雞心包積液-肝炎綜合征卵黃抗體對機體排毒的影響

王凱莉 殷國政 劉成 李玉保 路建彪 楚肖冉 司振書

摘要 為研究應(yīng)用卵黃抗體防控雞心包積液-肝炎綜合征（HHS）的可行性及其對病毒分布和機體排毒的影響，采用卵黃抗體肌肉注射28日齡SPF雞，同時設(shè)置對照組（生理鹽水），2 d后用血清4型禽腺病毒分離株（HuBei 201801）進行人工感染，采用PCR方法檢測病毒的分布及排毒情況;對臨床發(fā)病肉雜雞注射卵黃抗體，檢驗其保護效果。結(jié)果顯示，人工感染SPF雞14 d后，試驗組存活率為93.33%，而對照組存活率為4000%。試驗組只有肝臟PCR檢測呈陽性，其他器官均呈陰性;對照組肝臟PCR陽性率為100%，心臟、腎臟、脾臟等器官陽性率為60%。試驗組未檢出口腔排毒，泄殖腔排毒7dpi時陽性率為20.0%，其他時間未檢出;對照組口腔排毒7dpi時陽性率為50.0%，其他時間未檢出，在3、5、7dpi時均檢出泄殖腔排毒，7dpi時排毒率達66.7%。臨床發(fā)病肉雜雞注射卵黃抗體24 h后死亡數(shù)明顯減少，72 h后很少死亡。由此可見，卵黃抗體可以有效降低感染雞的排毒率，阻止該病原的傳播，為雞群提供有效保護。應(yīng)用卵黃抗體是防控雞心包積液-肝炎綜合征的一項有效措施。

關(guān)鍵詞 心包積液-肝炎綜合征;卵黃抗體;保護效力;排毒

中圖分類號 S855.3? 文獻標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）05-0076-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.05.019

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Effects of Yolk Antibody with Chicken Hydropericardium-hepatitissyndrome Syndrome on the Detoxificationin of Chicken

WANG Kai-li，YIN Guo-zheng， LIU Cheng et al

（College of Agriculture， Liaocheng University， Liaocheng，Shandong 252000）

Abstract To study the feasibility of using yolk antibody to prevent and control chicken hydropericardium-hepatitis syndrome（HHS）and its effect on virus distribution and detoxification of chicken， 28-day-old SPF chicken were injected intramuscularly with yolk antibody， and a control group（normal saline） was set up. After two days， artificial infection was performed with a serum fowl adenovirus type 4 （FAdV-4） isolate. The distribution and detoxification situation of the virus were detected by using PCR.The protective effect was tested by injecting clinically diseased broiler with egg yolk antibody. The survival rate in the test group was 93.33% and that in the control group was 40.00% at 14 days post infection（dpi）， there was extremely significant difference between the test group and control group. DNA of the virus was detected as positive only in the liver and that in other organs were negative in the test group. In the control group， the positive rate by PCR was 100% in the liver， that in the heart， kidneys， spleen， and other organs was 60%. In the test group， the oral detoxification was not detected， the positive rate of the cloacal detoxification was 20.0% at 7dpi， the cloacal detoxification was not detected at the other time. In the control group， the positive rate of the oral detoxification was 50.0% at 7dpi， and that at the other time was not detected; cloacal detoxification was detected at 3，5，7dpi， and the detoxification rate was 66.7% at 7dpi. The death of clinically diseased broiler significantly reduced after injecting with yolk antibody 24 h， the death was little after 72 h. The yolk antibody could effectively reduce the detoxification rate of infected chicken， prevent the spread of the pathogen， and provide effective protection for SPF chicken. The application of yolk antibody was an effective measure to prevent and control HHS in chicken.

Key words Hydropericardium-hepatitis syndrome;Yolk antibody;Protective efficacy;Detoxification

基金項目 山東省重點研發(fā)計劃（公益類）項目（2019GNC106082）;山東省自然科學(xué)基金項目（ZR2020MC175）。

作者簡介 王凱莉（1997—），女，山東昌邑人，碩士研究生，研究方向：家禽疫病診斷與防控技術(shù)。

*通信作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事動物微生物學(xué)研究。

收稿日期 2021-06-21;修回日期 2021-08-01

心包積液-肝炎綜合征（hydropericardium-hepatitis syndrome，HHS）又稱安卡拉病，由血清4型禽腺病毒（fowl adenovirus-4，F(xiàn)AdV-4）引起，以心包積液和肝臟多灶性壞死為主要特征性病變[1-2]。自2015年以來，在我國山東、安徽、河南、河北、江蘇等地均有發(fā)生[3-4]，嚴(yán)重影響了我國養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。該病傳播迅速，死亡率為30%～70%甚至更高，肉雜雞、蛋雞、白羽肉雞和三黃雞等均可發(fā)生，尤其對肉雜雞危害嚴(yán)重，使得有些地區(qū)在該病流行時存欄量急劇下降。殷國政等[5-6]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AdV-4分離株對雞胚和1日齡SPF雞的致死率可達100%，在死雞的多個組織器官中檢測到該病毒。感染雞可以通過口腔和泄殖腔排毒，泄殖腔排毒是其主要的排毒方式。對蛋雞強化免疫后，抗體在卵黃內(nèi)蓄積，可制成卵黃抗體，用于相關(guān)疫病的緊急預(yù)防和治療。當(dāng)前已有雞傳染性法氏囊病、鴨病毒性肝炎和小鵝瘟 3 種疫病的9種商品化卵黃抗體，用于相關(guān)疾病的緊急預(yù)防和早期治療[7]。筆者制備了雞心包積液-肝炎綜合征卵黃抗體，對SPF雞注射2 d后，用血清4型禽腺病毒分離株感染，研究卵黃抗體對SPF雞的保護效力及其對病毒分布和機體排毒的影響;用卵黃抗體對臨床發(fā)病肉雜雞進行治療，取得了良好的治療效果。

1 材料與方法

1.1 毒株與疫苗

FAdV-4湖北分離株HuBei 201801，雞胚半數(shù)感染量（EID 50）為10-4.42/mL，由聊城大學(xué)畜禽疫病防控技術(shù)研究所分離鑒定并保存;FAdV-4滅活疫苗，由聊城大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實驗室制備并保存。

1.2 試驗動物

選擇130日齡健康高產(chǎn)海蘭褐蛋雞作為試驗動物，該雞群FAdV-4抗體檢測呈陰性，由莘縣某養(yǎng)殖場提供。28日齡SPF雞：SPF種蛋購于濟南斯派福瑞禽業(yè)科技有限公司，用小型孵化器孵化種蛋，隔離器內(nèi)飼養(yǎng)。

1.3 引物

根據(jù)參考文獻[8]合成1對擴增Ⅰ群禽腺病毒六鄰體基因（Hexon）的引物，目的條帶1 219 bp。引物序列H 1為5′-TGGACATGGGGGCGACCT-3′，H 2為5′-AAGGGATTGACGTTGTCCA-3′，由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 主要試劑

DNA提取試劑盒購于艾德萊生物科技有限公司;PCR Mix、DL2000 DNA Maker 50等試劑購于北京索萊寶生物科技有限公司;血清4型禽腺病毒抗體檢測試劑盒購于上海心語生物科技有限公司。

1.5 卵黃抗體的制備及檢驗

采用130日齡的健康蛋雞200只，每只注射FAdV-4滅活疫苗1.0 mL;15 d后第2次接種，分2點肌肉注射1.5 mL/只;10 d后第3次接種，肌肉注射20 mL/只。收集免疫蛋，分離卵黃，按照常規(guī)方法制備卵黃抗體。對制備的卵黃抗體采用ELISA方法進行抗體效價檢測[9];取少量卵黃抗體滴于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，37 ℃下培養(yǎng)24 h后進行無菌檢驗;用卵黃抗體頸部皮下注射 30 日齡健康肉雜雞 10只，2.0 mL/ 只，觀察14 d。

1.6 SPF雞飼養(yǎng)、卵黃抗體的注射與攻毒

將28日齡SPF雞60只隨機平均分成2組，試驗組分2點肌肉注射卵黃抗體1.0 mL/只，對照組采用同樣的方法注射生理鹽水，1.0 mL/只。2 d后，對所有雞只頸部皮下注射分離毒株病毒液，300 μL/只（病毒含量約103.9 EID 50）。2組在不同隔離器飼養(yǎng)，每天多次觀察雞只采食、活動、精神狀態(tài)等健康狀況及發(fā)病、死亡情況。

1.7 感染死亡雞各組織臟器中FAdV-4的PCR檢測

對感染后死亡雞只進行解剖，觀察其主要病變。無菌摘取肝臟、心臟、脾臟、腎臟、胰腺、小腸、肌胃、腦等器官，各取少量放入裝有PBS緩沖液的離心管內(nèi)，研磨后離心;取上清液提取DNA，按照DNA提取試劑盒說明書進行，再對FAdV-4的六鄰體基因進行擴增。

在PCR管內(nèi)依次加入PCR Mix 12.5 μL，ddH 2O 8.5 μL，H 1、H 2引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL。PCR反應(yīng)程序如下：預(yù)變性94 ℃ 5 min;94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s，34個循環(huán);72 ℃10 min再延伸;4 ℃冰箱中保存。取PCR產(chǎn)物進行電泳，使用凝膠成像儀拍照并觀察。

1.8 人工感染雞口腔、泄殖腔排毒情況檢測

在人工感染后第3、5、7、14天，分別隨機選取5～6只雞，取口腔和泄殖腔拭子，提取DNA并進行PCR檢測，檢測方法同“1.7”。

1.9 卵黃抗體對臨床發(fā)病肉雜雞的治療

河北某雞場的肉雜雞約1.1萬只，20日齡時開始發(fā)病，死亡62只，剖檢發(fā)現(xiàn)肝臟出血腫大，心包內(nèi)有淡黃色清亮液體，對其肝臟進行禽腺病毒六鄰體基因檢測，結(jié)果呈陽性。21日齡確診后，每只注射卵黃抗體1 mL，剩余10只未做處理作為對照，觀察并記錄雞群的死亡情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵黃抗體效價及安全檢驗結(jié)果

使用FAdV-4抗體檢測試劑盒，測得卵黃抗體濃度為54.6 ng/L。培養(yǎng)基上無菌落生長，說明卵黃抗體不帶菌;注射抗體的肉雜雞食欲、精神狀態(tài)均良好，無不適反應(yīng)。

2.2 雞只發(fā)病死亡情況

試驗組雞只人工感染后第1～2天采食、精神狀態(tài)、活動等均表現(xiàn)正常，第4、5天分別死亡1只，此后無發(fā)病死亡，死亡率為6.67%。對照組第2天有3只精神萎靡、呆立，數(shù)小時后死亡，第5 天達到死亡高峰，第6天后不再有死亡發(fā)生，死亡率為60.00%。SPF雞人工感染后不同時間的死亡情況見表1。試驗組存活率為93.33%，而對照組僅為40.00%，2組間差異極顯著（P<0.01）。對死亡雞進行剖檢，發(fā)現(xiàn)心臟包膜內(nèi)有淡黃色清亮的液體，心包積液最多時超過10 mL，肝臟腫大出血，腎臟腫脹、尿酸鹽沉積（圖1）。

2.3 FAdV-4在感染死亡雞各組織臟器中的PCR檢測結(jié)果

對感染死亡雞的肝臟、脾臟等器官進行處理，采用PCR方法擴增禽腺病毒的六鄰體基因，檢測結(jié)果見表2。由表2可知，試驗組肝臟中FadV-4的陽性率為100%，脾臟、胰腺等器官均呈陰性;對照組肝臟中FadV-4的陽性率為100%（5/5），腦、心臟、腎臟、法氏囊、胰腺等器官中的陽性率均為60%。

2.4 排毒情況檢測結(jié)果

SPF雞人工感染后通過口腔、泄殖腔排毒情況檢測結(jié)果見表3。由表3可知，試驗組在7dpi時1只雞通過泄殖腔排毒，排毒率為20.0%，其他時間均呈陰性。對照組3dpi時檢出泄殖腔排毒陽性，排毒率為167%;5dpi時泄殖腔排毒率為50.0%;7dpi時口腔、泄殖腔排毒率分別為50.0%和66.7%;14dpi時試驗組和對照組均未檢出排毒。

2.5 臨床發(fā)病雞用卵黃抗體治療后死亡情況

注射卵黃抗體24 h內(nèi)雞群死亡86只，24～48、49～72 h各死亡57、21只，72 h后很少死亡，對出現(xiàn)的零星死亡雞進行剖檢，無HHS的典型病變，注射抗體后72 h死亡率約1.50%;未注射抗體的72 h內(nèi)死亡3只，死亡率約30.00%。

3 討論

自2015年HHS暴發(fā)以來，在我國雞群時有發(fā)生，嚴(yán)重危害了養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。該試驗對28日齡SPF雞注射卵黃抗體后人工感染FAdV-4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射卵黃抗體的雞死亡率為6.67%，明顯低于對照組，表明卵黃抗體對SPF雞抵抗4型禽腺病毒的感染具有良好的防效。楊曉偉等[10]發(fā)現(xiàn)用FAdV-4臨沂分離株免疫蛋雞制備的卵黃抗體可以有效預(yù)防15日齡肉雞感染。該試驗結(jié)果與楊曉偉等[10]研究結(jié)果相一致，但卵黃抗體是否對禽腺病毒的分布與機體排毒產(chǎn)生影響則未見報道。對感染死亡雞各臟器進行PCR檢測，試驗組雞只在肝臟中檢測到該病毒，其他臟器均呈陰性;對照組在心臟、肝臟、脾臟等多種臟器均能檢測到該病毒，且陽性率為60%～100%，說明卵黃抗體能夠與該病毒進行結(jié)合，使其不能吸附于細(xì)胞表面，失去感染細(xì)胞的能力，從而阻止病毒在機體內(nèi)的復(fù)制和擴散。該試驗對機體排毒情況的檢測結(jié)果表明，試驗組排毒率明顯低于對照組，說明卵黃抗體能夠有效抑制SPF雞禽腺病毒的排出，降低排毒率，減少病毒的傳播。

對發(fā)病雞群的治療效果表明，卵黃抗體能夠顯著降低臨床發(fā)病雞的死亡率，注射后24 h內(nèi)死亡有所增加，可能與注射應(yīng)激有關(guān)，24 h后死亡明顯減少，72 h后很少死亡，說明卵黃抗體對發(fā)病雞群起到了很好的保護作用。

4 結(jié)論

雞心包積液-肝炎綜合征卵黃抗體能夠?qū)PF雞和肉雜雞起到很好的保護作用。應(yīng)用卵黃抗體是防控該病的一項有效措施。

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