馬爾堡病治療和預(yù)防研究進(jìn)展①

王歆瑋 張妤亭 鄭源強(qiáng) 石艷春 陳國江（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)分子生物學(xué)重點實驗室，呼和浩特 010058）

馬爾堡病毒（Marburg virus，MARV）是人類馬爾堡?。∕arburg disease，MARD）的病原體，病死率23%～90%［1-2］。MARV是絲狀病毒科（Filoviridae）的一員，絲狀病毒科主要由馬爾堡病毒屬（Marburgvirus）、埃博拉病毒屬（Ebolavirus）組成［2-3］。馬爾堡病毒屬包括馬爾堡病毒（Marburg virus，MARV）和拉文病毒（Ravn virus，RAVV）兩個亞型［4-5］，MARV 主要有Angola、Musoke 和Ci67 等分離株［6］。最近的一次馬爾堡病毒疫情發(fā)生在2021 年8 月，幾內(nèi)亞東南部發(fā)現(xiàn)了馬爾堡出血熱確診的死亡病例。

MARV 具有非分段負(fù)義RNA 基因組，編碼7 種結(jié)構(gòu)蛋白，從3'至5'依次為核衣殼蛋白（nucleoprotein，NP）、病毒蛋白（viral protein，VP）VP35、VP40、糖蛋白（glycoprotein，GP）、VP30、VP24 以及RNA 依賴的RNA 聚合酶L［7］。其中GP 蛋白作為MARV 唯一表面蛋白，能介導(dǎo)病毒與靶細(xì)胞的黏附以及病毒的進(jìn)入［8］。MARV 糖蛋白基因包含一個編碼全長GP 的開放閱讀框（open reading frame，ORF），在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成后，前體GP 被反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)中的Furin 蛋白酶在435 位氨基酸位點處水解切割，產(chǎn)生兩個二硫鍵連接的亞基，GP1和GP2［9］。由GP1形成的胞外結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)與受體的結(jié)合，而GP2 上含有融合肽，能介導(dǎo)病毒與細(xì)胞膜的融合［8］。MARV 通常通過直接接觸受感染者的血液或其他體液（唾液、尿液、汗液等）而透過損傷皮膚或黏膜進(jìn)入人體［10］。單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞是MARV 感染的早期目標(biāo)［11］，這些被感染的細(xì)胞通過淋巴液或血液將病毒傳播至周圍淋巴結(jié)、肝臟和脾臟等富含單核/巨噬細(xì)胞的多個組織和器官進(jìn)行復(fù)制［12-13］，促使受感染的單核/巨噬細(xì)胞釋放大量促炎細(xì)胞因子（IL-6、IL-8、IL-15 和IL-16）、趨化因子和生長因子（巨噬細(xì)胞炎癥蛋白MIP-1、單核細(xì)胞集落刺激因子、M-CSF、單核細(xì)胞趨化蛋白MCP-1）從而誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)［14］。同時病毒本身會抑制人體Ⅰ型干擾素的分泌，而干擾素是機(jī)體抗病毒感染免疫的主要效應(yīng)分子。在病毒感染晚期，血管內(nèi)皮細(xì)胞是MARV 感染的主要靶細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加和毛細(xì)血管受損可能與MARV 在內(nèi)皮細(xì)胞中的復(fù)制有關(guān)［13，15］，這也是馬爾堡病毒病發(fā)生出血癥狀的主要原因。此外，淋巴細(xì)胞雖不是MARV 感染的主要目標(biāo)，但在感染者的淋巴組織中，腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TNF related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）和一氧化氮（NO）的表達(dá)增加，改變淋巴細(xì)胞生存微環(huán)境，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞大量凋亡［14］。

MARV 既是一種自然獲得性疾病，也是生化武器的潛在病原體，對全球健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，馬爾堡病毒病的防治研究舉足輕重。MARV GP 的受體結(jié)合域（receptor binding domain，RBD）定位于GP1的38～188位氨基酸［16］，其中MARV 進(jìn)入的一個重要步驟是內(nèi)體蛋白酶水解GP1，促進(jìn)受體結(jié)合域與內(nèi)體進(jìn)入因子Niemann-Pick C1（NPC1）蛋白的結(jié)合［8］。MARV 包膜糖蛋白GP 作為主要抗原，其RBD 區(qū)既為疫苗設(shè)計常用的序列，也是抗體識別的主要位點［17］。本文總結(jié)了MARD 潛在的預(yù)防與治療措施，包括疫苗、單克隆抗體、小分子藥物和小干擾RNA（siRNA）等。

1 馬爾堡病的預(yù)防性疫苗

自從MARV 被首次發(fā)現(xiàn)以來，科學(xué)家們就一直致力于MARV 等絲狀病毒的疫苗研究，但至今在世界范圍內(nèi)都沒有獲得批準(zhǔn)任何針對MARV 的疫苗。目前有三種候選馬爾堡疫苗（cAd3、MVA-BN-Filo和MARV DNA）正處于1 期臨床試驗。多個MARV 疫苗（腺病毒、DNA、rVSV、VLP）已在非人類靈長類動物（nonhuman primates，nHPs）中顯示出保護(hù)作用［18］。

1.1 腺病毒載體疫苗 現(xiàn)針對埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）已有幾種腺病毒疫苗，但針對MARV的腺病毒疫苗有限。重組腺病毒5 血清型（recom?binant adenovirus serotype 5，rAd5）是糖蛋白GP 疫苗最常用的載體。在一項研究中，給獼猴注射單劑量表達(dá)MARV-Angola GP 的rAd5 疫苗，4 周后給予同種MARV 攻擊，均未出現(xiàn)臨床癥狀，表明該疫苗對nHPs提供完全保護(hù)性免疫［19］。

復(fù)合腺病毒（the complex adenovirus，CAdVax）疫苗平臺使用5 種抗原：EBOV、SUDV、MARV（Musoke和Ci67）和RAVV的GP以及EBOV和MARVMusoke 的NP。研究人員采用初免-加強(qiáng)免疫策略（prime-boost strategy）對獼猴進(jìn)行這種疫苗接種，并用EBOV、SUDV 和MARV-Musoke/Ci67株進(jìn)行攻擊，它們產(chǎn)生了針對以上5 種絲狀病毒的抗體，所有動物均未出現(xiàn)臨床疾?。?0］。

但是，腺病毒載體疫苗的使用受到人群中預(yù)存免疫（preexisting immunity）的限制，為了解決這一問題，研究人員嘗試采用不太常見的血清型，并在動物模型中進(jìn)行了口服或鼻腔疫苗接種?？茖W(xué)家們使用黑猩猩腺病毒3 型（chimpanzee Adenovirus 3，cAd3）載體及EBOV GP 制備疫苗，針對EBOV 攻擊顯示100%的保護(hù)作用［21］。cAd3 馬爾堡疫苗的1 期臨床試驗?zāi)壳罢谶M(jìn)行。

2016 年發(fā)表的MVA-BN-Filo 疫苗1 期臨床試驗采用與復(fù)合腺病毒疫苗相同的免疫策略，參與者沒有產(chǎn)生疫苗相關(guān)的嚴(yán)重不良反應(yīng)，并且所有接種者在接種增強(qiáng)疫苗后第21 天和8 個月均可檢測到IgG水平［22］。

1.2 DNA 疫苗 絲狀病毒的DNA 疫苗在nHPs 試驗中具有良好的安全性，且易于生產(chǎn)，能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答；但在臨床試驗中，這些疫苗的免疫原性有限［23-25］。將含有MARV-Musoke GP 和MARV-Angola GP 的DNA 疫苗在食蟹猴身上進(jìn)行試驗，產(chǎn)生IgG 反應(yīng)并保護(hù)其免受同種病毒攻擊，但是，所有動物都出現(xiàn)臨床癥狀，這表明僅有IgG 反應(yīng)不能控制感染［19，26］。但將DNA 疫苗作為初免-加強(qiáng)免疫策略的一部分，先使用DNA 疫苗初次免疫，再用腺病毒載體疫苗加強(qiáng)免疫，能夠完全保護(hù)實驗動物。表 達(dá)MARV-Angola GP 的DNA 疫 苗（VRC?MARDNA025-00-VP）已完成1期臨床試驗。

1.3 重組水皰性口炎病毒（recombinant vesicular stomatitis virus，rVSV）載體疫苗 MARV rVSV 疫苗是一種重組的、具有復(fù)制能力的水皰性口炎病毒候選疫苗，將水皰性口炎病毒外膜糖蛋白基因替換為馬爾堡病毒糖蛋白基因，目前有幾種rVSV疫苗已經(jīng)在nHPs 中進(jìn)行研究［27］。用含有MARV、EBOV 和SUDV 3 種GP 的rVSV 載體疫苗免疫nHPs 后，所有3 種組分均能產(chǎn)生抗體免疫應(yīng)答，且對MARV、EBOV、SUDV 和TAFV 均有100%的交叉保護(hù)作用，其中一只動物出現(xiàn)了可檢測到的病毒血癥［28］。另一項研究表明，在接種rVSV-MARV-GP疫苗14個月后仍可檢測到抗MARV GP 的IgG，且對MARV 的攻擊顯現(xiàn)出有效保護(hù)作用，這一結(jié)果也證明了rVSV載體疫苗的持久性［29］。rVSV 載體疫苗對于MARV 來說很有前景，目前還沒有進(jìn)行臨床試驗。

1.4 病毒樣顆粒（virus-like particles，VLP）疫苗馬爾堡VLP（MVLP）疫苗是基于MARV VP40 和GP制備的一種亞單位疫苗，產(chǎn)生的VLPs在形態(tài)上類似于Marburg 病毒粒子［30］。MARV-Musoke、Ci67 和RAVV 分離株的VLP 疫苗在nHPs 中進(jìn)行了試驗，其對所有3種毒株均可產(chǎn)生抗體反應(yīng)，4周后用MARV攻擊時，所有動物都表現(xiàn)出交叉保護(hù)作用［31］。

2 馬爾堡病的治療

目前多種抗馬爾堡病毒的藥物正在研發(fā)中，包括治療性疫苗、抗體療法、小分子藥物、脂質(zhì)包裹的siRNA等。

2.1 治療性疫苗 以預(yù)防為目的的MARV 疫苗品類很多，但以感染病毒后的患者為治療對象的MARV 疫苗主要是以rVSV 為載體的疫苗。研究表明，一種表達(dá)MARV-Musoke GP 的rVSV 疫苗（rVSV ΔG/MARV-Musoke-GP）可充分保護(hù)恒河猴免受高劑量MARV-Musoke的致命攻擊。暴露后注射該疫苗，30 min 存活率為100%，24 h 存活率為83%，48 h 存活率為33%［32-33］。為了評估暴露后對最具致病性的MARV-Angola 突變株的療效，研究人員設(shè)計了表達(dá)同源的MARV-Angola GP 的rVSV 疫苗。獼猴受到高劑量（1 000 PFU）或低劑量（50 PFU）Angola 突變株的攻擊，并在暴露后20～30 min 接受治療。在高劑量和低劑量的攻擊下，分別有25%和60%～75%的治療獼猴幸存下來［34］，這也表明病毒載量與存活率相關(guān)。而在MARD 沒有其他有效治療的情況下，暴露后疫苗應(yīng)該是保護(hù)實驗室和醫(yī)護(hù)人員免受感染的極佳選擇。

2.2 抗體療法 有研究表明，從一例MARV 幸存者的B 細(xì)胞中成功分離的一株中和性單克隆抗體，其識別區(qū)域為MARV GP1 上的NPC1 蛋白受體結(jié)合域，這提示了該抗體的主要機(jī)制可能是抑制GP1 與NPC1受體的結(jié)合［35］。

2.2.1 多克隆濃縮IgG 從MARV 攻擊中存活下來的nHPs 中分離濃縮的多克隆IgG，給MARV 攻擊后的恒河猴注射3 劑（100 mg/kg），可提供完全保護(hù)作用，無病毒血癥或臨床疾病，但動物產(chǎn)生了IgM 反應(yīng)，77 d 后再次用MARV 攻擊顯示出完全保護(hù)。另一研究中，MARV攻擊后48 h靜脈注射給藥，隨后在第4 天和第8 天給藥，存活率100%，其中一只患上輕微疾?。?6］。

2.2.2 單克隆抗體 幾種單克隆抗體（monoclonal antibodies，mAbs）在小鼠感染模型展示了對MARV致死性攻擊的保護(hù)作用。在恒河猴暴露于MARV后第4 天和第7 天分別給予靜脈注射50 mg/kg 的人類單克隆抗體MR191-N，存活率100%。另一實驗表明該mAb 針對MARV 的攻擊存活率80%，針對RAVV 的存活率100%。接受治療的動物其異常的實驗室指標(biāo)均有所改善，這使得mAb MR191-N成為治療和預(yù)防MARV 的潛在候選藥物。目前人體試驗尚未開展［37］。

2.3 小分子藥物

2.3.1 加利司韋（Galidesivir，BCX4430）BCX4430由美國BioCryst 制藥公司研發(fā)，為人工合成的腺苷類似物，通過一種非專一性RNA 鏈終止子來抑制病毒RNA 聚合酶功能，進(jìn)而導(dǎo)致病毒所需蛋白不能表達(dá)，該藥屬于廣譜抗病毒藥，其作用機(jī)制是阻斷RNA 基因組的復(fù)制，抑制病毒繁殖［38］。實驗顯示BCX4430 可以抑制MARV 在體外培養(yǎng)的人類細(xì)胞中復(fù)制，此外，在MARV 攻擊食蟹猴后1 h、24 h 和48 h，肌注BCX4430（15 mg/kg）2次/d，1 h組存活率83%；24 h 和48 h 組存活率100%，接受治療的動物均未發(fā)現(xiàn)明顯的病毒感染癥狀，實驗室檢查指標(biāo)均有所改善，而對照組全部死亡。該藥物的1 期臨床研究已于2016年結(jié)束，目前結(jié)果尚未發(fā)表［39］。

2.3.2 法匹拉韋（Favipiravir，T-705）T-705 由日本富山化工制藥公司研發(fā)，是一種新型的RNA 聚合酶抑制劑，主要通過阻斷病毒核酸復(fù)制的方式來抑制病毒繁殖，該藥對多種RNA 病毒具有廣譜抗病毒活性，已在日本被批準(zhǔn)用于治療流感。已有研究表明，T-705 在小鼠模型中展示了對抗EBOV 的療效［40］。BIXLER 等［41］證明，從食蟹猴接受MARVAngola（1 000 PFU）攻擊當(dāng)天開始，每日兩次靜脈注射T-705，持續(xù)14 d，存活率83%；但口服給藥沒有任何療效。

2.3.3 瑞德西韋（Remdesivir，GS-5734）GS-5734由美國吉利德科技公司研發(fā)，是一種腺苷類似物的前體藥物，具有體外抗MARV 活性。PORTER 等［42］已證明獼猴在感染MARV 后4～5 d 內(nèi)，每日一次服用瑞德西韋5 mg/kg 或10 mg/kg，持續(xù)12 d，低劑量組存活率為50%，高劑量組存活率83%，證明該藥對感染MARV 的獼猴有效，且存在劑量依賴性。該藥已被成功用于治療nHPs 中的埃博拉病毒病（Ebola virus disease，EVD），曾在患埃博拉病的護(hù)士及嬰兒身上使用，證實可以提供保護(hù)作用［43-44］。

2.3.4 干擾素β（IFN-β）人類的EVD 與干擾素α的產(chǎn)生有關(guān)，患者血漿IFN-α 濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他病毒感染者（60～100 倍），但很少產(chǎn)生干擾素β。這一發(fā)現(xiàn)推進(jìn)了在獼猴感染MARV 后注射IFN-β 的研究。早期用IFN-β 治療顯著延長了MARV 感染后的存活時間，但不影響病死率。根據(jù)現(xiàn)有的數(shù)據(jù)IFN-β 作為抗MARV 感染的單藥療法似乎前景不大，但有望作為MARV感染后的輔助治療［45］。

2.3.5 帶正電荷的磷酸二酯嗎啉基低聚物（phos?phorodiamidate morpholino oligomers，PMOs）PMOs是一類寡核苷酸類似物，通過空間位阻抑制mRNA翻譯，從而抑制病毒復(fù)制。發(fā)揮作用時，RNA 中的核糖堿基被結(jié)構(gòu)類似的嗎啉基替代，亞甲基磷酸二酯鍵與mRNA 結(jié)合，進(jìn)而阻止mRNA 翻譯，同時PMOs 添加哌嗪殘基提供一個正電荷，可以增強(qiáng)與帶負(fù)電荷的mRNA的親和力［38］。

研究人員制備了一種組合型PMOs 藥物AVI-6003，其為AVI-7287（靶向VP24 mRNA）與AVI-7288（靶向NP mRNA）的1∶1混合藥物，在MARV-Musoke株感染的恒河猴中，給藥AVI-6003顯示出完全保護(hù)作用。在一項nHPs 的研究中，暴露后30～60 min 內(nèi)給予AVI-6003 10 mg/kg 時存活率50%，20 mg/kg 和30 mg/kg 具有100%的保護(hù)作用。但隨后的一項研究表明，AVI-7287 沒有觀察到生存益處或病毒滴度降低，而AVI-7288 具有抗病毒活性，其抑制NP 的合成，從而對病毒mRNA 的產(chǎn)生、病毒基因組復(fù)制和病毒組裝產(chǎn)生影響［46］。在食蟹猴感染模型中，分別在病毒攻擊后24 h、48 h 和96 h 開始，每日給藥15 mg/kg，持續(xù)14 d，保護(hù)效率依次為83%、100%和83%［47-48］。

在一項人體隨機(jī)對照試驗中，AVI-6003 在人體內(nèi)以遞增劑量（0.05～4.5 mg/kg）給藥，30 名受試者耐受性良好，最常見的不良反應(yīng)是胃腸道癥狀、頭痛和頭暈，有兩名受試者的ALT 和AST 出現(xiàn)1 級升高，8 名受試者的淀粉酶輕度升高［49］。隨后一項涉及40名健康志愿者的隨機(jī)對照試驗中，受試者每天接受1～16 mg/kg 劑量的注射，其中10 名參與者出現(xiàn)頭痛或其他輕微副作用，但未發(fā)現(xiàn)安全問題或嚴(yán)重不良反應(yīng)事件。根據(jù)nHPs 和24 h 藥時曲線下面積推算出，人體保護(hù)劑量為9.6 mg/kg，而蒙特卡洛模擬支持的保護(hù)劑量為11 mg/kg［47］。

2.4 小干擾RNA（siRNAs）利用siRNA 抑制病毒基因表達(dá)是抗病毒研究的新興領(lǐng)域，并且是目前為數(shù)不多的具有前景的抗MARV 治療方法之一。siRNA 通過空間阻斷或觸發(fā)DNA/RNA 雙鏈的斷裂來干擾mRNA 翻譯。研究人員確定了一種靶向MARV NP 的siRNA（NP-718m），被脂質(zhì)納米顆粒（lipid nanoparticle，LNP）包裹時，可在體外抑制MARV 的復(fù)制，同時可通過與內(nèi)體膜融合而進(jìn)入細(xì)胞，并在豚鼠體內(nèi)對3 種馬爾堡病毒株（MARVAngola/Musoke、RAVV）表現(xiàn)出廣泛的保護(hù)作用［50］。在另一實驗中，對感染MARV的恒河猴進(jìn)行NP-718-LNP 的進(jìn)一步研究，使用致命劑量的MARV-Angola株攻擊后30～45 min、24 h、48 h 和72 h 靜脈注射NP718-LNP，所有接受治療的動物全部存活，而未經(jīng)處理的對照組在感染后7至9 d內(nèi)死亡，這表明該藥可在nHPs 中有效治療MARV-Angola 的感染［51］。目前至少有14種siRNAs進(jìn)入臨床試驗。

3 總結(jié)

世界各地的科研人員已經(jīng)對MARV 研究數(shù)十年，從病毒的流行病學(xué)、發(fā)病機(jī)制、傳播途徑以及預(yù)防治療等方面進(jìn)行深入的探索，由于MARV 是高度致命的烈性傳染病病原體，可引起嚴(yán)重出血熱并迅速進(jìn)展為感染性休克，被列為A級致命病原體，需要在生物安全4 級的實驗室開展研究，因此研究過程存在諸多困難和風(fēng)險。目前尚無針對MARV 的預(yù)防性疫苗及抗病毒藥物上市。綜合考慮，預(yù)防性疫苗中腺病毒或rVSV載體疫苗是目前最有前景的；而mAb 作為治療MARV 的潛在首選治療方案正在進(jìn)行臨床驗證，BCX4430 可能是除mAb 制劑（如MR-191-N）以外的第二選擇。需要注意的是，即使采取了上述治療方案，支持性護(hù)理——包括密切監(jiān)測生命體征、液體復(fù)蘇、電解質(zhì)和酸堿監(jiān)測——也是必不可少的關(guān)鍵一環(huán)，同時必須積極應(yīng)對可能的疫情，預(yù)防二次傳播和散發(fā)性感染，一旦發(fā)現(xiàn)應(yīng)立即報告，嚴(yán)密隔離。期待抗MARV 藥物早日上市，造福人類。