超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定化妝品中7 種雙酚類化合物及其衍生物

周勇，高卓瑤，蔣玲波，賀文韜，湯海鳳，陳毅洛，許景景，周小涵

（1.舟山市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，浙江舟山 316000； 2.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316000）

雙酚類化合物及其衍生物是一類含有兩個(gè)酚羥基且結(jié)構(gòu)相似的化學(xué)物質(zhì)［1］，主要包括雙酚A（BPA）、雙酚A-二環(huán)氧甘油醚（BADGE）、雙酚A二（3- 氯-2- 羥丙基）醚（BADGE-2HCL）、雙酚F二縮水甘油醚（BFDGE）、雙酚A（2，3-二羥基丙基）縮水甘油醚（BADGE-H2O）、3-環(huán)酚醛清漆甘油醚（3-Ring NOGE）、4-環(huán)酚醛清漆甘油醚（4-Ring NOGE）等。雙酚類化合物及其衍生物是合成聚碳酸酯和環(huán)氧樹脂等高分子聚合物的重要化工原料之一，廣泛應(yīng)用于食品加工、化妝品包裝材料、醫(yī)療設(shè)備、建筑材料等領(lǐng)域［2-4］。這類化合物具有較強(qiáng)的親脂性，可通過包裝材料遷移到化妝品中，經(jīng)噴灑、涂抹后被皮膚吸收進(jìn)入體內(nèi)［5］。雙酚類化合物及其衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與人類雌激素類似，具有擬雌激素活性和毒性，可作為內(nèi)分泌干擾物在生物體內(nèi)富集，不僅會(huì)對生物體的內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響，還會(huì)干擾生物體的生殖遺傳功能，對嬰幼兒的生長發(fā)育危害尤為嚴(yán)重［6-10］。據(jù)現(xiàn)有研究表明，低劑量的雙酚A 即可導(dǎo)致支持細(xì)胞和精子細(xì)胞的死亡［11-13］。我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版）和歐盟化妝品法規(guī)（EC No 1223/2009）中均將雙酚A 列入了化妝品禁用物質(zhì)清單，但未收載相關(guān)檢測方法，因此建立同步測定化妝品中多種雙酚類化合物及其衍生物的檢測方法具有重要意義。

目前國內(nèi)外關(guān)于雙酚類化合物及其衍生物的檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法、高效液相色譜（HPLC）法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法、熒光偏振檢測（FP）法等［14-18］。光譜法和色譜法樣品處理過程復(fù)雜，選擇性差，靈敏度低，無法同時(shí)測定多種化合物，容易受到化妝品基質(zhì)類型干擾，且陽性樣品仍需要通過質(zhì)譜進(jìn)一步確證?，F(xiàn)有的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法響應(yīng)值較低，需進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件與質(zhì)譜條件［19-20］。目前文獻(xiàn)報(bào)道的檢測方法覆蓋化合物種類較少，僅限于常見的雙酚類化合物［21］。筆者建立一種同步檢測化妝品中雙酚A、雙酚A-二環(huán)氧甘油醚、雙酚A 二（3-氯-2-羥丙基）醚等7 種雙酚類化合物及其衍生物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。該方法不受化妝品基質(zhì)類型的干擾，能夠準(zhǔn)確定性、定量目標(biāo)化合物，可為化妝品中雙酚類化合物及其衍生物檢測提供有效的技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：5500+型，美國AB SCIEX 公司。

多孔位旋渦混合器：Multi Reax 型，德國海道爾夫公司。

高速冷凍離心機(jī)：AVANTIJ-E 型，美國貝克曼庫爾特公司。

氮吹濃縮儀：N-2110 型，日本EYELA 公司。超純水儀：Milli-Q 型，美國密理博公司。

電子天平：（1）BSA124S-CW 型，感量為1 mg；（2）BSA224S-CW 型，感量為0.1 mg，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

雙酚A（BPA）、雙酚A- 二環(huán)氧甘油醚（BADGE）、雙酚A 二（3-氯-2-羥丙基）醚（BADGE-2HCL）、雙酚F 二縮水甘油醚（BFDGE）、雙酚A（2，3-二羥基丙基）縮水甘油醚（BADGE-H2O）、3-環(huán)酚醛清漆甘油醚（3-Ring NOGE）、4-環(huán)酚醛清漆甘油醚（4-Ring NOGE）標(biāo)準(zhǔn)品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）均不小于95%，美國Fluka 公司。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷：均為色譜純，中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水，由Milli-Q 型超純水儀制備。

水劑、粉類、膏霜乳液類、凝膠類化妝品樣品：市售。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XSelect HSS T3液相色譜柱（100 mm×2.1 μm，1.7 μm，美國沃特世公司）；柱溫：40℃；流量：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；流動(dòng)相：A 為5 mmol/L 乙酸銨水溶液，B 為乙腈；洗脫方式：梯度洗脫；洗脫程序：0～0.5 min 時(shí)B 相體積分?jǐn)?shù)為35%，0.5～4 min 時(shí)B 相體積分?jǐn)?shù)由35%逐漸增加至65%，4～5 min 時(shí)B 相體積分?jǐn)?shù)由65%逐漸增加至90%，7.01～8 min 時(shí)B 相體積分?jǐn)?shù)為35%。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離（ESI）；掃描方式：正負(fù)離子同時(shí)掃描；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；氣簾氣：氮?dú)?，體積分?jǐn)?shù)為99.9%，壓力為172 kPa；碰撞氣：氮?dú)?，體積分?jǐn)?shù)為99.9%，壓力為65 kPa；正模式噴霧電壓：5 500 V；負(fù)模式噴霧電壓：4 500 V；去溶劑溫度：500 ℃；噴霧氣：氮?dú)?，體積分?jǐn)?shù)為99.9%，壓力為344 kPa；輔助加熱氣：氮?dú)?，體積分?jǐn)?shù)為99.9%，壓力為344 kPa。7 種雙酚類化合物及其衍生物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 7 種雙酚類化合物及其衍生物的質(zhì)譜參數(shù)

1.3 溶液配制

7 種雙酚類化合物及其衍生物混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：質(zhì)量濃度均為1 mg/mL，分別稱取BPA、BADGE、BADGE-2HCL、BFDGE、BADGE-H2O、3-Ring NOGE、4-Ring NOGE 標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg（精確至0.1 mg），置于同一只10 mL容量瓶中，用甲醇-水（體積比為1∶1）溶液溶解并定容至標(biāo)線，混勻，于4 ℃冰箱儲(chǔ)存。

7 種雙酚類化合物及其衍生物混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：質(zhì)量濃度均為1 μg/mL，吸取7 種雙酚類化合物及其衍生物混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.1 mL 于100 mL容量瓶中，用甲醇-水（體積比為1∶1）溶液定容至標(biāo)線，混勻，于4 ℃冰箱儲(chǔ)存。

7 種雙酚類化合物及其衍生物系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：依次準(zhǔn)確吸取7 種雙酚類化合物及其衍生物混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5 mL，分別置于9只100 mL容量瓶中，用甲醇-水（體積比為1∶1）溶液定容至標(biāo)線，配制成7 種雙酚類化合物及其衍生物的質(zhì)量濃度均分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品處理

水劑化妝品：將水劑樣品進(jìn)行均質(zhì)化處理。準(zhǔn)確稱取2.000 g（精確至0.001 g）均質(zhì)處理后的樣品于50 mL 離心管中，加入10 mL 正己烷-乙酸乙酯（體積比為1∶1），渦旋震蕩20 min，超聲提取20 min。然后以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，吸取上清液，轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中，置于50 ℃氮吹儀中進(jìn)行濃縮，濃縮液用甲醇-水（體積比為1∶1）溶液定容至1 mL，渦旋5 min，靜置5 min，過0.22 μm 有機(jī)膜，待測。

粉類、膏霜乳液類、凝膠類化妝品：將粉類、膏霜乳液類、凝膠類樣品進(jìn)行均質(zhì)化處理。準(zhǔn)確稱取2.000 g（精確至0.001 g）均質(zhì)處理后的樣品于50 mL 離心管中，加入10 mL 乙酸乙酯，渦旋震蕩20 min，超聲提取20 min。然后以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，吸取上清液，轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中，置于50 ℃氮吹儀中進(jìn)行濃縮，濃縮液用甲醇-水（體積比為1∶1）溶液定容至1 mL，渦旋5 min，靜置5 min，過0.22 μm 有機(jī)膜，待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑選擇

雙酚類化合物及其衍生物因其在有機(jī)溶劑中溶解度較大，提取溶劑的種類對提取效果影響較大。分別對比了不同化妝品基質(zhì)在正己烷、乙腈、乙酸乙酯、甲醇、正己烷-乙酸乙酯（體積比為1∶1）5 種有機(jī)溶劑中的提取效果。結(jié)果表明，水劑、粉類、膏霜乳液類、凝膠類化妝品基質(zhì)均能在上述5 種有機(jī)溶劑中均勻溶解。用甲醇提取時(shí)，提取液中雜質(zhì)含量相對較高，會(huì)對目標(biāo)化合物的測定造成干擾。綜合考慮脫除溶劑所需時(shí)間、方法簡便性、溶劑毒性與成本等因素，最終選擇正己烷-乙酸乙酯（體積比為1∶1）為水劑化妝品的提取溶劑，乙酸乙酯為粉類、膏霜乳液類、凝膠類化妝品的提取溶劑。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相選擇

分別以甲醇-水、乙腈-水作為流動(dòng)相體系，考察不同流動(dòng)相體系對儀器響應(yīng)值的影響。結(jié)果表明，以甲醇、乙腈作為有機(jī)相時(shí)，在水相中添加一定量的乙酸銨和甲酸，在消除鈉鹽干擾的同時(shí)，有助于目標(biāo)物母離子色譜峰的形成，從而顯著提高儀器的響應(yīng)值。但以甲醇-水作為流動(dòng)相體系時(shí)，基線明顯升高，而乙腈-水流動(dòng)相體系則基線平穩(wěn)。此外水相中甲酸的引入會(huì)嚴(yán)重影響雙酚A 的響應(yīng)值。綜合考慮，選擇乙腈-5 mmol/L 乙酸銨水溶液作為流動(dòng)相體系。

2.2.2 色譜柱選擇

分別對比了BEHC18HSS T3 柱（100 mm×2.1 μm，1.7 μm）、HSS T3 柱（50 mm×2.1 μm，1.7 μm） 和HSS T3 柱（100 mm×2.1 μm，1.7 μm）3 種Waters XSelect 色譜柱對7 種雙酚類化合物及其衍生物的分離效果，結(jié)果表明，采用HSS T3 （100 mm×2.1 μm，1.7 μm）色譜柱時(shí)，各化合物的分離效果較好，且響應(yīng)值高、無雜峰干擾，故選擇Waters XSelect HSS T3 （100 mm×2.1 μm，1.7 μm）色譜柱為分離柱。7 種雙酚類化合物及其衍生物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖如圖1 所示。

圖1 7 種雙酚類化合物及其衍生物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

根據(jù)7 種雙酚類化合物及其衍生物的電離性質(zhì)，分別在ESI 正離子模式和ESI 負(fù)離子模式下，采用流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)樣的方式進(jìn)行全掃描分析，將響應(yīng)值最高的目標(biāo)離子設(shè)為母離子，BPA 在ESI 負(fù)離子模式下響應(yīng)值最高，準(zhǔn)分子離子為［M-H］-；其余化合物均在ESI 正離子模式下響應(yīng)值最高，準(zhǔn)分子離子為［M+NH4］+。并對去簇電壓、碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見1.2.2。

2.4 線性方程與檢出限

在1.2 儀器工作條件下，對1.3 中的7 種雙酚類化合物及其衍生物系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，ng/mL），繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。選用陰性化妝品樣品，加入適量的7 種雙酚類化合物及其衍生物系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.4 方法進(jìn)行樣品處理，在1.2 儀器工作條件下進(jìn)行測定，以3 倍信噪比（S/N）對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為方法檢出限。

7 種雙酚類化合物及其衍生物的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2。由表2可知，7 種雙酚類化合物及其衍生物的質(zhì)量濃度在0.1～50.0 ng/mL 范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均不小于0.996，檢出限為0.1 ng/mL，滿足定量分析要求。

表2 質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.5 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

選用陰性化妝品樣品，分別加入適量的7 種雙酚類化合物及其衍生物混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使加標(biāo)后7 種待測化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1、0.5、2.0 μg/kg，按1.4 樣品處理方法，每種加標(biāo)濃度水平平行制備6 份樣品溶液，在1.2 儀器工作條件下分別進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。由表3 可知，樣品加標(biāo)回收率為84.5%～119.2%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.19%～4.92%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

表3 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3 結(jié)語

建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測定化妝品中7 種雙酚類化合物及其衍生物的分析方法，該方法樣品處理過程簡單，檢測響應(yīng)靈敏度高，目標(biāo)物回收率好，可以滿足化妝品中多種雙酚類化合物及其衍生物的定性定量分析要求。該方法的建立可為化妝品中雙酚類化合物的測定提供技術(shù)支撐。