腺水螨屬部分物種DNA條形碼分析

張 旭，吳萍萍，王 琪，印海鋒，宋紹萱

（淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000）

0 引言

腺水螨屬Lebertia Neumank，1880隸屬于蜱螨亞綱Acari，真螨總目Acariformes，絨螨目Trombidiformes，前氣門亞目Prostigmata，大赤螨總股Anystides，寄殖螨股Parasitengonina，水螨亞股Hydrachnidiae，腺水螨總科Lebertioidea［1］.腺水螨屬種類分布廣泛，遍及各大地理區(qū)系的淡水水體中，是底棲節(jié)肢動(dòng)物的重要組成部分.腺水螨的幼螨寄生于蚊、蠓等衛(wèi)生害蟲體表，影響寄主的生長(zhǎng)發(fā)育甚至造成寄主死亡.因而腺水螨可以被用作害蟲的生物防治［2］.目前世界已記錄腺水螨種類300余種，但由于腺水螨屬種類體型微?。?.5～2 mm），形態(tài)構(gòu)造復(fù)雜，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定需要對(duì)螨體解剖，操作過(guò)程繁瑣，不僅耗時(shí)較長(zhǎng)，且對(duì)鑒定者的專業(yè)水平要求較高.

DNA條形碼是Herbert在2003年提出的生物分子鑒定技術(shù)，該技術(shù)是利用生物體內(nèi)線粒體細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ（Cytochrome c oxidase subunit I，COⅠ）基因序列的差異實(shí)現(xiàn)對(duì)物種的快速鑒定［3］.該技術(shù)對(duì)鑒定者的專業(yè)背景沒(méi)有特別的要求，鑒定過(guò)程簡(jiǎn)單，省時(shí).近年來(lái)DNA條形碼技術(shù)在動(dòng)物物種鑒定方面得到廣泛發(fā)展，特別是體型較小，形態(tài)特征構(gòu)造復(fù)雜，利用常規(guī)的形態(tài)學(xué)鑒定較為困難的無(wú)脊椎動(dòng)物［4］.目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于腺水螨屬的研究多集中在形態(tài)分類上，而關(guān)于腺水螨屬的分子鑒定技術(shù)還未曾有報(bào)道.本研究是以GenBank上獲取腺水螨屬的16個(gè)物種93條的COⅠ序列為研究材料，通過(guò)分子序列的分析，探究DNA條形碼技術(shù)在腺水螨屬鑒定中的可行性，為以后腺水螨屬的快速鑒定提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，以腺水螨屬和COⅠ基因?yàn)殛P(guān)鍵詞搜索，為提高數(shù)據(jù)的可信度，選擇已經(jīng)有文獻(xiàn)支持并公開發(fā)表序列，剔除物種信息不明的種類（僅選擇包含詳細(xì)的種名和屬名的物種）.最終下載腺水螨屬16個(gè)物種93條序列（樣品信息詳見(jiàn)表1）［5-8］.

表1 樣品信息

1.2 序列分析

用MEGA 7.0軟件對(duì)93條COⅠ序列進(jìn)行比對(duì)，將冗余序列刪除，計(jì)算堿基組成、變異位點(diǎn)、保守位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)；運(yùn)用DAMBE 6.4.67軟件對(duì)序列飽和度進(jìn)行分析，橫坐標(biāo)為TN93模型校正距離，縱坐標(biāo)為堿基替代頻率，進(jìn)行散點(diǎn)分析；基于K2P（Kimura-2-Parameter）模型計(jì)算種內(nèi)、種間遺傳距離；以Sperchonopsis ecphyma（Genbank登錄號(hào)：MF124252）和Sperchon rostratus（Genbank登錄號(hào)：MF124257）為外群選擇鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Bootstrap值進(jìn)行1 000次重復(fù)檢測(cè)驗(yàn)證樹上各節(jié)點(diǎn)的支持率.運(yùn)用ABGD軟件，在一定的遺傳距離范圍內(nèi)對(duì)樣本進(jìn)行劃分.將93條COⅠ序列提交至ABGD網(wǎng)站，種內(nèi)差異先驗(yàn)值P為0.001到0.1，最小相對(duì)gap寬度值X（minimum relative gap width）為0.6，steps值設(shè)為20.

2 結(jié)果與分析

2.1 堿基序列特征

使用MEGA 7.0軟件對(duì)93條COⅠ序列進(jìn)行比對(duì)后，最終保留608 bp的同源序列，序列中沒(méi)有缺失或者插入的現(xiàn)象.T、C、A、G的平均含量分別為34.1%、18.9%、31.8%、15.2%，C+G的含量（34.1%）小于A+T的含量（65.9%），這與節(jié)肢動(dòng)物序列特征相似，有明顯的堿基偏好性.特別是在第3位密碼子A+T含量高達(dá)85.2%，G含量的平均值僅有3.5%，C含量的平均值與A、T相比也較低，為11.3%.保守位點(diǎn)、變異位點(diǎn)和簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)的含量為387個(gè)、221個(gè)、212個(gè)，在608 bp位點(diǎn)中分別占63.65%、36.35%和34.87%，變異位點(diǎn)大多數(shù)在第3核酸位點(diǎn).

表2 16種腺水螨93條COⅠ基因序列堿基序列特征 %

2.2 堿基替換分析

應(yīng)用MEGA 7.0軟件進(jìn)行堿基替換分析，在16種腺水螨的93條序列中，核苷酸替換多數(shù)為一致替換，為524個(gè)，轉(zhuǎn)換數(shù)（S）和顛換數(shù)（V）的比值為1.1，顛換數(shù)和轉(zhuǎn)換數(shù)的平均值分別為41和44.在第1、2、3位點(diǎn)的轉(zhuǎn)換數(shù)和顛換數(shù)的比值為3.9、10.5、0.8.轉(zhuǎn)換和顛換主要發(fā)生在第3位點(diǎn)，轉(zhuǎn)換數(shù)為31個(gè)，頻率總數(shù)為72.0%；顛換數(shù)為37個(gè)，頻率總數(shù)為92.5%.通過(guò)DAMBE 6.4.67軟件進(jìn)行序列飽和度分析，飽和度分析散點(diǎn)圖（圖1）表明，遺傳距離與堿基替換頻率呈線性增加的關(guān)系，沒(méi)有出現(xiàn)飽和態(tài)趨勢(shì)，可以建立系統(tǒng)發(fā)育樹.

圖1 基于CO I基因序列堿基替換飽和度

2.3 遺傳距離分析

在MEGA 7.0軟件中，基于K2P（Kimura-2-Parameter）模型計(jì)算16種腺水螨的種內(nèi)、種間遺傳距離，結(jié)果顯示（見(jiàn)表3），種內(nèi)遺傳距離變動(dòng)范圍0～0.07，其中種內(nèi)遺傳距離大于2%的有2種，分別為L(zhǎng).porosa0.07和L.schechteli0.023，其余種內(nèi)遺傳距離均小于2%.種間遺傳距離變動(dòng)范圍為0.025～0.218.除L.porosa和L.schechteli外，其余物種的種間平均遺傳距離為0.147，種內(nèi)平均遺傳距離為0.003，種間平均遺傳距離是種內(nèi)平均遺傳距離的49倍.

表3 基于COⅠ基因序列16種腺水螨的種內(nèi)和種間的遺傳距離

2.4 ABGD的評(píng)估結(jié)果

93條序列ABGD的評(píng)估結(jié)果顯示，ABGD法可以明顯出現(xiàn)條形碼間隙（圖2a）.物種劃分結(jié)果見(jiàn)圖2b，包括初始劃分和遞歸劃分，初始劃分較為穩(wěn)定，遺傳距離在0.001～0.100之間，被劃分為13個(gè)物種，少于形態(tài)學(xué)分類結(jié)果，而遞歸劃分結(jié)果顯示，遺傳距離在0.001、0.001 274、0.001 624時(shí)支持27個(gè)物種；在0.002 069、0.002 637時(shí)，支持24個(gè)物種；在0.003 360、0.004 281、0.005 456時(shí)，支持23個(gè)物種；在0.006 952時(shí)，支持22個(gè)物種；在0.008 859時(shí)，支持21個(gè)物種；在0.011 288時(shí)，支持20個(gè)物種；在0.014 384、0.018 330、0.023 357時(shí)，支持19個(gè)物種；在0.029 764、0.037 927時(shí)，支持16個(gè)物種；在0.048 329、0.061 585時(shí)，支持15個(gè)物種；在0.078 476、0.100 000時(shí)，支持13個(gè)物種.P值在0.014 384、0.018 330、0.023 357時(shí)，和鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹所評(píng)估的物種數(shù)量相同.

圖2 基于ABGD腺水螨屬部分物種分析結(jié)果

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

在MEGA 7.0軟件中以Sperchonopsis ecphyma和Sperchon rostratus作為外群［9］，以NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示（見(jiàn)圖3），除L.porosa聚集為3支外，其余不同的物種均能聚為單系，例如L.schechteli的12條序列、L.maculosa的7條序列、L.salebrosa的4條序列、L.reticulata的3條序列等均以100%的高支持率聚集為一支.

ABGD所劃分的物種與NJ所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹稍有區(qū)別（圖3）.ABGD除將L.porosa劃分為3個(gè)組外，還將L.schechteli劃分為2個(gè)組，其余劃分與形態(tài)結(jié)果一致.

圖3 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹和ABGD劃分結(jié)果

3 討論

水螨亞股Hydrachnidiae是蜱螨亞綱中一類體型微小，形態(tài)構(gòu)造復(fù)雜的類群.近年來(lái)，隨著分類人員隊(duì)伍的萎縮，水螨的形態(tài)鑒定面臨著更大的困難.DNA條形碼技術(shù)的出現(xiàn)，為解決這一困難提供可能.目前，水螨類群中的Brachypodopsis、Krendowskia、Koenikea、Hygrobates、Sperchon等已經(jīng)開始使用DNA條形碼進(jìn)行輔助鑒定，并取得較好的效果［10-13］.然而，腺水螨屬的DNA條形碼研究未曾開展.本研究利用Genbank中下載的腺水螨93條COI基因序列進(jìn)行DNA條形碼的分析，探討其在腺水螨類群中適用性.

Hebert對(duì)DNA條形碼研究后曾提出，動(dòng)物種內(nèi)遺傳差異2%的閾值和種間差異為種內(nèi)差異10×的標(biāo)準(zhǔn)［3，14］.本研究的16種腺水螨中，L.porosa和L.schechteli的種內(nèi)遺傳距離大于2%，其余物種的種內(nèi)遺傳距離均小于2%，僅L.porosa和L.schechteli不符合Hebert提出2%的閾值.除L.porosa和L.schechteli外，種間平均遺傳距離是種內(nèi)平均遺傳距離的49倍，符合10×的標(biāo)準(zhǔn).

為繼續(xù)驗(yàn)證COI基因是否可以應(yīng)用于腺水螨屬的DNA條形碼序列，本研究應(yīng)用ABGD軟件進(jìn)行物種劃分并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.ABGD對(duì)物種的劃分結(jié)果顯示，可以形成明顯的條形碼間隙，并將L.porosa劃分為3個(gè)組，L.schechteli劃分為2個(gè)組.系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果顯示，除L.porosa分為3個(gè)分支外，其余的物種均能以100%的高支持率聚為單獨(dú)的一支.系統(tǒng)發(fā)育樹的劃分結(jié)果和ABGD對(duì)物種的劃分結(jié)果基本相同.

由遺傳距離、系統(tǒng)發(fā)育樹和ABGD的分析結(jié)果來(lái)看，本研究所使用的16種腺水螨，除L.porosa和L.schechteli，其余腺水螨均能夠使用COI基因片段作為DNA條形碼進(jìn)行區(qū)分.Pe?i?等［10-11］通過(guò)分子序列的研究已經(jīng)證實(shí)，在Hygrobates和Brachypodopsis等水螨物種中可能存在隱存種，本研究中的L.porosa和L.schechteli遺傳距離大于2%，在系統(tǒng)發(fā)育樹中分為不同的分支，ABGD劃分為不同的物種，這些均顯示L.porosa和L.schechteli中可能存在隱存種.如果要進(jìn)一步確定隱存種，還需要更多的形態(tài)研究和分子數(shù)據(jù)分析.

DNA條形碼技術(shù)發(fā)展至今已經(jīng)成為形態(tài)學(xué)鑒定的有效補(bǔ)充，本研究的結(jié)果也證明DNA條形碼可以用于腺水螨屬的物種鑒定.但本研究所涉及的物種數(shù)有限，是否能夠適用于所有的腺水螨，還需要后續(xù)深入的研究.同時(shí)，也要注意在進(jìn)行DNA條形碼分析時(shí)不能完全脫離形態(tài)分類研究，兩者相輔相成，才能促進(jìn)分類學(xué)的發(fā)展［15］.