussubtilisL1-21為一株分離自柑橘葉片的有益內(nèi)生細菌，可定殖于柑橘葉片內(nèi)(Muniretal.,2018)。為了明確化學農(nóng)藥及微肥對內(nèi)生菌的影響和指導用藥與施肥，本文采用枯草芽孢桿菌L1-21為指示菌，測定6種殺蟲劑、3種殺菌劑和1種微肥在實驗室條件下與大田中對該菌株的抑制活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 枯草芽孢桿菌 L1-21(下稱L1-21)，由本實驗室自健康柑橘葉片上分離并保存，屬內(nèi)生菌。該菌株菌落背面呈品紅色，邊緣有火山口樣皺疊，易于識別。L1-21菌株的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)標記菌株L1-21-GFP由本實驗室構(gòu)建。

除有特殊說明之外，L1-21的常規(guī)培養(yǎng)基為LB固體或液體培養(yǎng)基。供試的10種農(nóng)業(yè)化學品先用無菌水稀釋至一定濃度，依照設定的濃度梯度，利用1/1000電子天平精確稱取，添加到已滅菌并冷卻到50 ℃上下的定量LB培養(yǎng)基中，混勻后倒入培養(yǎng)皿中制成平板待用。液體培養(yǎng)條件為37 ℃、160 r·min-1振蕩培養(yǎng)，固體培養(yǎng)在37 ℃溫箱中進行。L1-21-GFP所用培養(yǎng)基中含終濃度10 μg·mL-1的氯霉素(Cm)。

1.1.2 供試農(nóng)業(yè)化學品 殺蟲劑6種：70%吡蟲啉水分散粒劑(山東濱農(nóng)科技有限公司)、21%蟲螨腈懸浮劑(廣東植物龍生物技術有限公司)、25%噻蟲嗪水分散粒劑(河南田豐上品生物科技有限公司)、1%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽微乳劑(山東省青島泰生生物科技有限公司)、40%辛硫磷乳油(江蘇省徐州市臨黃農(nóng)藥廠)、5.7%氟氯氰菊酯水乳劑(山東省綠士農(nóng)藥有限公司)。

殺菌劑3種：33.5%喹啉銅懸浮劑(浙江海正化工股份有限公司)、80%硫磺水分散粒劑(印度伊克勝作物護理有限公司)、86.2%氧化亞銅可濕性粉劑(天津市綠亨化工有限公司)。

微肥：EDTA-Cu(乙二胺四乙酸銅鈉，廣州市快速路生物科技有限公司)。

1.1.3 供試作物 柑橘品種為“沃柑”。溫室試驗“沃柑”為1年樹齡的健康植株，每2周澆一次霍格蘭(Hoagland)溶液。田間試驗“沃柑”為5年樹齡的掛果健康植株。

1.2 試驗方法

1.2.1 農(nóng)業(yè)化學品對L1-21生長的影響 殺蟲劑、殺菌劑按照中國農(nóng)藥信息網(wǎng)(http:∥www.chinapesticide.org.cn/)登記的濃度，EDTA-Cu按照產(chǎn)品包裝推薦量，將固體LB培養(yǎng)基溶化適宜溫度時，加入農(nóng)業(yè)化學品，終濃度為田間登記使用濃度的0.25、0.50、1.00、2.00、4.00和6.00倍，制作平板，以不加入農(nóng)業(yè)化學品的為空白對照(CK)。將L1-21稀釋至103CFU·mL-1，涂布于固體LB培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)8～10 h。4次重復。

1.2.2 農(nóng)業(yè)化學品對L1-21在離體柑橘葉片定殖的影響 取室內(nèi)1年樹齡的“沃柑”植株當年生成熟葉片，選用4倍田間登記使用濃度的殺蟲劑、殺菌劑和EDTA-Cu，分別與等量的L1-21-GFP菌株懸液(濃度為5×107CFU·mL-1)混合搖勻，使得農(nóng)業(yè)化學品的終濃度為田間登記使用濃度的2倍，未加任何農(nóng)業(yè)化學品的菌懸液(2.5×107CFU·mL-1)為對照(CK)。每個處理9個葉片，用50 mL的噴瓶均勻噴施于柑橘離體葉片正反兩面，置于室溫25～30 ℃環(huán)境下保濕24 h后，稱1 g葉片于無菌操作臺，以75%(v∶v)酒精消毒30 s，2.5%(有效氯)次氯酸鈉消毒1 min，再用無菌水換洗3次，取最后的無菌水100 μL涂布于LB平板上，以無任何菌落長出為表面消毒徹底，以除去葉表微生物(鄭雪芳等，2012)。用滅菌剪刀剪碎葉片后，置于無菌研缽內(nèi)，加入9 mL無菌水研磨至勻漿。再以10倍梯度稀釋法逐級稀釋，不同梯度取100 μL稀釋液均勻涂布于含Cm固體LB平板上，統(tǒng)計每個直徑9 cm平板內(nèi)長30～100個細菌菌落的結(jié)果，培養(yǎng)條件和樣本數(shù)同1.2.1。在光電折射儀下記數(shù)熒光菌落數(shù)，以CFU·g-1表示。

1.2.3 農(nóng)業(yè)化學品對柑橘活體葉片內(nèi)生菌的影響 田間試驗在云南省賓川縣州城鎮(zhèn)華僑社區(qū)四組柑橘園中進行，除供試的農(nóng)業(yè)化學品外，整個試驗期間不施用其他任何化學品。

于傍晚7點后，將5×107CFU·mL-1濃度的L1-21菌懸液均勻地噴施于葉片正反兩面，24 h后，以前述10種化學品的田間2倍用量稀釋液均勻噴施于柑橘葉片上，以葉片正反兩面濕潤不下滴為度。24 h后，每個處理取東南西北4個方向的成熟葉片總12片，檢測其內(nèi)L1-21和內(nèi)生細菌總量。檢測方法除培養(yǎng)基中未加抗生素Cm外，其他同1.2.2，統(tǒng)計品紅色的菌落數(shù)量為L1-21的結(jié)果，細菌總數(shù)量為內(nèi)生細菌總量的結(jié)果。各化學品均重復3次，以噴水為空白對照(CK)。

1.3 抑菌效果計算

各處理的抑菌效果均以菌落抑制率計算，用Excel 2007和DPS 7.05統(tǒng)計，以Duncan′s新復極差法比較各處理差異顯著性。

抑制率/%=(對照菌落數(shù)量-處理菌落數(shù)量)/對照菌落數(shù)量×100

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)業(yè)化學品在室內(nèi)對L1-21菌株的抑制作用

2.1.1 殺蟲劑 根據(jù)菌落數(shù)，6種殺蟲劑對L1-21均具有顯著抑制作用(表1)。吡蟲啉、蟲螨腈、甲氨基阿維菌素、噻蟲嗪、辛硫磷0.25倍田間登記最高用量對L1-21有抑制作用，當用量達田間登記最高用量1倍時，L1-21被100%抑制，氟氯氰菊酯0.25倍的田間登記最高用量對L1-21的抑制率達100%，即這6種殺蟲劑對柑橘內(nèi)生菌L1-21有很強的抑制作用。

2.1.2 殺菌劑和微肥 根據(jù)菌落數(shù)，3種殺菌劑和微肥EDTA-Cu對L1-21均具有極顯著抑制作用(表2)。按生產(chǎn)上推薦最高劑量來試驗，喹啉銅402.00 mg·L-1、硫磺3728.00 mg·L-1、氧化亞銅620.60 mg·L-1、EDTA-Cu 1283.80 mg·L-1的抑制率都達100%，L1-21完全不能生長。

表1 6種殺蟲劑對L1-21菌株的影響Table 1 Inhibitory effect of six pesticides on the endophyte L1-21

續(xù)表1

表2 殺菌劑和微肥EDTA-Cu對L1-21菌株的影響Table 2 Inhibitory effect of bactericides and the micro-nutrient fertilizer EDTA-Cu on the growth of the endophyte L1-21

2.2 農(nóng)業(yè)化學品對離體柑橘葉片內(nèi)L1-21菌株的影響

6種殺蟲劑的田間登記使用量2倍藥有效濃度的吡蟲啉(112.00 mg·L-1)、蟲螨腈(243.60 mg·L-1)、氟氯氰菊酯(91.02 mg·L-1)、甲氨基阿維菌素(8.00 mg·L-1)、噻蟲嗪(100.00 mg·L-1)和辛硫磷(1600.00 mg·L-1)對L1-21的抑制率分別為76.13%、76.13%、81.16%、16.83%、85.80%、80.65%。除甲氨基阿維菌素8.00 mg·L-1的抑制率顯著低于其他5種殺蟲劑外，其他5種殺蟲劑的抑制率均無顯著差異。喹啉銅804.00 mg·L-1、硫磺7456.00 mg·L-1、氧化亞銅1241.20 mg·L-1和EDTA-Cu 2567.60 mg·L-1對L1-21的抑制率均高于80%，分別為83.50%、85.90%、86.42%、84.81%，且差異不顯著(表3)，但所有化學品對離體葉片內(nèi)的L1-21的抑制作用小于其直接對L1-21菌體的作用。

表3 農(nóng)業(yè)化學品對離體柑橘葉片中L1-21菌株的抑制率Table 3 Inhibition rate caused by various agrochemicals to the growth of the endophyte L1-21 in detached citrus leaves

2.3 農(nóng)業(yè)化學品對活體柑橘葉片內(nèi)L1-21和內(nèi)生菌總量的影響

6種殺蟲劑田間登記用量的2倍劑量處理活體柑橘葉片后，24 h采樣檢測的結(jié)果表明，甲氨基阿維菌素8.00 mg·L-1對柑橘葉片內(nèi)的L1-21抑制作用(抑制率4.23%)不明顯，顯著低于其他5種殺蟲劑和3種殺菌劑與微肥EDTA-Cu，其他化學品的抑制率均達76.99%以上(表4)。對其他內(nèi)生菌的抑制率以8.00 mg·L-1甲氨基阿維菌素最低，為6.78%，其他制品達46.90%～70.06%，且差異未達極顯著水平。大田條件下，3種銅制劑和硫磺對柑橘內(nèi)生菌的抑制作用明顯高于6種殺蟲劑的抑制作用(表5)。

表4 農(nóng)業(yè)化學品對柑橘活體葉片中L1-21菌株的抑制率Table 4 Inhibitory effect of various agrochemicals on the growth of the endophyte L1-21 on live citrus leaves in the field

表5 農(nóng)業(yè)化學品對田間柑橘葉片內(nèi)生菌總量的影響Table 5 Inhibitory effect of agrochemicals on endophytes in live citrus leaves under field conditions

3 討論

柑橘內(nèi)生枯草芽孢桿菌L1-21具有防控柑橘黃龍病(專利號：201811266827.x)和潰瘍病的潛力，有品紅色菌落，易于辨別，用于培養(yǎng)基上檢測農(nóng)業(yè)化學品對柑橘內(nèi)生菌的抑制作用，效果非常明了，同時作為指示菌有助于篩選出適于混合施用的化學品，為生產(chǎn)上應用提供依據(jù)。本研究結(jié)果證明，10種農(nóng)業(yè)化學品的國家推薦用量對L1-21均有很強的抑制作用。但是，這些農(nóng)業(yè)化學品在平板上的直接抑制作用大于對離體及活體葉片內(nèi)L1-21的抑制作用，這可能與這些農(nóng)業(yè)化學品在葉片上的滲透率和內(nèi)吸性有關，而在培養(yǎng)基上是直接作用于菌體。這些化學品不僅對L1-21具有很強的抑制作用，而且能減少柑橘活體葉片內(nèi)的內(nèi)生菌總量，表明化學品的施用確實抑制了內(nèi)生菌種群。

內(nèi)生菌長期生活在植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中，并與寄主協(xié)同進化，在這一過程中形成了互利共生關系。感染內(nèi)生菌的植物宿主往往具有生長快速、抗逆境、抗病害、抗脅迫等優(yōu)勢，比未感染植株具有更強的生存競爭力(劉波等，2011)，如：內(nèi)生菌Bacillushalotolerans能防治海棗枯萎病(Slamaetal.,2019)；Neotyphodium能進入禾本科植物內(nèi)獲得營養(yǎng)，但可減少寄主被草食動物傷害，提高植株耐旱、耐鹽和抗除草劑能力(Gundeletal.,2008)；FusariumoxysporumFo47參與了抗病相關蛋白的積累，從而增加了番茄對枯萎病的抗性(Lamoetal.,2018)；Phialemoniuminflatum能減輕棉花線蟲病的危害(Zhouetal.,2018)；棉花內(nèi)生菌BacillusmethylotrophicusLH-L3被用來制作成種衣劑，包衣后可以減輕棉花黃萎病病情(陳麗華等，2018)；煙草內(nèi)生菌被成功用于防治黑脛病(楊珍福等，2014)；Methylobacteria能減輕金屬對番紅花CrocussativusL.的毒性(Sánchez-Lópezetal.,2018)；Alternariatenuissima能減輕二溝黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge高濃度硒的毒害(Lindblometal.,2018)。而大量施入農(nóng)業(yè)化學品在保障植物免受目標有害生物危害的同時，清除了內(nèi)生菌，從而大大降低了植物的抗性作用，致使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)形成了化學依賴，或者以犧牲環(huán)境為代價，引起抗性害蟲及病菌的產(chǎn)生。換言之，抗性害蟲與病菌的產(chǎn)生也可能與大劑量地施入農(nóng)業(yè)化學品清除了內(nèi)生菌有關。為了避免這種化學依賴，必須選擇環(huán)境友好、合適劑量的化學品，采用理性的施用技術，實現(xiàn)“雙減”。

8.00 mg·L-1甲氨基阿維菌素對離體和活體柑橘葉片中L1-21抑制作用較小，對活體葉片中其他內(nèi)生菌抑制作用也較小。離體和活體抑菌差異可能與各試劑進入葉片體內(nèi)的能力存著差異有關，也可能與L1-21和柑橘體內(nèi)其他內(nèi)生菌對化學品的敏感性差異有關。除這1種殺蟲劑抑制L1-21和其他內(nèi)生菌能力稍弱外，其他9種農(nóng)業(yè)化學品對內(nèi)生菌都具有較強的抑制作用。因此，在施用農(nóng)業(yè)化學品前，了解它們對內(nèi)生菌的負面影響是非常必要的。即在化學品環(huán)境評價時，可以將其對植物微生態(tài)系統(tǒng)納入評價體系內(nèi)，從而確保植物內(nèi)生菌系統(tǒng)不受負面影響。

本研究只是測定了農(nóng)業(yè)化學品處理離體葉片和活體葉片24 h對柑橘內(nèi)生菌的抑制作用，而內(nèi)生菌是否在此后立即恢復原來群落結(jié)構(gòu)或數(shù)量，及恢復期多長，還有待進一步研究。

銅制劑廣泛用于柑橘潰瘍病等細菌性病害防控，但是防效不長，致使該病目前大面積發(fā)生，是否與其廣譜殺滅真菌、細菌，致使內(nèi)生菌數(shù)量銳減有關值得深思。本研究不僅對于柑橘內(nèi)生菌研究有重大意義，而且對其他植物微生態(tài)系統(tǒng)的研究同樣起作積極作用?？梢灶A料，隨著人們對內(nèi)生微生物系統(tǒng)認識的加深，濫用、亂用農(nóng)業(yè)化學品的危害將會被深刻認識，正確使用化學品的重要性將會從微生態(tài)學角度得到關注。