苦瓜白粉病響應(yīng)基因McMLO1的克隆及表達(dá)分析

陳龍正，劉 靜，劉之洋，夏彭飛，袁希漢，寧 宇

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014；2.南京新創(chuàng)蔬菜分子育種研究院有限公司，江蘇 南京 211899)

苦瓜(MomordicacharantiaL.)屬葫蘆科苦瓜屬，原產(chǎn)于亞洲熱帶地區(qū)，是一種一年生蔬菜作物?？喙巷L(fēng)味獨(dú)特，同時(shí)又兼具降血糖、抗腫瘤及提高免疫力等藥用功效[1-2]，因此，深受人民群眾喜愛(ài)。近年來(lái)苦瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展勢(shì)頭迅猛，尤其是在我國(guó)華南地區(qū)種植面積巨大。白粉病是苦瓜生產(chǎn)上面臨的主要病害之一，高溫高濕條件下白粉病在田間的發(fā)病率幾乎達(dá)到100%[3]，嚴(yán)重降低了苦瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。挖掘抗性基因，培育抗病品種是解決苦瓜白粉病危害最經(jīng)濟(jì)有效的手段。然而，目前尚無(wú)苦瓜抗白粉病基因的精細(xì)定位和克隆的報(bào)道。

MLO(MildewResistanceLocusO)是植物特有的一類基因家族，參與根的形態(tài)建成[4]、花粉管發(fā)育[5]及干旱脅迫[6]等多種生物學(xué)過(guò)程。其中，MLO基因最重要的功能之一是負(fù)向調(diào)控寄主植物對(duì)白粉病的抗病反應(yīng)[7]，在一定程度上相當(dāng)于植物的“感病”基因。MLO基因發(fā)生功能缺失突變后會(huì)變成隱性遺傳的mlo基因，而mlo基因可使植物產(chǎn)生對(duì)白粉病的抗性[8]。MLO基因首先發(fā)現(xiàn)于大麥，其等位功能缺失突變基因Hvmlo賦予了大麥對(duì)已知所有白粉病生理小種廣譜且持久的抗性[9]。擬南芥Atmlo2/6/12三基因突變可使擬南芥免疫白粉病的侵染[10]。TALEN技術(shù)誘導(dǎo)的MLO基因突變使普通小麥獲得了可遺傳的白粉病抗性[11]。利用RNAi技術(shù)沉默MdMLO19基因可有效緩解白粉病對(duì)蘋果的危害[12]。上述研究均表明，MLO基因在調(diào)控寄主植物的白粉病抗性反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。

目前，基于3代測(cè)序技術(shù)的高質(zhì)量的苦瓜參考基因組已公布[13]，這為研究者快速挖掘與白粉病抗性相關(guān)的MLO基因奠定了基礎(chǔ)。本研究擬克隆苦瓜MLO基因及其啟動(dòng)子，分析預(yù)測(cè)其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與序列特征及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，并利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)其響應(yīng)白粉病侵染的表達(dá)模式進(jìn)行檢測(cè)，旨在為解析MLO基因調(diào)控苦瓜白粉病感病反應(yīng)的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為進(jìn)一步利用該基因創(chuàng)制抗白粉病苦瓜種質(zhì)提供理論參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料K24為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所特色蔬菜課題組保存的苦瓜高代自交系，表現(xiàn)為對(duì)白粉病敏感。

1.2 試驗(yàn)方法

選取飽滿的種子浸種8 h，在30 ℃的恒溫箱中催芽。選取發(fā)芽整齊一致的種子播種于裝有草炭、蛭石(體積比2∶1)的50孔穴盤中，放置于人工氣候箱中培養(yǎng)(晝溫/夜溫為28 ℃/18 ℃，光周期為16 h/8 h)。當(dāng)幼苗長(zhǎng)至四葉一心時(shí)，對(duì)苦瓜進(jìn)行白粉病人工接種。接種所用的病原菌采自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所六合試驗(yàn)基地，經(jīng)鑒定和分離后保存的瓜單囊殼白粉菌單孢株系。接種時(shí)用毛刷將發(fā)病葉片上的新鮮孢子刷入無(wú)菌蒸餾水中，使用血球計(jì)數(shù)板將孢子濃度調(diào)至1.0×106個(gè)/mL。用噴壺將配制好的孢子液均勻噴到每一片葉片上，直到葉緣有液體滴落。接種后將苦瓜幼苗放置在接種架中，四周用塑料薄膜密封以保持濕度。接種后分別取0，6，12，24，48 h的葉片組織，迅速放入液氮中用于保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 苦瓜MLO基因的克隆

苦瓜MLO基因CDS的擴(kuò)增：利用植物總RNA提取試劑盒RNAprep pure Plant Kit(北京天根生化科技有限公司)提取苦瓜葉片RNA，NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度及純度。以高質(zhì)量苦瓜總RNA為模板，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒(日本TaKaRa公司)操作說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA?；谝压嫉目喙蠀⒖蓟蚪M，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增苦瓜MLO基因的引物(表1)。50 μL PCR體系包括：2 μL cDNA模板，25 μL Phanta Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL及19 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循環(huán)35次；72 ℃最后延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，目的片段切膠、回收后連接到pEASY-Blunt克隆載體(北京全式金生物技術(shù)有限公司)上，熱激法轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，挑取PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的單克隆，送上海生工公司測(cè)序。

表1 本研究使用的引物Tab.1 The sequences of primers used in this study

苦瓜MLO基因全長(zhǎng)擴(kuò)增：采用改良CTAB法提取苦瓜葉片DNA。根據(jù)參考基因組序列，截取起始密碼子上游1 500 bp左右的區(qū)段作為啟動(dòng)子，利用引物McMLO1b擴(kuò)增苦瓜MLO基因全長(zhǎng)及其啟動(dòng)子。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸4 min，循環(huán)35次；72 ℃最后延伸10 min?；厥占翱寺y(cè)序過(guò)程同上。

1.4 序列的生物信息學(xué)分析

苦瓜MLO基因結(jié)構(gòu)采用GSDS(http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/)工具進(jìn)行分析。利用ExPaSy Proteomics Server在線工具(http：//web.expasy.org/protparam/)對(duì)苦瓜MLO蛋白的分子量、理論等電點(diǎn)和蛋白質(zhì)疏水性等理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過(guò)SOPMA在線工具(http：//pbil.ibcp.fr/)預(yù)測(cè)MLO蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使用TMHMM工具(https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0)分析MLO蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域，利用CELLO工具(http：//cello.life.nctu.edu.tw/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。采用DNAMAN 6.0軟件對(duì)不同物種的MLO蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)，采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建MLO蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(Neighbor-joining法，Bootstrap值設(shè)置為1 000)。利用PlantCARE 在線工具(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)苦瓜MLO基因啟動(dòng)子區(qū)域的各種響應(yīng)元件進(jìn)行分析。

1.5 熒光定量PCR分析

以苦瓜的根、莖、葉、卷須、雄花、子房、果實(shí)等組織及白粉病接種后不同時(shí)間點(diǎn)的葉片cDNA為模板，分別檢測(cè)苦瓜MLO基因的組織表達(dá)特異性及其在白粉病脅迫下的表達(dá)變化情況。使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)定量分析引物qMcMLO1(表1)，苦瓜18sRNA基因(GenBank number：XM_022288719)作為內(nèi)參基因用于基因表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)化(表1)。20 μL qPCR反應(yīng)體系包括1 μL cDNA，正、反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL，2×abm?EvaGreen qPCR MasterMix(Applied Biological Materials Inc.，Canada) 10 μL及7.4 μL ddH2O。反應(yīng)在CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad，USA)上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本均設(shè)置3次重復(fù)。采用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[14]。利用SPSS 20.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性方差分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 McMLO1的克隆與生物信息學(xué)分析

以苦瓜高代自交系K24的cDNA為模板，以McMLO1a為引物可擴(kuò)增出1 700 bp左右的目的片段(圖1)。PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明，該基因的CDS序列大小為1 707 bp，編碼568個(gè)氨基酸，將其命名為McMLO1。以K24的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，發(fā)現(xiàn)McMLO1基因的全長(zhǎng)序列為4 019 bp，包含15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子。

1，2，3.McMLO1基因克??；M.2 000 bp Marker。1，2，3.Gene cloning of McMLO1；M.2 000 bp Marker.

ProtParam預(yù)測(cè)McMLO1蛋白的分子質(zhì)量為65.40 ku，理論等電點(diǎn)為9.36；不穩(wěn)定系數(shù)為48.34，表明其為不穩(wěn)定蛋白；親水性平均系數(shù)(GRAVY)為-0.062，屬親水性蛋白。McMLO1蛋白具有一個(gè)大小為477個(gè)氨基酸的MLO保守結(jié)構(gòu)域，符合MLO家族的典型特征。TMHMM分析顯示McMLO1蛋白具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(圖2)，CELLO預(yù)測(cè)表明，該蛋白定位于細(xì)胞膜上；在二級(jí)結(jié)構(gòu)上，McMLO1蛋白存在豐富的α-螺旋(42.61%)和無(wú)規(guī)則卷曲(42.43%)，僅有少量的延伸鏈(10.74%)和β-轉(zhuǎn)角(4.23%)(圖3)。

圖2 McMLO1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of McMLO1 transmembrane

藍(lán)色.α-螺旋；紅色.延伸鏈；綠色.β-轉(zhuǎn)角；紫色.無(wú)規(guī)則卷曲。Blue .Alpha helix；Red.Extended strand；Green.Beta turn；Purple.Random coil.

根據(jù)McMLO1基因啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果，利用PlantCARE工具對(duì)區(qū)域內(nèi)的各種順式作用元件進(jìn)行分析，結(jié)果表明，McMLO1啟動(dòng)子中含有RNA聚合酶Ⅱ起始轉(zhuǎn)錄所必需的CAAT-box和TATA-box元件。此外，還具備AE-box、Box 4、GATA-motif等光響應(yīng)元件，ABRE、TGACG-motif等激素響應(yīng)元件及WUN-motif等機(jī)械損傷響應(yīng)元件，暗示該基因可能會(huì)受到這些信號(hào)的調(diào)控(圖4)。

圖4 McMLO1基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件分析Fig.4 cis-acting elements analysis on promoter region of McMLO1

2.2 McMLO1蛋白序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用DNAMAN軟件對(duì)McMLO1及其他物種MLO蛋白保守結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與黃瓜(Cucumissativus，XP_004142393.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana，Q9SXB6.1)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula，XP_013451626.1)、豌豆(Pisumsativum，AGJ01118.1)、辣椒(Capsicumannuum，AFH68055.1)、番茄(Solanumlycopersicum，NP_001234814.1)、大麥(Hordeumvulgare，P93766.1)和小麥(Triticumaestivum，AAK94905.1)的序列同源性較高。其中，與黃瓜MLO蛋白同源性最高，達(dá)到86.79%。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，McMLO1蛋白具有7個(gè)保守的跨膜結(jié)構(gòu)域(圖5)，這與TMHMM預(yù)測(cè)分析的結(jié)果相一致。

TM.跨膜結(jié)構(gòu)域。TM.Transmembrane domains.

利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示(圖6)，苦瓜McMLO1與黃瓜、甜瓜、印度南瓜和西葫蘆MLO蛋白聚為一支，這與其同屬于葫蘆科的分類學(xué)結(jié)論相一致；與之相比，McMLO1與薔薇科的桃、草莓及禾本科的水稻、大麥、小麥MLO蛋白的親緣關(guān)系則較遠(yuǎn)。

圖6 不同物種MLO蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of MLO proteins from different species

2.3 McMLO1基因的組織表達(dá)特異性分析

利用qRT-PCR方法對(duì)McMLO1基因在苦瓜不同組織中的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，McMLO1基因的表達(dá)具有明顯的組織特異性，在葉中的表達(dá)量最高且與其他組織間差異達(dá)顯著水平(P<0.05)；其次依次是莖和卷須；在果實(shí)中的表達(dá)量最低且與其他組織間差異達(dá)顯著水平(P<0.05)(圖7)。上述結(jié)果表明，McMLO1基因可能主要在葉片中發(fā)揮作用。

不同小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著。圖8同。Different lowercase letters indicate significant differences at P<0.05.The same as Fig.8.

2.4 McMLO1基因響應(yīng)白粉病侵染的表達(dá)分析

白粉病接種后，K24葉片中的McMLO1基因的表達(dá)量顯著升高，并在6 h達(dá)到峰值，較接種前增加了6.2倍，且差異顯著(P<0.05)。表明McMLO1基因可在白粉菌侵染早期被誘導(dǎo)表達(dá)。隨后表達(dá)量有所降低，但在48 h又有所升高(圖8)。

圖8 McMLO1基因在白粉病脅迫下的相對(duì)表達(dá)水平Fig.8 Expression analysis of McMLO1 in response to powdery mildew infection

3 結(jié)論與討論

白粉病是威脅苦瓜生產(chǎn)栽培最嚴(yán)重的病害之一，在高濕環(huán)境下的田間發(fā)病率幾乎達(dá)到了100%。然而，目前高抗白粉病的苦瓜種質(zhì)資源則十分稀缺[15-16]。因此，鑒定苦瓜白粉病抗性相關(guān)基因并利用其對(duì)現(xiàn)有品種的抗性進(jìn)行遺傳改良是解決苦瓜白粉病危害的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。MLO基因作為一種感病基因可以負(fù)向調(diào)控寄主植物對(duì)白粉病的抗性，該基因的功能缺失突變可賦予寄主植物廣譜且持久的白粉病抗性[17]。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，借助TALEN、CRISPR等技術(shù)手段對(duì)MLO基因進(jìn)行定向編輯可快速創(chuàng)制出高抗白粉病的種質(zhì)。Wan等[18]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)VvMLO3基因進(jìn)行了編輯，顯著提高了葡萄對(duì)白粉病的抗性。Nekrasov等[19]同樣利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)SlMLO1進(jìn)行基因編輯也獲得了白粉病抗性顯著增強(qiáng)的番茄。目前，在辣椒[20]、番茄[21]、甜瓜[22]等多種蔬菜作物上均克隆到了感白粉病的MLO基因。然而，苦瓜中尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本研究以苦瓜自交系K24為試驗(yàn)材料克隆得到了McMLO1基因。序列分析表明，McMLO1基因全長(zhǎng)為4 019 bp，其中CDS序列為1 707 bp，包含15個(gè)外顯子，編碼568個(gè)氨基酸。McMLO1基因編碼的蛋白含有一個(gè)由477個(gè)氨基酸組成的MLO保守結(jié)構(gòu)域，證實(shí)其屬于MLO基因家族。McMLO1蛋白具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，這與已報(bào)道的MLO蛋白的典型特征相一致[23]。白粉病侵染后，MLO蛋白主要分布于質(zhì)膜上并聚集在附著胞周圍[24-25]。本研究中，CELLO亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明，McMLO1位于細(xì)胞膜上，這與前人的研究結(jié)果相吻合。蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)McMLO1與黃瓜、豌豆等物種上已明確為白粉病感病因子的MLO蛋白的同源性較高，進(jìn)化關(guān)系較為接近，暗示其可能是苦瓜白粉病感病基因，但明確的基因功能仍需進(jìn)一步的遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

MLO基因的表達(dá)具有組織特異性，且不同物種上的表達(dá)模式有所不同。野薔薇RmMLO基因在感病葉片中的表達(dá)量最高，在根中則無(wú)表達(dá)[26]。黃瓜感病基因CsaMLO8在子葉節(jié)、葉片和果實(shí)中的表達(dá)量顯著高于根和下胚軸[27]，而葡萄VvMLO3基因在根中的表達(dá)量是花和果實(shí)等組織的200倍[28]。在苦瓜中，McMLO1基因在葉片中的表達(dá)量顯著高于其他組織，這也暗示該基因主要是在葉片中參與對(duì)白粉病的響應(yīng)調(diào)控過(guò)程。此外，前人研究表明，白粉病感病基因MLO主要在病原菌侵染前期顯著上調(diào)表達(dá)，如黃瓜CsaMLO8在白粉病侵染4 h表達(dá)量顯著提升[29]，橡膠樹(shù)白粉病感病因子HbMLO12在接種后6 h的轉(zhuǎn)錄本豐度最高[30]。本研究中，苦瓜McMLO1基因在白粉病侵染6 h表達(dá)量顯著升高，且高于其他時(shí)間點(diǎn)，這與前人研究結(jié)果相類似，表明McMLO1是一個(gè)白粉病早期響應(yīng)基因。

綜上所述，本研究克隆了苦瓜McMLO1基因并對(duì)其結(jié)構(gòu)特征、進(jìn)化關(guān)系及表達(dá)特異性進(jìn)行了分析，證實(shí)其參與了苦瓜對(duì)白粉病的響應(yīng)過(guò)程。下一步，通過(guò)基因遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證McMLO1的基因功能，探究McMLO1基因調(diào)控寄主感病反應(yīng)的分子機(jī)理將是后續(xù)研究工作的重點(diǎn)。