布魯氏菌病不同初篩方法及診斷試劑檢測差異性分析

劉麗婭，葉 鋒，馬曉菁，谷文喜，謝彩云，鐘 旗，易新萍

(新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所/新疆畜牧科學院動物臨床醫(yī)學研究中心，烏魯木齊 830000)

0 引 言

【研究意義】布魯氏菌病(Brucellosis，簡稱布病)是由布魯氏菌引起的一種慢性人畜共患傳染病[1]。家畜感染布病可引起母畜流產(chǎn)、胎衣不下和子宮內(nèi)膜炎，公畜則出現(xiàn)睪丸炎、附睪炎[2]。布病對家畜繁殖和生產(chǎn)性能造成嚴重危害，頭胎流產(chǎn)率高達50%～80%，奶和肉減產(chǎn)15%～20%[3]。近年來，隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，飼養(yǎng)量的增加，牲畜及其產(chǎn)品調(diào)運愈發(fā)頻繁，牛布病在一些地區(qū)呈逐年上升趨勢[4]。簡便、快捷、準確度高的診斷方法及檢測產(chǎn)品是有效開展牛布病防控工作的基礎(chǔ)。 【前人研究進展】 目前布病診斷方法主要包括細菌學、血清學和分子生物學診斷3方面，其中血清學診斷方法因其操作簡便、生物風險小，應用最為廣泛[5]。已有多篇報道通過應用不同布病血清學檢測方法，對牛、羊血清檢測結(jié)果進行比對分析[6-11]。【本研究切入點】研究從布病不同血清學初篩方法角度出發(fā)，結(jié)合不同廠家試劑因素，較全面地對布病初篩方法檢測數(shù)據(jù)進行了差異性分析。【擬解決的關(guān)鍵問題】 采用布病4種常規(guī)的血清學初篩檢測方法，虎紅平板凝集試驗(RBT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(iELISA)、熒光偏振試驗(FPA)和免疫膠體金檢測方法(GICA)，選擇在市面上銷售、具有正規(guī)生產(chǎn)批文批號的不同廠家商品化試劑或試劑盒，對確定的陰、陽性牛、羊血清樣品進行檢測。對布病初篩各方法及各廠家試劑產(chǎn)品進行初步分析，以期為布病臨床診斷方法選擇及試劑的選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品采集

在新疆地區(qū)采集的135份牛血清樣品，72份羊血清樣品。應用英國參考實驗室APHA競爭性ELISA(cELISA)試劑盒，對實驗室近年來采集的135份牛血清樣品進行檢測，78份陽性、57份陰性；羊血清72份，檢測結(jié)果為52份陽性、20份陰性。

1.1.2 診斷試劑

陰、陽性對照血清購自哈藥集團生物疫苗有限公司；英國參考實驗室APHA競爭性ELISA試劑盒，批號為C223-17；RBT試劑2種：英國參考實驗室布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗抗原(Ⅰ)、北京某所布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗抗原(2017810)(Ⅱ)；FPA試劑1種：哈爾濱某公司布魯氏菌病熒光偏振測定法試管型抗體檢測試劑盒(921012-1)(Ⅲ)；膠體金試劑4種：深圳某公司布魯氏菌病抗體快速檢測卡(2018041212)(A)、蘭州某公司布魯氏菌抗體檢測試劑盒(膠體金法)(20170501)(B)、浙江某公司布魯氏菌抗體金標快速檢測卡(BRU180303)(C)、上海某公司一步法膠體金快速檢測卡(G180319302)(D)；iELISA試劑4種：北京某公司布病間接ELISA抗體檢測試劑盒(P04130-2)(a)、浙江某公司牛布魯氏菌病間接ELISA抗體檢測試劑盒(01117)(b)、某所牛布病間接ELISA抗體檢測試劑盒(17111506)(c)、北京某公司牛布魯氏桿菌抗體檢測試劑盒(20170502G)(d)。所有試劑及試劑盒均在有效期內(nèi)。

1.2 方 法

1.2.1 血清樣本檢測和結(jié)果判定

所有方法均嚴格按照國標GB/T18646-2018 的規(guī)定和試劑盒說明書進行操作及結(jié)果判定。

1.2.2 血清樣本檢測和結(jié)果判定

應用英國參考實驗室APHA競爭性ELISA(cELISA)試劑盒，對采集的207份血清樣本進行檢測，以此結(jié)果為確診標準開展檢測差異性研究。

1.2.3 檢測結(jié)果差異性

計算敏感性、特異性、假陽性率、假陰性率、一致率、一致性系數(shù)(Kappa)，敏感性Se=a/(a+c)，特異性Sp=d/(b+d)，假陽性率=b/(b+d)，假陰性率=c/(a+c)、一致率= [(a+d)/n]×100%、Kappa值=2(ad-bc)/(p1q2+p2q1)[12-13]。

假陰性率是指確診陽性用某種方法檢測為陰性與確診方法檢測所有陽性之和的百分比；假陽性率是指確診為陰性用某種方法檢測為陽性與確診方法檢測所有陰性之和的百分比；一致率是指確診的陽性與陰性樣本且與2種檢測方法結(jié)果相一致的總和與所有檢測樣本的百分比。Kappa值是醫(yī)學上常用于計數(shù)資料的一致性評測。假陰性與假陽性可反映檢測方法的敏感性和特異性，一致率是檢測方法的相關(guān)程度，Kappa值是一致性檢驗的統(tǒng)計指標，計算比較其符合程度[6]。Kappa值為0.81～1.00 時，判定2種方法完全符合；為0.61～0.80 時，判定2種方法高度符合；為0.41～0.60 時，判定2種方法中度符合；為0.21～0.40 時，判定2種方法比較符合；0.20 以下為輕度符合；0 以下為不符合。表1

表 1 敏感性、特異性及一致性系數(shù)試驗[12-14]Table 1 Sensitivity、 specificity and consistency coefficient test

2 結(jié)果與分析

2.1 牛、羊血清的確診

研究表明，確定布魯氏菌病陽性牛血清78份、陰性57份，布魯氏菌病陽性羊血清52份、陰性20份。

2.2 布魯氏菌病RBT方法檢測差異性

結(jié)果表明，牛血清Ⅰ、Ⅱ抗原檢測特異性均為100%，其中Ⅱ抗原敏感性較高為96%，假陰性率較低為3.85%，一致率較高為97.78%。2種抗原與英國參考實驗室cELISA試劑盒的Kappa值顯示為完全符合。

羊Ⅰ、Ⅱ抗原檢測特異性均為100%，Ⅱ抗原敏感性較高為91%，假陰性率較低為9.09%，一致率較高為94.44%，Ⅱ抗原與英國參考實驗室cELISA試劑盒的Kappa值顯示為完全符合，Ⅰ抗原與英國參考實驗室cELISA試劑盒的Kappa值顯示為高度符合。表2

表2 布病RBT方法檢測結(jié)果差異性比較Table 2 Comparison of differences in detection results of RBT method

2.2.1 布魯氏菌病FPA方法檢測差異性

研究表明，檢測牛、羊血清敏感性均為100%，檢測牛血清的特異性較高為75.44%，假陽性率較低為24.56%，一致率較高為89.63%之間。牛、羊血清檢測與英國參考實驗室cELISA試劑盒的Kappa值顯示均為高度符合。表3

表3 布病FPA方法檢測結(jié)果差異性比較Table 3 Comparison of differences in FPA detection results

2.2.2 布魯氏菌病GICA方法檢測差異性

研究表明，敏感性A、C、D均為100%，B為42%；特異性B為100%，其次A為85.96%、C為57.89%，D最低為54.39%；假陽性率B為0，其次A為14.04%、C為42.11%，D最高為45.61%；假陰性率A、C、D均為0，B最高為57.69%；一致率A最高為94.07%，其次C為82.22%、D為80.74%，B最低為66.67%；A與英國參考實驗室cELISA試劑盒的Kappa值判定為完全符合，C為高度符合，D為中度符合，B為比較符合。

敏感性C、D均為100%，A為95.45%，B最低為54.55%；特異性A、B為100%，C、D為71.43%；假陽性率A、B為0，C、D為28.57%；假陰性率C、D均為0，A為4.55%，B最高為45.45%；一致率A最高為97.22%，其次C、D為88.89%，B最低為72.22%；A與英國參考實驗室cELISA試劑盒的Kappa值判定為完全符合，C、D為高度符合，B為中度符合。表4

表4 不同膠體金試紙條布病檢測結(jié)果差異性比較Table 4 Comparison of differences in detection results of different colloidal gold test strips

2.2.3 布魯氏菌病iELISA方法檢測差異性

研究表明，a、b、c、d敏感性均為100%；特異性a、c為59.65%，其次d為54.39%，最低b為31.58%；假陽性率a、c最低為40.35%，其次d為45.61%，最高b為68.42%；B為0，其次A為14.04%、C為42.11%，D最高為45.61%；假陰性率a、b、c、d均為0；一致率a、c為82.96%，其次d為80.74%，最低b為71.11%；a、c與英國參考實驗室cELISA試劑盒的Kappa值判定為高度符合，d為中度符合，b為比較符合。。圖1，圖2，表5

圖1 牛血清不同方法及不同廠家試劑布病檢測結(jié)果差異對比Fig.1 Comparison of different methods and different manufacturers' reagents

表5 不同iELISA試劑盒布病檢測結(jié)果差異性比較Table 5 Comparison of differences in detection results of different iELISA kits

圖2 羊血清不同方法及不同廠家試劑布病檢測結(jié)果差異對比Fig.2 Comparison of different methods and different manufacturers' reagents

3 討 論

布病的準確檢疫和快速診斷是預防和控制布病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。根據(jù)國標 GB/T 18646-2018 規(guī)定，布病虎紅平板凝集試驗、乳牛全乳環(huán)狀試驗適用于家畜布病田間篩選試驗和乳牛場布病監(jiān)測及泌乳母牛布病診斷的初篩試驗，OIE 推薦的間接ELISA和熒光偏振試驗也常被用于布病初篩[15]。研究選擇4種布病初篩方法(RBT、FPA、GICA和iELISA)、11種試劑檢測同批牛血清結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)，在敏感性方面，除膠體金試紙條(B)敏感性為最低42%外，其余試劑都具有較高的敏感性，其中8種試劑檢測敏感性高達100%；不同方法及其不同產(chǎn)品試劑檢測特異性差異較為顯著，最高可達100%，最低僅為32%。應用3種布病初篩方法(RBT、FPA和GICA)、7種試劑檢測同批羊血清結(jié)果表明，敏感性最高達100%，最低為55%，特異性最高達100%，最低為71%。從陰、陽性樣品檢出一致率結(jié)果來看，RBT方法一致率最高，其次為FPA、GICA、iELISA。與英國參考實驗室cELISA檢測方法間的Kappa值結(jié)果顯示，RBT、FPA與其完全或高度符合，GICA和iELISA為中度符合。

iELISA具有較好的敏感性，和有些研究報道一致[16]。RBT有較好的特異性，這和楊書觀等[17]用3種布魯氏菌病試驗方法對380例布魯氏菌病結(jié)果進行檢測比較分析結(jié)果略有不同。檢測人的診斷抗原和獸用抗原或許存在有區(qū)別，也可能與本研究選擇抗原不夠全面有關(guān)。對比同種方法不同試劑檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RBT方法2種抗原都具有較好的特異性，但敏感性Ⅱ抗原優(yōu)于Ⅰ抗原；GICA 4種試紙條檢測差異較為顯著，A最佳，B最差。iELISA 4種試劑盒檢測結(jié)果敏感性都較好，但特異性最高為60%，最低為32%，a、c試劑盒優(yōu)于其他2種。

4 結(jié) 論

RBT和GICA較具優(yōu)勢，F(xiàn)PA和 iELISA 方法操作相對繁瑣，需儀器設(shè)備讀值，采用不同方法、不同試劑結(jié)果間存有差異；應用同一方法，采用不同試劑對同批血清進行檢測，結(jié)果也存有較大差異；運用同一廠家試劑，檢測牛、羊血清，敏感及特異性效果也有不同。布病檢測一定要選擇2種或以上的檢測方法聯(lián)合檢測以達到其準確性，并應先選擇敏感性較好、快速易操作的方法進行初篩，后用敏感性、特異性均好的檢測方法進行復檢，RBT方法Ⅱ抗原優(yōu)于Ⅰ抗原；GICA 4種試紙條差異較為顯著，A最佳，B最差；iELISA試劑盒a、c優(yōu)于其他b、d。