白細胞介素-22基因多態(tài)性與小兒支氣管哮喘易感性的關(guān)系分析

王 艷 楊德彬

支氣管哮喘為氣道炎癥以及氣道重塑類慢性炎癥性疾病，其中涉及多種細胞以及因子，多表現(xiàn)為呼吸困難、咳嗽、胸悶等癥狀，且呈現(xiàn)反復(fù)發(fā)作特點，在兒童群體發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重影響患兒健康以及發(fā)育[1-2]。研究[3]顯示，支氣管哮喘發(fā)病原因眾多，環(huán)境以及遺傳因素在發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，哮喘呈現(xiàn)出顯著遺傳易感性。基因技術(shù)發(fā)展使單核苷酸多態(tài)性逐漸成為遺傳分子研究重點，目前已知哮喘發(fā)生與1 000多個基因有關(guān)[4]。研究[5]顯示哮喘患者白介素-22 (interleukin-22, IL-22)水平高于健康人群，而IL-22基因多態(tài)性與兒童支氣管哮喘的關(guān)系尚需要進一步研究。本研究擬探究IL-22基因多態(tài)性與小兒支氣管哮喘關(guān)聯(lián)性，為今后哮喘遺傳易感性研究提供參考依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇2019年6月至2021年6月鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院收治的86例支氣管哮喘患兒作為研究組，以同期在該院體檢且健康的74例兒童作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①研究組參照《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》中的標(biāo)準(zhǔn)[6]診斷存在支氣管哮喘；②所有兒童均完成了研究中所有檢查；③患兒家屬同意參與研究，且研究進行符合《赫爾辛基宣言》中對應(yīng)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近期存在呼吸道、泌尿系統(tǒng)及其他部位感染；②近期應(yīng)用免疫抑制劑或者糖皮質(zhì)激素；③免疫系統(tǒng)功能異?；蛘吆喜⑦^敏性紫癜等免疫性疾病者；④心臟、肝腎等重要器官功能異常者；⑤有過敏史或者三代直系親屬中有哮喘發(fā)病史。研究組中男性48例，女性38例，年齡3～8歲，平均(6.12±1.24)歲，身體質(zhì)量指數(shù)14.5～16.8 kg/m2，平均(15.22±0.46)kg/m2，城市67例，農(nóng)村19例；對照組中男性44例，女性30例，年齡3～7歲，平均(5.84±1.18)歲，體質(zhì)量指數(shù)14.2～16.9 kg/m2，平均(15.15±0.63)kg/m2，城市與農(nóng)村分別60例與14例。兩組研究對象一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 IL-22基因多態(tài)性分析 每例研究對象各抽取晨起空腹手肘部位靜脈血2 mL置于含有肝素鈉抗凝試管中，全血DNA抽提應(yīng)用基因組DNA提取試劑盒(北京宜科思源科技有限公司)，按照試劑盒說明書進行操作，引物設(shè)計由上海生物工程有限公司負責(zé)，rs1179251位點(86 bp),上游：3’-ACCTGCATTCTAGCCCTATCTC-5’;下游：3’-AACTGGTTGGGATCTTAGCTTGTC-5’；rs2227484位點(117 bp)：上游：3’-TGCTGAATTCTAAACCAGACTTAT-5’，下游：3’-ACTTCTGCCTTAATTGTTATG ATC-5’；rs2227485位點(104bp),上游：3’-GTTTTGTCTTAGTAGAGTTCAGA-5’;下游：3’-ATAAAGCTGGTAGGAAAATGAGTC-5’。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性處理10 min、95℃變性處理30 s、62℃變性處理30 s、72℃退火處理45 s，進行35個循環(huán)后，在75℃下進行10 min延伸處理。位點基因多態(tài)性應(yīng)用單核苷酸多態(tài)性基因分型試劑盒(美國賽默飛世爾科技有限公司)進行檢測。

1.2.2 血清IL-22、IL-10R、IL-22R水平測定 收集研究對象晨起空腹手肘部位靜脈血2 mL，離心獲得上清液，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司)測定血清IL-22、IL-10R、IL-22R水平，按照試劑盒說明書進行檢測。

1.2.3 支氣管哮喘患兒臨床表型評估 依據(jù)研究組患兒誘導(dǎo)痰細胞學(xué)檢查結(jié)果，將患兒分為中性粒細胞亞組和嗜酸粒細胞亞組，參照中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)會所提出相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[7]進行測定，將中性粒細胞≥61%患者歸入中性粒細胞表型組，嗜酸粒細胞≥3%患者納入嗜酸性粒細胞表型組。

1.3 觀察指標(biāo) 比較兩組研究對象各位點基因型頻率觀察值與期望值，基因型以及等位基因頻率分布情況，比較兩組研究對象血清IL-22、IL-10R、IL-22R水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組對象各位點Hardy-Weinbery平衡檢驗 研究組與對照組對象rs1179251、rs2227484、rs2227485基因型頻率分布符合Hardy-Weinbery平衡，位點基因型分布觀察值與期望值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組對象各位點基因型頻率觀察值與期望值比較[例(%)]

2.2 兩組對象各位點基因型以及等位基因頻率分布情況比較 研究組患兒rs1179251位點CC、CT基因型、rs2227485位點GG基因型檢出率高于對照組(P<0.05)；兩組對象rs1179251位點TT基因型，rs2227484位點CC、CG、GG基因型，rs2227485位點GA、AA基因型檢出率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；兩組對象rs1179251、rs2227484、rs2227485位點等位基因頻率分布比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。rs1179251位點CT基因型(OR=0.589，95%CI：0.378～0.918)、T等位基因(OR=0.658，95%CI：0.456～0.950)，rs2227485位點GA基因型(OR=0.658；95%CI：0.466～0.929)與哮喘發(fā)病風(fēng)險降低有關(guān)。見表2。

表2 兩組對象各位點基因型以及等位基因頻率分布情況比較[例(%)]

2.3 兩組對象血清IL-22、IL-10R、IL-22R水平比較 研究組患兒血清IL-22、IL-22R水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩組對象血清IL-10R水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組對象血清IL-22、IL-10R、IL-22R水平比較

2.4 不同IL-22位點基因型哮喘兒童血清指標(biāo)水平比較 rs1179251位點CC基因型患兒血清IL-22、IL-22R水平高于CT+TT基因型患兒(P<0.05)，rs2227485位點GG基因型患兒血清IL-22、IL-22R水平高于GA+AA基因型患兒(P<0.05)，rs1179251位點CC基因型與CT+TT基因型患兒、rs2227485位點GG基因型與GA+AA基因型患兒血清IL-10R水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，rs2227484位點CC基因型患兒與CG+GG基因型患兒血清IL-22、IL-10R、IL-22R水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 不同IL-22位點基因型哮喘兒童血清指標(biāo)水平比較

2.5 不同支氣管表型患者IL-22基因多態(tài)性分析 嗜酸性粒細胞表型組兒童rs1179251位點CC、CT基因型、rs2227485位點GG基因型檢出率高于中性粒細胞表型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 不同支氣管表型患者IL-22基因多態(tài)性分析

2.6 不同支氣管表型患者血清指標(biāo)水平比較 血清IL-22、IL-22R水平高于中性粒細胞表型組(P<0.05)，不同表型兒童血清IL-10R比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表6。

表6 不同支氣管表型患者血清指標(biāo)水平比較

3 討論

支氣管哮喘為兒童群體常見氣道慢性炎癥性疾病，雖然患者在接受標(biāo)準(zhǔn)療程吸入激素治療以及支氣管擴張劑治療后病情可以顯著改善，但是依然有部分患者治療效果不佳，而這一現(xiàn)象在兒童群體中更為顯著，導(dǎo)致患兒病情遷延不愈，容易反復(fù)發(fā)作[8-9]。因此，深入探究支氣管哮喘發(fā)病機制，為后期治療靶點研究提供參考十分重要。IL-22為功能多樣細胞因子，在不同疾病中可以發(fā)揮抑制或者促進炎癥反應(yīng)作用，與機體疾病發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后有關(guān)[5]。研究[10-11]顯示，IL-22基因多態(tài)性在自身免疫性疾病以及炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用。IL-22能夠通過激活轉(zhuǎn)錄激活因子以及Janus激酶信號轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)導(dǎo)子信號通路，減少上皮細胞增殖、促進上皮細胞增殖，在機體免疫防御中發(fā)揮重要作用，還可以通過上調(diào)促炎因子表達而放大機體炎癥反應(yīng)[12]。還有研究[13]報告IL-22基因rs1179251位點G等位基因是機體炎癥并發(fā)癥發(fā)生保護因素。一項針對人類免疫缺陷病毒感染研究[14]顯示，rs2227513 A/G 基因型與人類免疫缺陷病毒感染有關(guān)，而與rs2227484位點以及rs2227485位點多態(tài)性無關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，rs1179251位點、rs2227485位點高于健康對照組，rs1179251位點CT基因型、T等位基因，rs2227485位點GA基因型可能與哮喘發(fā)病風(fēng)險降低有關(guān)，提示rs1179251位點、rs2227485位點多態(tài)性可能與小兒支氣管哮喘易感有關(guān)。此前研究[15]顯示，IL-22與哮喘的發(fā)生關(guān)系密切，其可通過與氣道平滑肌細胞和肺泡上皮細胞結(jié)合，從而在哮喘發(fā)生過程中發(fā)揮作用。此外，研究[16]發(fā)現(xiàn)哮喘患者痰液以及血清中IL-22水平顯著高于健康者，提示IL-22水平高低與患者哮喘嚴(yán)重程度有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，研究組患兒血清IL-22、IL-22R水平均高于對照組，而兩組研究對象血清IL-10R水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 有研究[13]認(rèn)為IL-22需要與IL-22R受體結(jié)合后才能被激活，因此其是否能夠發(fā)揮作用主要與靶細胞中IL-22R受體存在多少有關(guān)，而是否涉及IL-10R尚需要進一步研究證實。本研究結(jié)果與該研究[18]結(jié)論基本一致。李志等[17]研究則認(rèn)為哮喘發(fā)生初始階段，IL-22會加速氣道上皮細胞壞死速度，進而抑制上皮細胞分化增殖，促進機體氣道炎癥，而哮喘發(fā)生終末階段，IL-22可能發(fā)揮保護氣道組織作用。本研究結(jié)果顯示rs1179251位點以及rs2227485位點基因型與血清IL-22、IL-22R水平關(guān)系密切，提示IL-22可能通過rs1179251位點以及rs2227485位點基因多態(tài)性，影響血清IL-22、IL-22R水平，進而介導(dǎo)患兒支氣管哮喘發(fā)生。研究顯示嗜酸性粒細胞長時間浸潤是支氣管哮喘發(fā)生主要原因，支氣管哮喘患者嗜酸性粒細胞異常上升顯示患者自身免疫能力減弱，機體炎癥反應(yīng)激烈[18-19]。本研究結(jié)果顯示支氣管哮喘患兒臨床表型與rs1179251位點CC、CT基因型，rs2227485位點GG基因型，血清IL-22、IL-22R水平關(guān)系密切，顯示IL-22基因位點多態(tài)性以及血清IL-22、IL-22R水平在支氣管哮喘患兒臨床表型中發(fā)揮重要作用，分析認(rèn)為IL-22基因位點多態(tài)性會影響下游IL-22水平，進而影響機體炎癥反應(yīng)，使患兒出現(xiàn)不同臨床表型。

綜上，IL-22基因rs1179251位點以及rs2227485位點可能與小兒支氣管哮喘易感有關(guān)，rs1179251位點CT基因型、T等位基因，rs2227485位點GA基因型能夠降低哮喘發(fā)病風(fēng)險，而rs1179251位點以及rs2227485位點多態(tài)性可能與患者血清IL-22水平、臨床表型關(guān)系密切。本研究僅證實IL-22基因rs1179251位點以及rs2227485位點多態(tài)性可能與小兒支氣管哮喘易感有關(guān)，但是其在不同地域、種族之間區(qū)別尚需要進一步研究證實，今后將增加研究樣本量，驗證IL-22基因多態(tài)性對小兒支氣管哮喘發(fā)生及進展影響。