基于Wnt/β-catenin 信號通路黃芩素對帕金森大鼠旋轉行為及對腦黑質多巴胺能神經(jīng)元凋亡的影響①

李 琳 周云鵬 劉喜燦 卜淑芳 張 申（鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院神經(jīng)內科，鄭州 450006）

帕金森（Parkinson's disease，PD）是中老年群體高發(fā)慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為運動遲緩、步態(tài)異常、肌強直、靜止性震顫等，嚴重影響患者的正常生活［1］。目前PD 治療以口服左旋多巴制劑類藥物為主，但長期使用存在藥效降低、副作用較多等問題［2］。既往研究顯示，PD 主要病理變化為腦黑質多巴胺能神經(jīng)元變性丟失、路易小體形成、紋狀體多巴胺分泌減少［3］。因此，研究安全、有效的治療方式保護PD 神經(jīng)元、減少多巴胺神經(jīng)元丟失，從而緩解疾病進程具有廣闊前景。黃芩素（baicalein，BA）提取自中草藥黃芩的根部，可減輕炎癥反應及氧化應激，改善纖溶系統(tǒng)功能，殺滅病原菌。近年來研究發(fā)現(xiàn)，BA 同時具有顯著的神經(jīng)保護作用，可減少6-羥多巴胺誘導的多巴胺能神經(jīng)元及β淀粉樣肽誘導的皮層神經(jīng)元損傷，為神經(jīng)退行性疾病的治療提供了可能［4-5］。鑒于此，本研究通過建立PD 大鼠模型，觀察BA 對PD 大鼠旋轉行為及對腦黑質多巴胺能神經(jīng)元凋亡的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠60只，6周齡，體質量（200±20）g，購自中國科學院理化技術研究所，許可證號：SYXK（京）2018-0042。自由進食飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度維持在（24±1）℃，相對濕度（55±5）%，12 h/12 h明暗交替下適應性飼養(yǎng)1周。

1.1.2 主要藥物與試劑 BA（上海源葉生物科技有限公司）；多巴絲肼片（上海羅氏制藥有限公司）；戊巴比妥鈉（北京華業(yè)寰宇化工有限公司）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、6-羥多巴胺、抗壞血酸、阿撲嗎啡（江蘇菲亞生物科技有限公司）；TNF-α、IL-1β、IL-6、超氧化物歧化 酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）ELISA 試劑盒（上海恒遠生物科技有限公司）；Tunel細胞凋亡原位檢測試劑盒（北京博奧森生物工程有限公司）；酪氨酸羥化酶（TH）、p-β-catenin、β-catenin、cyclin-D1、c-myc 單抗（美國Abcam 公司）；辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔二抗［西化儀（北京）科技有限公司］。

1.1.3 主要儀器 Tecan-5082 Sunrise 全自動酶標儀（奧地利TECAN 公司）；SM2010R 切片機、EG1150分體式包埋機（德國徠卡顯微系統(tǒng)貿易有限公司）；CX23 光學顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）；GelDoc-It 310凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分組 參照文獻［6］建立PD 大鼠模型：取50只大鼠采用2%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，采用立體定位儀固定頭部，術區(qū)皮膚清潔、消毒，沿頭部矢狀線切開頭皮、骨膜，使前囟充分暴露。分別于前囟右3.5 mm、前囟后3.7 mm、硬膜下4.5 mm 位置（紋狀體區(qū)）矢狀縫向右側1.7 mm、硬膜下7.8 mm（右側前腦內側束區(qū)）位置注射6-羥多巴胺6 μl（溶于含2 g/L 抗壞血酸的生理鹽水中），注射速度為1 μl/min，留針5 min 后以1 mm/min 速度緩慢退針，后逐層縫合，肌注青霉素80 000 U/次，1 次/d，連續(xù)7 d 預防感染。10 只大鼠同法注射等量含2 g/L 抗壞血酸的生理鹽水不注射6-羥多巴胺，設為偽手術組。建模成功標準：術后14 d 測試大鼠旋轉行為，使其在旋轉檢測儀中適應5 min，安靜后以0.5 mg/kg 阿撲嗎啡耳后皮下注射誘發(fā)旋轉試驗，誘導大鼠向對側旋轉，觀察30 min，平均旋轉次數(shù)＞7 轉/min。42 只大鼠建模成功，將其分為PD 組（10 只/組）、BA 低劑量組（10 只/組）、BA高劑量組（11只/組）、多巴絲肼組（11只/組）。

1.2.2 干預方式 確定造模成功后第2 天開始干預，根據(jù)前期實驗基礎并參照文獻［7］確定BA干預劑量，BA 低劑量組、BA 高劑量組分別采用80 mg/（kg·d）、160 mg/（kg·d）BA 灌胃，灌胃前用0.1 ml 2%DMSO 溶液溶解，按照5 ml/（kg·d）灌胃，1次/d；多巴絲肼組采用多巴絲肼片干預，根據(jù)人、大鼠的體表面積比例換算為等效劑量6.5 mg/（kg·d），使用0.1 ml 2%DMSO 溶液溶解，按照5 ml/（kg·d）灌胃，1 次/d。偽手術組與PD 組均給予等量0.1 ml 2%DMSO溶液灌胃，1次/d，連續(xù)干預4周。

1.2.3 旋轉行為測試 末次給藥后4 h 每組隨機選取5 只大鼠以0.5 mg/kg 阿撲嗎啡耳后皮下注射誘發(fā)其向一側旋轉，記錄30 min旋轉次數(shù)。

1.2.4 組織取材、保存 旋轉行為測試完成后次日每組脫頸處死10 只大鼠，迅速取出完整腦組織，冰盤上分離腦黑質，5 只大鼠分離的腦黑質保存于-80℃?zhèn)溆茫?只大鼠分離的腦黑質以40%中性甲醛固定備用。

1.2.5 腦黑質IL-1β、TNF-α、IL-6 水平測定 取冷凍保存的腦黑質組織，加入1 ml PBS，剪刀剪碎，置于預冷玻璃勻漿器中，搗桿充分研磨約5 min，使組織勻漿化。勻漿后10 000 r/min 離心10 min，離心半徑10 cm，ELISA 試劑盒檢測腦黑質組織中IL-1β、TNF-α、IL-6水平，采用酶標儀測定570 nm 波長時的吸光度光密度值，根據(jù)標準曲線計算IL-1β、TNF-α、IL-6水平。

1.2.6 腦黑質SOD、MDA 水平測定 取冷凍保存的腦黑質組織，同1.2.5 勻漿、離心，分別按照SOD、MDA 試劑盒說明書要求，經(jīng)硫代巴比妥酸比色法、羥胺法測定腦黑質SOD、MDA 水平，嚴格按照試劑盒要求設計實驗步驟。

1.2.7 TH 染色觀察各組腦黑質多巴胺能損傷情況 取40%中性甲醛固定的腦黑質組織，常規(guī)脫水、包埋，以病理切片機制作成4 μm 連續(xù)切片，采用TH免疫組化染色。3%過氧化氫孵育10 min，蒸餾水沖洗，PBS 浸泡，滴加5 ml 枸櫞酸鹽抗原修復液，微波高火10 min，常溫下冷卻至40℃，蒸餾水沖洗。山羊血清室溫封閉15 min，棄去血清后甩干。滴加TH單抗（1∶1 000），4℃孵育24 h，滴加生物素標記的山羊抗兔IgG 二抗。顯微鏡下DAB 染色，室溫孵育3 s，PBS 沖洗，蘇木素復染，脫水，干燥，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察。TH陽性神經(jīng)元為棕褐色，采用多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)分析圖像。

1.2.8 Tunel染色測定各組腦黑質多巴胺能神經(jīng)元凋亡率 取40%中性甲醛固定的腦黑質組織，常規(guī)脫水、包埋，以病理切片機制作成4 μm連續(xù)切片，嚴格按照Tunel 細胞凋亡原位檢測試劑盒說明書要求加入Tunel反應混合液，濕盒中37℃孵育1 min，PBS沖洗后加入POD 轉化劑，濕盒中繼續(xù)孵育30 s，PBS沖洗，加入DAB 底物溶液，室溫孵育3 s，PBS 沖洗，蘇木素復染、脫水、干燥、中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察。細胞核被染成棕色或棕黑色為陽性細胞，凋亡率（%）=陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。每張切片任選5個視野計數(shù)，求平均值。

1.2.9 Western blot 測定各組腦黑質p-β-catenin、β-catenin、cyclin-D1、c-myc 蛋白相對表達量 取冷凍保存的腦黑質組織50 mg，充分研磨，轉至離心管，加入RIPA細胞裂解液，于冰上裂解30 min，提取總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度。沸水浴5 min使蛋白變性，10 000 r/min 離心20 min，離心半徑10 cm，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入稀釋倍數(shù)為1∶1 000 的p-β-catenin、β-catenin、cyclin-D1、c-myc 單抗，4℃搖床孵育過夜，洗膜3 次，每次8 min，加入稀釋倍數(shù)為1∶10 000 的HRP 標記的山羊抗兔IgG 二抗，室溫孵育2 h，洗膜3 次，每次8 min，加入ECL 發(fā)光液，曝光，以凝膠成像系統(tǒng)掃描、分析灰度值，蛋白相對表達量以p-β-catenin、β-catenin、cyclin-D1、c-myc 與內參β-actin灰度值的比值表示蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，以表示計量資料，以單因素方差分析處理多樣本資料，如Levene檢驗方差齊，以單因素方差分析處理總均值，采用LSD-t兩兩比較，若Levene檢驗方差不齊，改用welch檢驗行總體均值比較，然后再采用Dunnett T3檢驗兩兩比較。P＜0.05 表示差異存在統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠旋轉情況比較 30 min 旋轉次數(shù)組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與偽手術組相比，PD 組、BA 低劑量組、BA 高劑量組、多巴絲肼組30 min旋轉次數(shù)增加（P＜0.05）；與PD組相比，BA低劑量組、BA 高劑量組、多巴絲肼組30 min 旋轉次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與BA 低劑量組相比，BA 高劑量組、多巴絲肼組30 min 旋轉次數(shù)減少（P＜0.05）；與BA 高劑量組相比，多巴絲肼組30 min旋轉次數(shù)減少（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠旋轉情況比較（，次）Tab.1 Comparison of rats rotation times in each group（，times）

表1 各組大鼠旋轉情況比較（，次）Tab.1 Comparison of rats rotation times in each group（，times）

Note：Compared with Sham group，1）P＜0.05；compared with PD group，2）P＜0.05；compared with BA low-dose group，3）P＜0.05；com?pared with BA high-dose group，4）P＜0.05.

2.2 各組腦黑質IL-1β、TNF-α、IL-6 水平比較 腦黑質IL-1β、TNF-α、IL-6 水平組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與偽手術組相比，PD 組、BA 低劑量組、BA 高劑量組、多巴絲肼組腦黑質IL-1β、TNF-α、IL-6 水平均升高（P＜0.05）；與PD 組相比，BA 低劑量組、BA 高劑量組、多巴絲肼組腦黑質IL-1β、TNF-α、IL-6 水平均降低（P＜0.05）；與BA 低劑量組相比，BA高劑量組、多巴絲肼組腦黑質IL-1β、TNF-α、IL-6 水平均降低（P＜0.05）；與BA 高劑量組相比，多巴絲肼組腦黑質IL-1β、TNF-α、IL-6 水平均降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組腦黑質IL-1β、TNF-α、IL-6水平比較（，n=5）Tab.2 Comparison of IL-1β，TNF-α and IL-6 levels in substantia nigra in each group（，n=5）

表2 各組腦黑質IL-1β、TNF-α、IL-6水平比較（，n=5）Tab.2 Comparison of IL-1β，TNF-α and IL-6 levels in substantia nigra in each group（，n=5）

Note：Compared with Sham group，1）P＜0.05；compared with PD group，2）P＜0.05；compared with BA low-dose group，3）P＜0.05；com?pared with BA high-dose group，4）P＜0.05.

2.3 各組腦黑質SOD、MDA 水平比較 腦黑質SOD、MDA 水平組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與偽手術組相比，PD 組、BA 低劑量組、BA 高劑量組、多巴絲肼組腦黑質MDA 水平均升高，SOD水平均降低（P＜0.05）；與PD 組相比，BA 低劑量組、BA 高劑量組、多巴絲肼組腦黑質MDA 水平均降低，SOD水平均升高（P＜0.05）；與BA低劑量組相比，BA高劑量組、多巴絲肼組腦黑質MDA 水平均降低，SOD 水平均升高（P＜0.05）；與BA 高劑量組相比，多巴絲肼組腦黑質MDA 水平降低，SOD 水平升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組腦黑質SOD、MDA水平比較（，n=5）Tab.3 Comparison of SOD and MDA levels in substantia nigra in each group（，n=5）

表3 各組腦黑質SOD、MDA水平比較（，n=5）Tab.3 Comparison of SOD and MDA levels in substantia nigra in each group（，n=5）

Note：Compared with Sham group，1）P＜0.05；compared with PD group，2）P＜0.05；compared with BA low-dose group，3）P＜0.05；com?pared with BA high-dose group，4）P＜0.05.

2.4 各組腦黑質多巴胺能損傷情況觀察 偽手術組腦黑質TH 染色結果可觀察到細胞豐富，胞體均勻著色，具有豐富突起；PD 組腦黑質多巴胺能神經(jīng)元細胞數(shù)量、殘存神經(jīng)細胞突起顯著減少；BA 低劑量組、BA 高劑量組、多巴絲肼組經(jīng)干預后腦黑質多巴胺神經(jīng)細胞數(shù)量增加，神經(jīng)細胞突起豐富，其中多巴絲肼組改善最為明顯，其次為BA 高劑量組，最后為BA低劑量組。見圖1。

圖1 各組腦黑質TH染色結果（×400）Fig.1 Results of TH staining of brain substantia nigra in each group（×400）

2.5 各組腦黑質多巴胺能神經(jīng)元凋亡情況觀察各組腦黑質多巴胺能神經(jīng)元凋亡率比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與偽手術組相比，PD 組、BA低劑量組、BA 高劑量組、多巴絲肼組腦黑質多巴胺能神經(jīng)元凋亡率均升高（P＜0.05）；與PD組相比，BA低劑量組、BA 高劑量組、多巴絲肼組腦黑質多巴胺能神經(jīng)元凋亡率均降低（P＜0.05）；與BA 低劑量組相比，BA 高劑量組、多巴絲肼組腦黑質多巴胺能神經(jīng)元凋亡率均降低（P＜0.05）；與BA 高劑量組相比，多巴絲肼組腦黑質多巴胺能神經(jīng)元凋亡率降低（P＜0.05）。見表4、圖2。

圖2 各組腦黑質Tunel染色結果（×400）Fig.2 Tunel staining results of substantia nigra in each group（×400）

表4 各組腦黑質多巴胺能神經(jīng)元凋亡情況觀察（，n=5）Tab.4 Observation on apoptosis of substantia nigra dopa?minergic neurons in each group（，n=5）

表4 各組腦黑質多巴胺能神經(jīng)元凋亡情況觀察（，n=5）Tab.4 Observation on apoptosis of substantia nigra dopa?minergic neurons in each group（，n=5）

Note：Compared with Sham group，1）P＜0.05；compared with PD group，2）P＜0.05；compared with BA low-dose group，3）P＜0.05；com?pared with BA high-dose group，4）P＜0.05.

2.6 各組腦黑質p-β-catenin/β-catenin、cyclin-D1、c-myc 蛋白相對表達量比較 腦黑質p-β-catenin/β-catenin、cyclin-D1、c-myc 蛋白相對表達量組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與偽手術組相比，PD 組、BA 低劑量組、BA 高劑量組、多巴絲肼組p-β-catenin/β-catenin、cyclin-D1、c-myc 蛋白相對表達量均降低（P＜0.05）；與PD 組相比，BA 低劑量組、BA 高劑量組、多巴絲肼組p-β-catenin/β-catenin、cyclin-D1、c-myc 蛋白相對表達量均升高（P＜0.05）；與BA 低劑量組相比，BA 高劑量組、多巴絲肼組p-β-catenin/β-catenin、cyclin-D1、c-myc 蛋白相對表達量均升高（P＜0.05）；與BA 高劑量組相比，多巴絲肼組p-β-catenin/β-catenin、cyclin-D1、c-myc 蛋白相對表達量均升高（P＜0.05）。見表5、圖3。

圖3 各組Western blot結果Fig.3 Western blot results of each group

表5 各組腦黑質p-β-catenin/β-catenin、cyclin-D1、c-myc蛋白相對表達量比較（，n=5）Tab.5 Comparison of relative expression levels of p-βcatenin/β-catenin，cyclin-D1 and c-myc proteins in substantia nigra in each group（，n=5）

表5 各組腦黑質p-β-catenin/β-catenin、cyclin-D1、c-myc蛋白相對表達量比較（，n=5）Tab.5 Comparison of relative expression levels of p-βcatenin/β-catenin，cyclin-D1 and c-myc proteins in substantia nigra in each group（，n=5）

Note：Compared with Sham group，1）P＜0.05；compared with PD group，2）P＜0.05；compared with BA low-dose group，3）P＜0.05；com?pared with BA high-dose group，4）P＜0.05.

3 討論

PD 是腦黑質紋狀體通路退變所致的慢性神經(jīng)退行性疾病，研究認為年齡、家族史、飲食習慣、農業(yè)暴露、重金屬中毒、頭顱創(chuàng)傷史等均是其發(fā)生的危險因素［8-9］。目前尚未完全闡明PD 的發(fā)病機制，通常認為其與興奮性毒性、氧化應激、免疫性炎癥反應等相關。傳統(tǒng)PD 治療方式以藥物干預補充紋狀體多巴胺為主，但神經(jīng)保護作用不明顯，且長期使用可發(fā)現(xiàn)藥物相關性運動障礙及運動波動，導致病情加重。因此，研究具有神經(jīng)保護作用，且安全可靠的治療方式對于PD治療至關重要。

研究顯示，PD 存在免疫及炎癥反應失調，其中腦部免疫細胞小膠質細胞激活可能參與其神經(jīng)變性發(fā)病過程［10-11］。小膠質細胞在受到外源性刺激時可分泌IL-1β、TNF-α、IL-6 等多種細胞因子，導致神經(jīng)元損傷及細胞程序性死亡，從而參與神經(jīng)變性疾病進程。多巴胺能神經(jīng)元自身具有高水平游離鐵離子，鐵離子可加快多巴胺能神經(jīng)元氧化，損傷線粒體功能，參與PD 發(fā)病進程。本研究結果顯示，PD組、BA低劑量組、BA高劑量組、多巴絲肼組、偽手術組30 min 旋轉次數(shù)依次減少，腦黑質IL-1β、TNF-α、IL-6、MDA 水平及多巴胺能神經(jīng)元凋亡依次降低，腦黑質SOD 水平依次升高；偽手術組腦黑質TH 染色結果可觀察到細胞及突起豐富，胞體均勻著色，PD組腦黑質多巴胺能神經(jīng)元細胞數(shù)量、殘存神經(jīng)細胞突起顯著減少，BA 低劑量組、BA 高劑量組、多巴絲肼組經(jīng)干預后上述變化有所改善，提示BA 可改善PD 大鼠旋轉行為，減輕腦黑質炎癥反應，保護氧化損傷，減少腦黑質多巴胺能損傷及神經(jīng)元凋亡。BA 是黃芩主要的類黃酮提取物之一，具有抗菌、抗病毒、抗炎、保肝、抗氧化、抗凝血、抗血栓形成、抗腫瘤等多種藥理功能［12］。BA 主要通過減少炎癥介質生成及釋放進而發(fā)揮抗炎作用。此外，BA是優(yōu)秀的鐵離子螯合劑，作為天然自由基清除劑具有很強的抗氧化作用。既往動物實驗發(fā)現(xiàn)，對高脂血癥大鼠進行BA 灌胃后，可降低其血液炎癥因子及氧化應激因子水平，從而使其免受高脂介導損傷［13］。另有研究認為，BA可顯著降低人誘導多能干細胞誘導的肝樣細胞中MDA 水平，增強SOD 活性，從而減少氧化損傷［14］。

Wnt/β-catenin 信號通路在神經(jīng)元存活、神經(jīng)發(fā)生及軸突延長中起關鍵作用，可調節(jié)多種細胞生理進程，控制細胞增殖、分化、凋亡等，并參與糖尿病、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)生。研究顯示，Wnt/β-catenin 信號通路在PD 患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)中被顯著抑制，且有證據(jù)提示β-catenin 在細胞中大量累積是該通路活化的關鍵，β-catenin 自胞漿轉至細胞核結合對應基因并激活cyclin-D1、c-myc 等下游基因表達，增加神經(jīng)元株存活數(shù)量［15-16］。Wnt/β-catenin信號通路減少凋亡的作用主要通過調節(jié)β-catenin表達及其磷酸化作用實現(xiàn)。AKIEDA 等［17］認為，在β-catenin 發(fā)生突變的胚胎中，敲除β-catenin 可導致神經(jīng)嵴細胞、感覺神經(jīng)元、背后側神經(jīng)元凋亡增加。本研究結果中，PD組、BA低劑量組、BA高劑量組、多巴絲肼組、偽手術組p-β-catenin/β-catenin，cyclin-D1、c-myc 蛋白相對表達量依次升高，提示BA 可能通過激活Wnt/β-catenin 信號通路發(fā)揮改善PD 大鼠旋轉行為、減輕炎癥反應及氧化損傷，保護腦黑質多巴胺能神經(jīng)元的功能。

綜上所述，BA可改善PD大鼠旋轉行為，減輕腦黑質炎癥反應及氧化損傷，減少腦黑質多巴胺能損傷及神經(jīng)元凋亡，推測其作用機制與激活Wnt/β-catenin 信號通路有關，為BA 相關藥物的研發(fā)及應用于PD的臨床治療提供理論支持。