向日葵列當(dāng)枯斑病病原菌的分離鑒定及致病力分化

張 鍵，王 娜，劉志達(dá)，包婷婷，張之為，云曉鵬，石必顯，張 恒，陳貴紅，陳燕芳，趙 君

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，新疆 烏魯木齊 830091；4.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆 北屯 836099)

向日葵列當(dāng)(OrobanchecumanaWallr)又稱高加索列當(dāng)、毒根草、兔子拐棍，屬列當(dāng)科(Orobanchaceae)列當(dāng)屬(Orobanche)的一年生寄生性草本植物[1]，主要為害向日葵、瓜類、茄科和豆類等作物[2]。向日葵列當(dāng)沒有真正的根，也沒有葉片進(jìn)行有效的光合作用，它們發(fā)育出特殊的入侵器官(吸器)，穿透寄主的根部表皮，直接將其與寄主作物的維管系統(tǒng)連接起來(lái)，引導(dǎo)水分、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和其他分子從寄主流向自身，從而破壞寄主的生長(zhǎng)發(fā)育[3]。向日葵苗期被列當(dāng)寄生后，不能形成花盤；生長(zhǎng)后期被寄生后，植株生長(zhǎng)緩慢、莖稈矮化，葉片小而發(fā)黃，花盤瘦小，籽粒不飽滿或空秕，產(chǎn)量、品質(zhì)和含油率大幅降低[4-5]。已有的研究結(jié)果表明，向日葵被10株以上的列當(dāng)寄生時(shí)，秕粒增加50%以上[6]，受其危害輕者減產(chǎn)20%左右，重者可達(dá)50% 以上[7]。

我國(guó)于1959年首次報(bào)道了黑龍江省肇州縣向日葵列當(dāng)?shù)陌l(fā)生[8]。此后，隨著向日葵大面積連作、引種混亂、管理粗放，導(dǎo)致列當(dāng)在全國(guó)各向日葵種植地的發(fā)生和危害程度逐年加重[9]。目前，除寧夏向日葵產(chǎn)區(qū)外，幾乎我國(guó)向日葵的種植區(qū)都有列當(dāng)?shù)陌l(fā)生，但以內(nèi)蒙古和新疆發(fā)生最為嚴(yán)重。列當(dāng)作為向日葵的一種寄生性種子植物也時(shí)有病害發(fā)生，如李超[10]鑒定出引起瓜列當(dāng)根腐病的茄病鐮刀菌(F.solani)、木賊鐮刀菌(F.equiseti)、變紅鐮刀菌(F.lateritium)；丁麗麗等[11]報(bào)道了尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、茄病鐮刀菌和禾谷鐮刀菌(F.cerealis)可以引起新疆向日葵列當(dāng)?shù)那o腐??；徐東升[12]對(duì)田間采集的向日葵列當(dāng)病樣進(jìn)行分離和鑒定，確定黃瓜枯萎菌(Plectosphaellacucumerina)是引起向日葵列當(dāng)枯斑病的病原菌。此外，列當(dāng)還能夠被潛葉蠅(Phytomyzaorobanchia)所寄生，通過(guò)在列當(dāng)莖稈中產(chǎn)卵孵化形成幼蟲，幼蟲的取食造成了列當(dāng)莖稈的腐爛和折斷[13]。

內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)分子植物病理實(shí)驗(yàn)室在向日葵列當(dāng)發(fā)生危害調(diào)查以及取樣過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)在近土表列當(dāng)?shù)那o稈上有黑褐色條形病斑的形成。列當(dāng)枯斑病株在向日葵不同種植區(qū)都有發(fā)生，但發(fā)生程度有所不同。發(fā)病初期病斑較小，隨著時(shí)間的推移病斑逐漸縱向和橫向擴(kuò)展蔓延。相鄰病斑還能融合形成環(huán)繞莖稈的大病斑，從而導(dǎo)致列當(dāng)莖稈的枯死。因此，本試驗(yàn)對(duì)采自內(nèi)蒙古、河北和新疆共11個(gè)地點(diǎn)29份向日葵列當(dāng)枯斑病的病樣進(jìn)行了分離和鑒定，明確了引起向日葵列當(dāng)枯斑病病原菌的種類，并對(duì)分離到的病原菌的致病力分化進(jìn)行了研究，為向日葵列當(dāng)生防菌的開發(fā)提供一定基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試的向日葵列當(dāng)枯斑病樣本采集地點(diǎn)信息見表1，從內(nèi)蒙古、新疆和河北3個(gè)地區(qū)共采集樣本29份，其中內(nèi)蒙古地區(qū)樣本共計(jì)23份，分別從巴彥淖爾市、呼和浩特市、鄂爾多斯市及烏蘭察布市地塊中采集得到。供試向日葵列當(dāng)種子采自內(nèi)蒙古呼和浩特市武川縣大豆鋪村的向日葵地塊，經(jīng)鑒定生理小種為G小種。

表1 供試樣本信息Tab.1 Test samples information

1.2 供試培養(yǎng)基及試劑

水瓊脂培養(yǎng)基(Water Agar，WA)：瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL定容，121 ℃高溫滅菌30 min；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar，PDA)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g、水1 000 mL，121 ℃高溫滅菌30 min；麥麩培養(yǎng)基：每60 g麥麩加入自來(lái)水40 mL，攪拌均勻分裝于300 mL的罐頭瓶中，121 ℃高溫滅菌25 min，滅2次。

供試試劑：CTAB、氯仿、異戊醇、異丙醇，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；10×Taq緩沖液、dNTPs、Taq酶和DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)，購(gòu)自天根生物科技有限公司；卡那霉素購(gòu)自AMRESCO公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)引物，由北京厚生博泰科技有限公司合成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 病原菌的分離純化 將發(fā)病的向日葵列當(dāng)莖部洗凈后從病斑的病健交界處切取0.3 cm×0.3 cm大小的薄片，用75%酒精消毒30 s后用無(wú)菌濾紙吸干；然后再用0.1%次氯酸鈉浸泡3 min后用無(wú)菌水沖洗3次。待發(fā)病組織晾干后平鋪在添加有卡那霉素的WA培養(yǎng)基平板上。每個(gè)培養(yǎng)皿上放置5片，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)。待發(fā)病組織四周長(zhǎng)出菌絲后，用接種針在周圍的菌落邊緣挑取帶有菌絲的培養(yǎng)基小塊，轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)至培養(yǎng)皿2/3時(shí)，采用平板稀釋法進(jìn)行單孢分離，并獲得純培養(yǎng)。純培養(yǎng)分離物經(jīng)莖稈接種法進(jìn)行回接鑒定，7 d后觀察病斑擴(kuò)展情況，并從病健交界處進(jìn)行病原物的再分離。

1.3.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定 將單孢后的純培養(yǎng)物接種到PDA培養(yǎng)基上，25 ℃下恒溫培養(yǎng)，待菌絲體長(zhǎng)滿皿后，觀察菌落的質(zhì)地、顏色、基質(zhì)顏色等。挑取菌落制片后在顯微鏡下觀察菌絲體和孢子的形態(tài)。依據(jù)形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果對(duì)分離病原物進(jìn)行初步的鑒定。

1.3.3 病原菌的分子鑒定 采用CTAB法提取分離物純培養(yǎng)的基因組DNA[14]，利用鐮刀菌EF1-α基因特異性引物EF1/EF2進(jìn)行PCR[15]，引物為EF1：ATGGGTAAGGA(A/G)GACAAGA；EF2：GGA(G/A)GTACCAGT(GC)ATCATGTT。50 μL PCR反應(yīng)體系為：引物EF1/EF2各1 μL(10 μmol/L)，10×TaqBuffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，TaqDNA Polymerase 1 μL，DNA模板100 ng，其余用ddH2O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至北京厚生博泰公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果確定分離物的分類地位。

根據(jù)NCBI網(wǎng)站上Blast比對(duì)結(jié)果，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得同源性較高的菌株序列尖孢鐮刀菌(GenBank登錄號(hào)：MK059958.1)、茄病鐮刀菌(GenBank登錄號(hào)：MN650110.1)、木賊鐮刀菌(GenBank登錄號(hào)：KT213293.1)、輪枝鐮刀菌(GenBank登錄號(hào)：KF715264.1)、層出鐮刀菌(GenBank登錄號(hào)：JX268969.1)和大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae,GenBank登錄號(hào)：GU461623.1)，用DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)分析，構(gòu)建基于EF-1α基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 病原菌的回接鑒定與致病力測(cè)定 回接鑒定：①將基質(zhì)、蛭石、沙子按2∶1∶1的比例充分混勻配比成培養(yǎng)土。再按照培養(yǎng)土∶列當(dāng)種子=500 g∶0.15 g配置接種土。在營(yíng)養(yǎng)缽中先裝入1/3的培養(yǎng)土，然后裝入1/3的接種土，最后再裝上1/3的培養(yǎng)土，后用水澆透?jìng)溆?。②將向日葵種子(LD5009)開口向下豎直插入到浸濕的土壤中，再在上面覆蓋一層營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，以剛好蓋住向日葵種子為宜。將上述營(yíng)養(yǎng)缽置于溫室中按時(shí)間進(jìn)行澆水，70 d后開始在列當(dāng)莖稈上進(jìn)行人工接種。③在列當(dāng)莖稈上(地上部5～10 cm)用滅菌牙簽刺出傷口。打取PDA平板上培養(yǎng)7 d的菌餅(5 mm)，將帶有菌絲的培養(yǎng)基面朝向莖稈一面緊貼在傷口位置，并用保鮮膜將接種的PDA菌塊緊緊裹在莖稈上。用沒有接菌的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照。每個(gè)菌種分別接5株列當(dāng)，7 d后觀察病斑的擴(kuò)展情況。

病原菌分生孢子液的制備：將29株列當(dāng)枯斑病病原菌經(jīng)PDA培養(yǎng)基活化培養(yǎng)5～7 d后，用內(nèi)徑8 mm的滅菌打孔器在菌株邊緣打出菌餅，接入麥麩培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)5～7 d。用無(wú)菌水沖洗麥麩培養(yǎng)基，4層滅菌紗布過(guò)濾后獲得分生孢子液。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將分生孢子液的濃度調(diào)至1.0×107個(gè)分生孢子/mL后備用。

病原菌在列當(dāng)上的致病力測(cè)定：列當(dāng)?shù)姆N植參照1.3.4回接鑒定的方法。列當(dāng)生長(zhǎng)70 d后，在列當(dāng)莖稈上(地上部5～10 cm)用滅菌牙簽在葉柄基部刺出傷口，將準(zhǔn)備好的分生孢子液20 μL滴在葉柄基部，取適量脫脂棉，用保鮮膜裹在莖稈接種部位上，以無(wú)菌水作為對(duì)照。接種后的植株置于22～23 ℃溫室條件下進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)。每個(gè)菌株分別接3株列當(dāng)，7 d后觀察病斑的擴(kuò)展情況。

病原菌在向日葵上的致病力測(cè)定：向日葵種子(LD5009)播種到裝有滅菌土的營(yíng)養(yǎng)缽中，待長(zhǎng)至2～4片真葉時(shí)，用滅菌牙簽在中部葉柄基部刺出傷口，將準(zhǔn)備好的分生孢子液20 μL滴在葉柄基部，取適量脫脂棉，用保鮮膜裹在莖稈接種部位上，以無(wú)菌水作為對(duì)照。接種后的植株置于22～23 ℃溫室條件下進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)。每個(gè)菌株分別接3株向日葵，14 d后觀察病斑的擴(kuò)展情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離和回接鑒定

內(nèi)蒙古、河北和新疆11個(gè)不同地區(qū)采集的列當(dāng)枯斑病樣本中共分離獲29株純培養(yǎng)的分離物。依據(jù)分離物在PDA培養(yǎng)基的菌落形態(tài)以及分生孢子形態(tài)可分為5種類型(圖1)。

A.菌落正面；B.菌落背面；C.分生孢子形態(tài)；D.再分離菌株的菌落形態(tài)。A.Front of the colony；B.Back of the colony；C.Conidia morphology；D.Colony morphology of the re-isolated strain.

第1類以GHC1-2為代表的分離物氣生菌絲呈白色致密絲絨狀，生長(zhǎng)3 d后，基物表面由白色轉(zhuǎn)紫色，有許多小型分生孢子，卵圓形，大型分生孢子為鐮刀形，大小為15.72～39.89 μm×5.12～13.46 μm，共有16個(gè)分離物；第2類以XHZ1-7為代表的分離物氣生菌絲白色薄絨狀，邊緣整齊，基物表面白色，背面白色至淡黃色，孢子量多，分生孢子較大呈鐮刀形，大小為35.53～44.75 μm×6.30～15.65 μm，兩端較鈍，極少見小型分生孢子，共有8個(gè)分離物；第3類以XGD3-13為代表的分離物氣生菌絲白色棉絮狀，邊緣不規(guī)則，基物表面和背面都為白色，大型分生孢子鐮刀形，孢子大小為37.16～53.50 μm×8.83～16.33 μm，數(shù)量多，兩端較尖，厚垣孢子圓形，串生，共有3個(gè)分離物；第4類以KBX-2為代表的分離物氣生菌絲白色棉絮狀，基物表面中央呈淡黃色，分生孢子長(zhǎng)橢圓形，大小為16.10～22.50 μm×10.04～17.59 μm；第5類以XGD-1為代表的分離物氣生菌絲絨狀，基物表面白色，背面淡黃色。小型分生孢子數(shù)量多，橢圓形或卵圓形，大型分生孢子鐮刀形，大小為16.77～20.15 μm×5.62～9.51 μm。

將29株分離物經(jīng)莖稈接種法回接至列當(dāng)，7 d后觀察發(fā)現(xiàn)，29株分離物均能侵染列當(dāng)，并形成與田間癥狀一致的黑褐色條形病斑(圖2)。對(duì)回接后的發(fā)病列當(dāng)進(jìn)行病原物的再分離，均能分離到與接種物形態(tài)一致的分離物(圖1-D)。因此，確定分離到的29株分離物為引起向日葵列當(dāng)枯斑病的病原菌。

A.田間發(fā)病病斑；B.分離物回接后發(fā)病情況。A.Disease spots in the field；B.The incidence of the disease after the separations were reconnected.

2.2 病原菌的分子鑒定

以29株分離物DNA為模板，用EF-1α引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段經(jīng)測(cè)序后在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果表明，29株分離物分別屬于5個(gè)種(圖3、表2)。新疆北屯農(nóng)十師183團(tuán)、內(nèi)蒙古呼和浩特市武川縣西海子村和烏蘭察布市四子王旗公合成村的樣本中都獲得2種病原物，鑒定為尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌；內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特前旗西小召鎮(zhèn)、烏蘭察布市化德縣105省道邊和鄂爾多斯市東勝區(qū)都獲得1種病原物，為尖孢鐮刀菌；內(nèi)蒙古烏蘭察布市四子王旗西圪旦村樣本中分別獲得3種病原物，分別為木賊鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和層出鐮刀菌；內(nèi)蒙古巴彥淖爾市五原縣葵博園樣本中分離得到2種病原物，分別為木賊鐮刀菌和尖孢鐮刀菌；而新疆北屯農(nóng)十師188團(tuán)、內(nèi)蒙古巴彥淖爾市臨河區(qū)永利村和河北省張家口市康?？h樣本中都分別獲得1種病原物，分別為茄病鐮刀菌、木賊鐮刀菌和輪枝鐮刀菌(表2)。

A.EF1-α引物PCR 擴(kuò)增電泳：M.DL2000 Marker;1—8.隨機(jī)8株菌株;+.陽(yáng)性對(duì)照；-.陰性對(duì)照。B.菌株GHC 1-2序列比對(duì)結(jié)果。A.The electrophoresis diagram of PCR amplification by EF1-α primer：M.DL2000 Marker；1—8.Random 8 strains；+.Positive control；-.Negative control.B.Strain GHC 1-2 sequence alignment results.

表2 列當(dāng)枯斑病病原菌分子鑒定Tab.2 Molecular identification results of pathogens of broomrape necrotic spot

2.3 病原菌的遺傳聚類分析

為了確定分離獲得的鐮刀屬病原物的遺傳距離，將上述病原物與從GenBank中來(lái)源于不同寄主的鐮刀菌以及大麗輪枝菌進(jìn)行遺傳聚類分析，結(jié)果表明，所有鐮刀屬病原物被劃分為5個(gè)類群，分別是尖孢鐮刀菌、輪枝鐮刀菌、層出鐮刀菌、木賊鐮刀菌、茄病鐮刀菌。其中，茄病鐮刀菌與尖孢鐮刀菌的遺傳距離最遠(yuǎn)，與木賊鐮刀菌遺傳距離最近；而木賊鐮刀菌單獨(dú)聚為一支，和層出鐮刀菌的遺傳距離相對(duì)較近；而尖孢鐮刀菌、輪枝鐮刀菌與層出鐮刀菌的遺傳距離最近，單獨(dú)聚為一個(gè)遺傳分支(圖4)。

圖4 鐮刀菌屬不同種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of different species of Fusarium

2.4 病菌的致病力分化

采用分生孢子液定量接種法，將枯斑病病原菌分別接種于列當(dāng)和向日葵莖稈上，病斑大小統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。結(jié)果表明，鐮刀菌屬種內(nèi)不同菌株間的致病力存在顯著差異，對(duì)列當(dāng)而言，16株尖孢鐮刀菌中致病力最強(qiáng)的是菌株GHC 1-2和XXZ-9，病斑長(zhǎng)度達(dá)4.60 cm和4.57 cm，而致病力最弱的菌株WYKBY-5病斑長(zhǎng)度僅為0.80 cm，相差近4.00 cm；3株木賊鐮刀菌中，YL-1和WYKBY-2分別為致病力最強(qiáng)和最弱菌株，病斑長(zhǎng)度分別為2.93，0.83 cm；茄病鐮刀菌的種內(nèi)差異相對(duì)較小，8株菌中致病力最強(qiáng)的XHZ 1-7和致病力最弱的XHZ 1-2病斑長(zhǎng)度僅相差1.47 cm；對(duì)向日葵而言，16株尖孢鐮刀菌中致病力最強(qiáng)的是菌株XXZ-13，致病力最弱的是菌株HD 1-1，病斑長(zhǎng)度僅為0.23 cm；茄病鐮刀菌8株菌中致病力最強(qiáng)的是菌株183 2-4，病斑長(zhǎng)度為1.23 cm，其余菌株病斑長(zhǎng)度為0.37～0.73 cm；3株木賊鐮刀菌中，WYKBY-2菌株致病力最強(qiáng)，病斑長(zhǎng)度為0.83 cm，YL-1菌株致病力最弱，病斑長(zhǎng)度為0.37 cm(表3)。總體來(lái)看，茄病鐮刀菌和木賊鐮刀菌的種內(nèi)差異小于尖孢鐮刀菌。

表3 枯斑病菌對(duì)向日葵列當(dāng)和向日葵的致病力Tab.3 The pathogenicity of pathogens on broomrape and sunflower cm

相較于列當(dāng)，29株枯斑病菌對(duì)向日葵的致病力整體偏弱，病斑長(zhǎng)度介于0.23～2.33 cm，其中病斑長(zhǎng)度小于0.50 cm的菌株有11株；而在列當(dāng)莖稈上，病斑從接種部位縱向擴(kuò)展，隨著時(shí)間的推移形成環(huán)繞莖稈的大的黑褐色病斑，整體致病力表現(xiàn)較強(qiáng)，病斑長(zhǎng)度介于0.80～4.60 cm，病斑長(zhǎng)度超過(guò)3.50 cm的菌株有6株。其中尖孢鐮刀菌的菌株GHC 1-2和HD 1-1在向日葵上病斑長(zhǎng)度較小，僅為0.40，0.23 cm，在列當(dāng)上的病斑長(zhǎng)度較大，為4.60，4.17 cm；其次為菌株XXZ-9在向日葵上形成的病斑長(zhǎng)度較小，僅為 0.83 cm，而在列當(dāng)上形成的病斑長(zhǎng)度較大，為4.57 cm，其在列當(dāng)上的致病力僅次于菌株GHC 1-2。通過(guò)在列當(dāng)和向日葵上病斑大小的比較，共篩選得到3株在向日葵上致病力弱但列當(dāng)上致病力強(qiáng)的枯斑病菌，它們分別是尖孢鐮刀菌的GHC 1-2、XXZ-9和HD 1-1(圖5)。

A.病原菌在列當(dāng)上的致病情況；B.病原菌在向日葵上的致病情況。A.The pathogenic of pathogens on sunflower broomrape；B.The pathogenic of pathogens on sunflower.

3 結(jié)論與討論

本研究利用柯赫氏法從內(nèi)蒙古、河北和新疆共11個(gè)不同地點(diǎn)29份樣本中鑒定出的5種鐮刀菌屬不同的種，即尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌、木賊鐮刀菌、輪枝鐮刀菌和層出鐮刀菌，其中尖孢鐮刀菌是引起向日葵列當(dāng)枯斑病菌的優(yōu)勢(shì)種。這一結(jié)果和國(guó)內(nèi)的研究者從田間采集發(fā)病列當(dāng)植株分離獲得的多種鐮刀菌菌株的結(jié)果相一致，如李超[10]鑒定出茄病鐮刀菌、木賊鐮刀菌、變紅鐮刀菌是引起瓜列當(dāng)根腐病的主要致病菌，并從中篩選出7株強(qiáng)致病力菌株作為生防菌進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)；丁麗麗等[11]證明了從向日葵列當(dāng)上分離得到尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和禾谷鐮刀菌是引起新疆向日葵列當(dāng)莖腐病的主要致病菌；何偉等[16]對(duì)新疆加工番茄分枝列當(dāng)?shù)牟舆M(jìn)行了分離鑒定，發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌對(duì)分枝列當(dāng)有較強(qiáng)致病力。而上述報(bào)道中從列當(dāng)病樣中分離獲得的變紅鐮刀菌和禾谷鐮刀菌在本研究的樣本中沒有分離得到，本研究中所分離到的層出鐮刀菌和輪枝鐮刀菌也未見有過(guò)相關(guān)的報(bào)道。

為了進(jìn)一步研究29株菌株分別在向日葵和列當(dāng)上的致病性，本研究采用分生孢子液定量接種葉柄和莖稈交界處的方法進(jìn)行向日葵和列當(dāng)?shù)闹虏⌒栽u(píng)價(jià)，將鐮刀菌菌株分別接種于向日葵和列當(dāng)后，鐮刀菌均同時(shí)能夠侵染向日葵和列當(dāng)，但致病力存在明顯的差異，都表現(xiàn)出在其分離寄主上致病力強(qiáng)于其他寄主作物的特性。對(duì)供試菌株在向日葵和列當(dāng)上的致病力分化進(jìn)行研究，結(jié)果表明，從29株枯斑病菌中篩選出3株在向日葵上致病力較弱，但在列當(dāng)上致病力較強(qiáng)的菌株，分別為尖孢鐮刀菌的GHC 1-2、XXZ-9和HD 1-1，這些菌株具有開發(fā)為防控列當(dāng)，生防菌株的潛力。國(guó)內(nèi)外很多研究者也發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌可以作為雜草的重要病原菌對(duì)雜草進(jìn)行防控，王亞嬌等[17]從感病彎管列當(dāng)上分離得到20株鐮刀菌，其中尖孢鐮刀菌 Br-2能夠有效抑制彎管列當(dāng)種子萌芽，抑制率可達(dá) 71.79%；孔令曉等[18]分離的致病鐮刀菌L2菌株，能通過(guò)損傷芽管抑制列當(dāng)種子萌發(fā)；Thomas等[19]研究發(fā)現(xiàn)，尖孢鐮刀菌能夠在向日葵列當(dāng)?shù)叵律L(zhǎng)階段進(jìn)行侵染，顯著降低列當(dāng)種子的萌芽和寄生率；吳元華等[20]利用硫磺調(diào)節(jié)土壤酸堿度的基礎(chǔ)上，施用生防鐮刀菌可推遲向日葵列當(dāng)出土3 d，對(duì)煙田向日葵列當(dāng)防效達(dá)62.44%；而Chen等[21]篩選的鏈霉菌(Streptomycesenissocaesilis)能夠抑制向日葵列當(dāng)種子萌芽，對(duì)列當(dāng)?shù)姆乐涡Ч蛇_(dá) 47%；Thomas等[22]報(bào)道利用尖孢鐮刀菌FoxyⅠ和Foxy Ⅱ的孢子懸浮液作為生防菌對(duì)向日葵列當(dāng)、鋸齒列當(dāng)和分枝列當(dāng)進(jìn)行防控；Müller-St?ver 等[23]制備的海藻酸鈉鐮刀生防菌顆粒則是通過(guò)侵染列當(dāng)植株莖部發(fā)病而達(dá)到防治列當(dāng)?shù)哪康摹１狙芯亢Y選到的3株鐮刀菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不嚴(yán)，容易培養(yǎng)，還可在促孢培養(yǎng)基上形成大量的孢子，所以認(rèn)為這些菌株可以作為有潛力的生防菌用于防控列當(dāng)對(duì)向日葵的寄生。但由于許多鐮刀菌也是農(nóng)作物的重要病原菌，因此還需進(jìn)一步考慮篩選用作生防的菌株對(duì)作物的安全性。