siRNA-881 干擾GLS 基因?qū)πx肌幼蟲抗酸能力的影響

孟 詩，張 妍，楊 嘯，趙 亞，高 遠，王 爽，刁子洋，郭 琨，宋銘忻

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物源性人獸共患病黑龍江省重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

旋毛蟲病是一種重要的食源性人畜共患病，分布于世界各地。旋毛蟲病不僅給養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟損失，嚴重時還危及人類生命健康[1]。感染旋毛蟲主要臨床表現(xiàn)為胃腸道癥狀、發(fā)熱、眼瞼水腫及肌肉疼痛等[2]。目前，旋毛蟲可大體分為9 個種[3]，其中豬旋毛蟲（Trichinella spiralis）分布最為廣泛，占比達43.3%。旋毛蟲蟲種分布與自然環(huán)境、溫度氣候及當?shù)鼐用耧嬍沉?xí)慣等因素息息相關(guān)。

近年來，微生物與胃腸道、寄生蟲與胃腸道之間的致病關(guān)系已逐漸成為研究熱點。胃液為極酸環(huán)境（pH1.5～pH2.5）[4]，能夠抵御多種病原微生物進入胃腸道從而保護機體免受侵害。然而，大多數(shù)食源性致病菌具有耐酸特性，可順利通過胃液環(huán)境進入腸道使機體感染[5]。大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）是日常生活中最常見的食源性病原之一，且致病力較強。目前已知，大腸桿菌中主要存在以下4 種抗酸系統(tǒng)：葡萄糖代謝產(chǎn)物抑制的抗酸系統(tǒng)（AR1）、谷氨酸依賴型抗酸系統(tǒng)（AR2）、精氨酸依賴型的抗酸系統(tǒng)（AR3）、谷氨酰胺依賴型抗酸系統(tǒng)（AR4）。其中AR4 是指大腸桿菌利用其谷氨酰胺酶（GLS）將吸收后的L-谷氨酰胺（Gln），轉(zhuǎn)化成L-谷氨酸（Glu），并釋放氨（NH3），游離氨能與細菌內(nèi)的H+結(jié)合從而達到抗酸目的[6]。研究發(fā)現(xiàn)旋毛蟲肌幼蟲中谷氨酸含量較高[7]，結(jié)合其生活史可知旋毛蟲屬于食源性感染，經(jīng)口感染需在胃中停留一定時間后再進入腸道感染宿主，因此，推測旋毛蟲可能具有與大腸桿菌AR4 相似的抗酸機制。

小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）導(dǎo)入機體后能特異性地抑制靶向基因的表達，可以用于對基因功能分析[8]。本實驗室前期研究已經(jīng)表明：極酸性環(huán)境可以誘導(dǎo)旋毛蟲GLS 基因mRNA 大量表達[9]，初步推測旋毛蟲中存在類似于大腸桿菌中的AR4。為進一步探究GLS 基因在旋毛蟲抗酸過程中發(fā)揮的作用，本實驗利用RNA 干擾技術(shù)沉默旋毛蟲肌幼蟲的GLS 基因，通過熒光定量PCR、western blot等方法，檢測siRNA 分子在酸性環(huán)境下沉默TsGLS 基因?qū)πx肌幼蟲抗酸能力影響，以期為旋毛蟲病的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料豬旋毛蟲（T. spiralis）ISS533株，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院寄生蟲教研室傳代并保存。BALB/c 雌性小鼠，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（Lipofectin 2000）購自Invitrogen 公司；TRIzol、BCA 試劑盒和預(yù)染蛋白Marker 購自寶生物工程（大連）有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG 和FITC 標記的山羊抗兔IgG 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ChamQ SYBR qPCR Master Mix 購自諾唯贊生物。所用TsGLS 多抗血清為本實驗室前期制備并保存。

1.2 最佳干擾效果siRNA 分子的篩選取感染旋毛蟲肌幼蟲40 d 以上的小鼠迫殺后，采用人工胃液消化法[10]從小鼠肌肉中提取旋毛蟲肌幼蟲，利用改良后的貝爾曼法收集大量蟲體[11]，計數(shù)后置于4 ℃。根據(jù)NCBI 已登錄的TsGLS mRNA 序列（XM_003375164），利用在線RNAi 設(shè)計平臺（http://rnaidesigner.lifetech nologies.com/rnaiexpress/setOption.do?designOption=shrna&p）設(shè)計3 條靶向沉默TsGLS 基因的干擾序列（siRNA-419、siRNA-881、siRNA-1429）及1 個陰性對照序列（Control siRNA）（表1）。TsGLS-siRNA 及陰性對照均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。利用Lipofectin 2000，采用浸泡法[12]將3 條TsGLS-siRNA 以終濃度2 μmol/L轉(zhuǎn)染肌幼蟲。設(shè)置control siRNA 陰性對照和PBS空白對照。

表1 TsGLS的siRNA序列Table 1 siRNA sequences for TsGLS

將上述經(jīng)siRNA 轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)3 d 后的旋毛蟲肌幼蟲利用TRIzol 法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，參照文獻[9]引物序列及qPCR 方法檢測TsGLS 基因的轉(zhuǎn)錄水平，每組設(shè)置3 個重復(fù)。收集轉(zhuǎn)染后的各組旋毛蟲肌幼蟲， 以鹽析法制備全蟲可溶性蛋白，通過BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度。以TsGLS 多抗血清（1∶1 000）作為一抗，兔抗GAPDH MAb（1∶10 000）作為內(nèi)參一抗，HRP 標記的山羊抗兔IgG（1∶10 000）為二抗，采用western blot 檢測各組肌幼蟲可溶性蛋白中TsGLS蛋白的相對表達量，篩選干擾效果最佳的siRNA分子。

1.3 干擾條件的優(yōu)化與干擾效果鑒定根據(jù)1.2 中的篩選結(jié)果，確定siRNA-881 為干擾效果最佳的siRNA分子。利用Lipofectin 2000，采用浸泡法將不同終濃度的siRNA-881（1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L）轉(zhuǎn)染旋毛蟲肌幼蟲12 h 后，更換培養(yǎng)液后培養(yǎng)3 d，參照1.2 中的方法分別利用qPCR 檢測TsGLS 基因的轉(zhuǎn)錄水平，采用western blot 檢測TsGLS 蛋白的表達，確定最佳轉(zhuǎn)染濃度。按上述最佳濃度轉(zhuǎn)染siRNA-881 后0、1 d、3 d、5 d、7 d 收集旋毛蟲肌幼蟲，利用qPCR 檢測TsGLS 轉(zhuǎn)錄水平，確定轉(zhuǎn)染后的最適培養(yǎng)時間。為鑒定siRNA-881 對TsGLS 的干擾效果，設(shè)置siRNA-881 轉(zhuǎn)染組、control siRNA 陰性對照組、PBS 空白對照組，根據(jù)上述確定的最優(yōu)干擾條件轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)各組旋毛蟲肌幼蟲，采用qPCR 與western blot檢測TsGLS 基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達水平。將上述各組旋毛蟲肌幼蟲固定至粘附性載玻片，以TsGLS 多抗體血清（1∶500）作為一抗，F(xiàn)ITC 標記的山羊抗兔IgG（1∶1 000）為二抗，經(jīng)間接免疫熒光試驗（IFA）檢測siRNA-881 分子對TsGLS 蛋白表達水平的影響。

1.4 TsGLS 基因沉默對旋毛蟲肌幼蟲在酸性環(huán)境抗酸能力的影響將TsGLS siRNA-881 利用浸泡法導(dǎo)轉(zhuǎn)染旋毛蟲肌幼蟲3 d 后，分別在pH 值為2.5、4.0、6.6和9.0條件下，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)0.5 h、1 h、2 h后收集蟲體，檢測各組旋毛蟲肌幼蟲存活率，存活率=（蟲體總數(shù)-死亡數(shù)）/蟲體總數(shù)×100%。

1.5 體內(nèi)實驗分組設(shè)計將12 只2 月齡左右健康BALB/c 小鼠隨機均分為4 組，利用灌胃法分別接種生理鹽水及siRNA-881 組旋毛蟲肌幼蟲、control siRNA 組旋毛蟲肌幼蟲、PBS 組旋毛蟲肌幼蟲，接種量為300 條旋毛蟲肌幼蟲/只。感染后7 d、35 d 分別迫殺各組小鼠，收集小腸與肌肉用于后續(xù)實驗檢測。

1.6 siRNA-881 轉(zhuǎn)染后旋毛蟲成蟲和肌幼蟲感染小鼠的減蟲率檢測將感染后7 d 的小鼠縱向取出小腸并沖洗干凈，切成2 cm～3 cm 的小塊，放入含有雙抗的無菌生理鹽水中，37 ℃孵育3 h，收集成蟲并計數(shù)后計算成蟲減蟲率。通過人工胃液消化法分別收集感染35 d 的旋毛蟲肌幼蟲，計算旋毛蟲肌幼蟲減蟲率。減蟲率=（PBS 對照組蟲數(shù)-siRNA-881 組蟲數(shù)）/PBS 對照組蟲數(shù)×100%。

1.7 siRNA-881 轉(zhuǎn)染后的旋毛蟲肌幼蟲感染小鼠后的保姆細胞壁厚度測定收集感染旋毛蟲7 d 的各組小鼠，脫頸法迫殺后取整片膈肌。參照文獻[13]進行HE 染色觀察保姆細胞壁厚度的變化，并利用Photoshop 測量保姆細胞壁厚度，根據(jù)與PBS 組和control siRNA 組的對比結(jié)果，分析經(jīng)siRNA-881 轉(zhuǎn)染后的旋毛蟲肌幼蟲對宿主的侵襲力。

1.8 TsGLS 基因沉默后子一代肌幼蟲TsGLS 基因轉(zhuǎn)錄水平檢測通過人工胃液消化法收集1.5 中各組的肌幼蟲，并置于RPMI 1640 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后基更換為pH2.5 的酸性溶液，培養(yǎng)2 h 后，收集各組旋毛蟲肌幼蟲，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用qPCR 檢測子一代肌幼蟲TsGLS 基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。

2 結(jié) 果

2.1 siRNA 分子篩選結(jié)果將終濃度同為2 μmol/L的各組siRNA 分子轉(zhuǎn)染旋毛蟲肌幼蟲后培養(yǎng)3 d，利用qPCR 檢測TsGLS 的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，siRNA-419、siRNA-881、siRNA-1429轉(zhuǎn)染組的TsGLS mRNA轉(zhuǎn)錄水平相對于PBS 對照組分別降低了49.99%、72.82%、60.69%，siRNA-881 介導(dǎo)的TsGLS mRNA 沉默效果最明顯；control siRNA 對照組與PBS 對照組相比，TsGLS mRNA 轉(zhuǎn)錄水平無明顯變化（P＞0.05）（圖1A）。根據(jù)western blot 結(jié)果分析灰度值，結(jié)果顯示，與PBS 對照組相比，siRNA-419、siRNA-881、siRNA-1429 轉(zhuǎn)染組TsGLS 表達量分別降低7.74%、55.44%、35.52%，而control siRNA組相對于PBS組Ts-GLS表達量無明顯變化（P＞0.05）（圖1B）。表明siRNA-881 對TsGLS 基因干擾效果最明顯，因此選擇其用于后續(xù)試驗。

圖1 siRNA轉(zhuǎn)染后旋毛蟲肌幼蟲TsGLS基因轉(zhuǎn)錄（A）與蛋白表達（B）的檢測結(jié)果Fig.1 The gene transcription(A)and protein expression(B)of TsGLS in Trichinella spiralis muscle larvae after siRNA treatment

2.2 干擾條件的優(yōu)化及干擾效果的鑒定將siRNA-881 利用浸泡法轉(zhuǎn)染旋毛蟲肌幼蟲，采用不同轉(zhuǎn)染濃度的siRNA-881 和轉(zhuǎn)染12 h 后分別培養(yǎng)不同時間，經(jīng)qPCR 和western blot 檢測TsGLS 基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平，最終確定終濃度為2 μmol/L siRNA-881 轉(zhuǎn)染12 h 后體外培養(yǎng)3 d 為最佳干擾條件（圖略）。對其基因沉默效果采用qPCR、western blot 及IFA檢測，結(jié)果顯示（圖2），在基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平兩方面均體現(xiàn)出siRNA-881 分子對TsGLS 基因的沉默效果（圖2），表明優(yōu)化的條件可用，且效果顯著。

圖2 siRNA-881轉(zhuǎn)染肌幼蟲后TsGLS沉默效果的檢測Fig.2 Silencing of muscle larva TsGLS by siRNA-881 transfection

2.3 酸性條件下TsGLS 基因沉默對肌幼蟲抗酸能力的影響經(jīng)siRNA-881 轉(zhuǎn)染旋毛蟲肌幼蟲3 d 后，在不同酸性環(huán)境中分別培養(yǎng)不同時間，計算各組旋毛蟲肌幼蟲的存活率，結(jié)果顯示，同在pH2.5、pH4培養(yǎng)條件下，siRNA-881 組旋毛蟲肌幼蟲與PBS 對照組和control siRNA 組旋毛蟲肌幼蟲相比存活率在0.5 h 時降低22.20%、27.52%，在1 h 時降低16.55%、21.87%，在2 h 時降低19.20%、19.08%。在酸性環(huán)境中培養(yǎng)時間越長，肌幼蟲存活率越低；相同培養(yǎng)時間內(nèi)，同組旋毛蟲肌幼蟲在pH6.6的存活率高于其他不同pH值條件下培養(yǎng)旋毛蟲肌幼蟲的存活率（圖3）。上述結(jié)果表明，TsGLS 基因沉默會降低旋毛蟲肌幼蟲的抗酸能力，TsGLS 基因在旋毛蟲抗酸過程中起重要作用。

圖3 肌幼蟲在不同pH、時間內(nèi)存活率Fig.3 Survival rate of muscle larvae in different pH and time

2.4 減蟲率分析統(tǒng)計各組小鼠蟲體數(shù)后與PBS對照組比較可知：siRNA-881 組小鼠旋毛蟲成蟲與旋毛蟲肌幼蟲數(shù)量均明顯降低，攻蟲后第7 d旋毛蟲成蟲的減蟲率為61.64%，攻蟲后第35 d旋毛蟲肌幼蟲減蟲率為66.71%，統(tǒng)計數(shù)據(jù)具有顯著性差異（P＜0.001）（表2）。表明經(jīng)siRNA 轉(zhuǎn)染后，旋毛蟲肌幼蟲的抗酸能力降低，繁殖力也隨之減弱。

表2 siRNA-881轉(zhuǎn)染的肌幼蟲感染BALB/c小鼠后的體內(nèi)成蟲及肌幼蟲減蟲率Table 2 Reduction rates of worm adult and muscle larvae induced by siRNA-881 treatment of muscle larvae in BALB/c mice

2.5 保姆細胞壁厚度測定結(jié)果測量各組保姆細胞壁厚度分析可知，與PBS組（26.40±1.697）對比，siRNA-881 組（15.90±1.301）保姆細胞厚壁度降低了39.78%，且差異極顯著（P＜0.01）；PBS 組與control siRNA 組（24.94±1.511）相比，差異不顯著（P＞0.05）（圖4）。表明經(jīng)siRNA 轉(zhuǎn)染旋毛蟲肌幼蟲子一代肌幼蟲自身保護能力較差，形成保姆細胞壁厚度較薄，抵抗外界免疫能力較差。

圖4 保姆細胞壁厚度分析Fig.4 Analysis of nurse cytoderm thickness

2.6 TsGLS 基因沉默后子一代肌幼蟲TsGLS 基因轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果經(jīng)過人工胃液消化法提取子一代旋毛蟲肌幼蟲，對siRNA-881 轉(zhuǎn)染旋毛蟲肌幼蟲TsGLS 基因沉默遺傳性進行分析，qPCR 結(jié)果顯示，siRNA-881 組旋毛蟲肌幼蟲的TsGLS 基因轉(zhuǎn)錄水平較PBS 對照組降低42.52%，差異極顯著（P＜0.01）（圖5）。再次表明，TsGLS 基因沉默會導(dǎo)致旋毛蟲肌幼蟲的抗酸能力降低，使其對宿主的損傷減弱。

圖5 子一代肌幼蟲TsGLS基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測Fig.5 Transcriptional level of TsGLS gene in the offspring muscle larvae

3 討 論

旋毛蟲病是一種世界范圍內(nèi)廣泛分布的食源性人獸共患寄生蟲病。由于食源性病原體致病過程必經(jīng)胃液的極酸環(huán)境決定了其具有耐酸特性，酸性環(huán)境條件誘導(dǎo)耐酸基因的表達是食源性病原體致病的關(guān)鍵[14]。谷氨酰胺依賴型抗酸系統(tǒng)（AR4）是大腸桿菌體內(nèi)起重要作用的耐酸系統(tǒng)之一，通過該系統(tǒng)在大腸桿菌中的轉(zhuǎn)運與催化可維持菌體內(nèi)環(huán)境的酸堿平衡穩(wěn)態(tài)[15]。本實驗室前期研究已證實，酸性條件下谷氨酰胺酶基因在旋毛蟲肌幼蟲中高效表達[9]。

臨床研究上，胃腸道病原體進入腸道之前需在pH2～pH3 的胃液環(huán)境中停留達2 h 之久[16]。Lu 等人發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌中的谷氨酰胺酶在pH≤6.0 條件下被激活，且谷氨酰胺酶活性在pH4.0 時達到峰值，pH5.0 和pH6.0 其次，pH6.6 條件下的谷氨酰胺酶活性僅約為pH6.0 條件下的3%[6]。Rowbury 等研究發(fā)現(xiàn)，生物機體為抵抗外界環(huán)境刺激會產(chǎn)生細胞外誘導(dǎo)成分（Extracellular induction components，EICs），但在pH9.0 條件下，EICs 則會失去活性[17]。本研究在旋毛蟲肌幼蟲抗酸能力的檢測中，將siRNA-881 干擾后的旋毛蟲肌幼蟲置于pH2.5、pH4、pH6.6、pH9的培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，siRNA-881 轉(zhuǎn)染組旋毛蟲肌幼蟲存活率明顯低于對照組，且同等pH 值環(huán)境條件下，旋毛蟲肌幼蟲存活率隨酸處理時間的延長而降低。在培養(yǎng)時間同為2 h 條件下，pH2.5 與pH4 處理組，與PBS 對照組對比，經(jīng)siRNA-881 轉(zhuǎn)染后的旋毛蟲肌幼蟲存活率分別降低19.20%、19.08%；且在pH2.5 條件進行培養(yǎng)2 h 后，siRNA-881 轉(zhuǎn)染后的旋毛蟲肌幼蟲存活率降低至13.67%?？梢娡ㄟ^RNA干擾技術(shù)可使TsGLS 基因表達量降低，對旋毛蟲肌幼蟲谷氨酰胺依賴型抗酸系統(tǒng)造成影響，進而影響旋毛蟲肌幼蟲活性。而在pH6.6 和pH9 條件下，siRNA-881 轉(zhuǎn)染組旋毛蟲肌幼蟲的存活率與PBS 對照組相比無顯著差異，由此推斷，當處于pH6.6 和pH9條件時，旋毛蟲肌幼蟲機體處于較適宜環(huán)境，相關(guān)抗酸基因的表達量較低，未參與耐酸過程。對于旋毛蟲肌幼蟲存活率的檢測可表明TSGLS 基因的表達與蟲體活性存在密切相關(guān)性。

利用siRNA-881 干擾TsGLS 基因，檢測通過小鼠胃腸道酸性環(huán)境后旋毛蟲肌幼蟲的減蟲率可見，siRNA-881 轉(zhuǎn)染組小鼠的旋毛蟲成蟲數(shù)量和旋毛蟲肌幼蟲數(shù)量較PBS 對照組小鼠明顯降低，表明Ts-GLS 基因沉默會降低旋毛蟲肌幼蟲的抗酸能力。Gorden 等人曾將細菌暴露于低于pH2.5 酸性環(huán)境2 h后存活率超過10%定義為細菌的耐酸性[5]。而將旋毛蟲置于pH2.5 環(huán)境培養(yǎng)2 h 后，存活率仍然可達45%[18]。通過檢測旋毛蟲肌幼蟲形成保姆細胞壁的厚度，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)siRNA-881 轉(zhuǎn)染旋毛蟲肌幼蟲感染小鼠形成包囊后的保姆細胞壁厚度明顯大于經(jīng)siRNA-881 轉(zhuǎn)染后感染的小鼠。旋毛蟲可通過感染宿主后形成的包囊攝取維持自身生存所必須的營養(yǎng)物質(zhì)，以抵御外界炎癥細胞的侵害[19]。本實驗中由于經(jīng)siRNA-881 轉(zhuǎn)染后的旋毛蟲肌幼蟲子一代肌幼蟲的自身防御能力較弱，則其形成包囊后的保姆細胞壁厚度較薄，對外界環(huán)境因素的抵抗能力較弱。檢測siRNA-881 轉(zhuǎn)染后旋毛蟲肌幼蟲感染的小鼠經(jīng)人工胃液消化法收集的子一代旋毛蟲肌幼蟲TsGLS 基因轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示子一代旋毛蟲肌幼蟲的Ts-GLS 基因轉(zhuǎn)錄水平與相同條件下的對照組相比降低42.52%，而親代旋毛蟲肌幼蟲與對照組相比基因轉(zhuǎn)錄水平降低72.82%，可見siRNA-881 對于TsGLS 基因沉默效果隨傳代而下降，推測基因沉默效果將會于子三代及子四代旋毛蟲肌幼蟲減至更弱或完全消失，因此，如何在傳代過程中保持TsGLS 基因沉默效果將是后續(xù)研究的重點。

本研究通過siRNA-881 干擾TsGLS 基因表達首次證實，谷氨酰胺酶在酸性條件下對旋毛蟲肌幼蟲的耐酸性起重要作用，RNA 干擾技術(shù)可使旋毛蟲肌幼蟲耐酸能力降低，該研究結(jié)果為旋毛蟲病的預(yù)防提供新思路。