NAFLD與肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)研究新進(jìn)展*

周 平，姚登福，姚 敏

隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)[1]或代謝相關(guān)性脂肪性肝病(metabolic dysfunction-associated fatty liver disease，MAFLD)[2]發(fā)病率逐年增長(zhǎng)，并呈低齡化趨勢(shì)。真實(shí)世界NAFLD發(fā)病率可能較高，應(yīng)引起重視。脂質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的分析鑒定、脂質(zhì)功能與代謝調(diào)控(關(guān)鍵基因/蛋白/酶)、脂質(zhì)代謝途徑及網(wǎng)絡(luò)調(diào)控等方面的研究非?；钴S，成為代謝組學(xué)重要的分支之一。NAFLD與HCC發(fā)生的問(wèn)題也已引起了廣泛的關(guān)注。NAFLD是非酒精性脂質(zhì)代謝異常導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪堆積、影響肝細(xì)胞的正常功能發(fā)揮、誘發(fā)炎癥而引起的最常見(jiàn)的慢性肝病[3]。長(zhǎng)期肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積，脂質(zhì)毒性的影響將啟動(dòng)肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)信號(hào)通路，引起致癌基因激活和免疫功能失調(diào)等一系列的改變，但其中確切的發(fā)生機(jī)制仍在探究之中。新發(fā)現(xiàn)線粒體功能[4]、非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)、腸道菌群和免疫系統(tǒng)，尤其是T淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)及其亞群等參與了NAFLD相關(guān)的肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[5]。

1 多基因參與NAFLD相關(guān)肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化

NAFLD是最常見(jiàn)的肝病，其疾病譜包括非酒精性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化和HCC等。在每千例NASH中，年HCC發(fā)病率約為5.29例，已是肝移植最常見(jiàn)的病因。隨訪NAFLD患者10～20年，肝硬化發(fā)生率為0.6%～3%，而NASH群體10～15年肝硬化發(fā)生率達(dá)15 %～25 %。NAFLD與HCC間存在因果關(guān)系。全球約13%～38.2% HCC患者與NASH相關(guān)，因?yàn)榇蠖郒CC發(fā)生于肝硬化患者[6, 7]。NASH患者發(fā)生HCC風(fēng)險(xiǎn)明顯低于HCV感染者。雖染在肝硬化中HCC常見(jiàn)，但HCC也見(jiàn)于非肝硬化的NAFLD/NASH患者，約50%NASH相關(guān)HCC并無(wú)肝硬化基礎(chǔ)，給HCC早期診斷和治療帶來(lái)困難。

分析Omnibus數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)基因顯示NAFLD、NASH、NAFL和正常對(duì)照組間存在差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)和關(guān)鍵基因。經(jīng)Gene Ontology (GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)通路富集分析，顯示DEGs對(duì)NASH具有潛在的功能。以STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)，鑒定出249個(gè)DEGs。在NASH與正常組間有514個(gè)DEGs和11個(gè)關(guān)鍵基因的差異，其中3個(gè)基因與HCC患者生存或與NASH進(jìn)展為HCC密切相關(guān)。KEGG富集分析顯示了在NAFLD患者肝細(xì)胞脂肪變性和炎癥反應(yīng)相關(guān)通路[8]。對(duì)DEGs進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，鑒定出MYC、CXCL8、FOS、SOSC、SOCS3、IL6和PTGS2等7個(gè)基因?yàn)橹袠谢?；巨噬?xì)胞M2、記憶休眠CD4+T細(xì)胞和γδT細(xì)胞在NASH免疫微環(huán)境中起著重要作用[9]。AKR1B10是還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)依賴(lài)的還原酶，屬于醛酮還原酶(AKR)1B亞家族，催化醛、某些酮和醌還原，與乙酰輔酶A羧化酶和HSP90α相互作用介導(dǎo)了NAFLD的發(fā)生，是NASH進(jìn)展的關(guān)鍵基因，有希望成為NASH的生物標(biāo)志物[10]。

2 NAFLD與肝組織免疫細(xì)胞異常

病毒性或非病毒性因素均可導(dǎo)致HCC的發(fā)生。基礎(chǔ)和臨床資料證明NASH是HCC重要的病原學(xué)因素[11]。肝臟作為重要的免疫器官，含B細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)細(xì)胞、庫(kù)普弗細(xì)胞(Kupffer cell，KCs)和自然殺傷細(xì)胞(NK)等免疫細(xì)胞。B細(xì)胞可誘導(dǎo)IL-6、TNF-α和IgG2a分泌，活化CD4+T細(xì)胞和分化成Th1細(xì)胞參與NAFLD的進(jìn)展[12]。NASH大鼠模型研究發(fā)現(xiàn)DC細(xì)胞抑制CD8+T細(xì)胞活化，減輕纖維化和炎癥反應(yīng)。在高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型大鼠，給予骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)可有效抑制T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和DC等免疫細(xì)胞活化。抑制脾CD4+IFN-γ+和CD4+IL-6+T細(xì)胞分化，可減輕體質(zhì)量、脂肪變性、炎癥和肝纖維化，且不影響CD4+IL-17+T細(xì)胞的活性。在NASH誘導(dǎo)HCC模型中，耗竭的、異常激活的CD8+程序性死亡-1(PD1)T細(xì)胞積聚，增加瘤內(nèi)活化CD8+T細(xì)胞，損傷免疫監(jiān)視?？筆D1治療增加NASH進(jìn)展為HCC發(fā)生率，與肝組織CD8+PD1+CXCR6+、TOX+和TNF+T細(xì)胞增加有關(guān)。NAFLD患者和動(dòng)物模型均見(jiàn)類(lèi)似表型和功能特征，CD8+T細(xì)胞是通過(guò)系列激活完成自身攻擊，為免疫介導(dǎo)導(dǎo)致NASH新的發(fā)病機(jī)制[13]。對(duì)晚期HCC患者的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，因CD8+T細(xì)胞活化致免疫監(jiān)視受損，免疫治療并未改善NAFLD相關(guān)HCC患者的療效，提示NASH誘導(dǎo)的HCC患者CD8+T細(xì)胞激活損傷了免疫監(jiān)視功能，為相關(guān)免疫治療HCC患者提出了警示[14,15]。

在NAFLD動(dòng)物模型和NAFLD患者的研究顯示慢性肝病進(jìn)展為HCC患者，選擇性CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞功能發(fā)生了變化[16,17]。在高脂飲食(HFD)誘導(dǎo)的NAFLD鼠模型，早期CD8+T細(xì)胞無(wú)變化，8周時(shí)CD44+CD8+T細(xì)胞明顯下降，第10周后持續(xù)升高，CD8+T細(xì)胞參與促進(jìn)NASH發(fā)展，與NK T細(xì)胞共同作用促進(jìn)HCC 發(fā)展[18,19]。在NAFLD患者，CD4+T細(xì)胞增加，而CD8+T細(xì)胞則降低。NASH患者Th1上調(diào)、Treg減少，Th17/Treg細(xì)胞比值降低。NAFLD患者肝組織Th17細(xì)胞分泌IL-17參與疾病進(jìn)展，加重肝臟炎癥和肝損傷，被認(rèn)為是NAFLD向NASH進(jìn)展的標(biāo)志[20,21]。在NAFLD或NAFLD相關(guān)HCC患者，Treg減少，提示Treg參與了NAFLD向HCC的進(jìn)展。

3 線粒體損傷加重NAFLD進(jìn)展

肝組織脂肪堆積是NAFLD的顯著特征。高熱量飲食和飽和脂肪酸攝入增加脂肪積聚，損傷氧化應(yīng)激和亞硝化應(yīng)激作用[22]，出現(xiàn)線粒體DNA(mtDNA)損傷，肝細(xì)胞凋亡/壞死增加、易導(dǎo)致NASH纖維化和肝硬化，甚至是HCC。傳統(tǒng)的NAFLD發(fā)病機(jī)制包括脂質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞因子過(guò)表達(dá)、脂代謝異常、鐵超載、免疫和藥物、生活習(xí)慣等，其核心是胰島素抵抗致脂肪積聚，三酰甘油堆積形成脂肪肝。氧化應(yīng)激和過(guò)氧化加劇肝損傷進(jìn)展，致肝細(xì)胞壞死、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、腸源性?xún)?nèi)毒素增加、脂肪因子失衡、肝星狀細(xì)胞激活等，致使細(xì)胞外基質(zhì)沉積，肝纖維化形成，累及肝實(shí)質(zhì)，肝小葉重構(gòu)發(fā)展至肝硬化，持續(xù)炎癥激活癌基因，直接進(jìn)展到肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，其機(jī)制較為復(fù)雜[23]。

在新發(fā)現(xiàn)的環(huán)磷酸鳥(niǎo)-腺苷合成酶/干擾素基因刺激因子((cGAS/STING)信號(hào)通路中，作為DNA探測(cè)器的cGAS可檢測(cè)到溢出的mtDNA，激活STING通路，有效刺激IFN-I等炎性因子表達(dá)，加重肝損傷[24]。非高血糖代謝綜合征、多種抗原形成和免疫失調(diào)等病理學(xué)過(guò)程也可能參與了發(fā)病[25，26]。位于線粒體外膜肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1(CPT-1)控制脂肪酸進(jìn)入線粒體[27]，CPT-1上調(diào)增加線粒體活性氧(mtROS)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。過(guò)氧化物酶體增殖激活受體α介導(dǎo)CPT活化，藥物perhexiline阻斷CPT-1，可減少肝組織CD4+T細(xì)胞凋亡，從而抑制肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[28]。另外，當(dāng)脂質(zhì)積聚時(shí)，線粒體內(nèi)膜CPT-II失活，脂肪β-氧化受阻，能促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[29]。以高c18:2或蛋氨酸膽堿缺乏飲食(MCD)喂養(yǎng)制備小鼠模型，能重現(xiàn)CPT異常表達(dá)、線粒體內(nèi)亞油酸(c18:2)高度增加，提示線粒體DNA損傷和CPT活性直接影響脂質(zhì)氧化，在脂肪積聚狀態(tài)下肝細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，也為NAFLD相關(guān)HCC的防治提供了新思考[30]。

4 腸道菌群與NAFLD相關(guān)HCC

肝臟與腸道密切相連，門(mén)靜脈、肝動(dòng)脈和膽管組成重要的代謝樞紐，涉及消化、解毒和清除菌群產(chǎn)物等功能。沿血管排列的肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞分布和功能相關(guān)聯(lián)[31]。單細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)共生菌群調(diào)控Kupffer細(xì)胞，CXCL9趨化因子不僅調(diào)控巨噬細(xì)胞的分布，且具有宿主防御功能。腸-肝軸涉及多個(gè)系統(tǒng)，即將初級(jí)膽汁酸包括IgA送入腸腔。菌群相關(guān)分子模式(microbial-associated molecular patterns，MAMPS)和次級(jí)膽堿被輸送至門(mén)靜脈， 將食物代謝物、游離脂肪酸、乙醇和膽堿代謝物等，經(jīng)毛細(xì)管輸送至腸/體循環(huán)。腸-肝雙向連接，調(diào)控腸道菌群、腸上皮、血管屏障和脂代謝過(guò)程[32]。代謝組學(xué)顯示NAFLD相關(guān)肝硬化患者腸道菌群變化誘發(fā)了肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。在NAFLD相關(guān)HCC患者，菌群提取物可誘發(fā)T細(xì)胞免疫抑制表型，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增加和CD8+T細(xì)胞衰減，表明腸道菌群具有獨(dú)特的微生物/代謝組學(xué)特征，并可調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)。

腸源性產(chǎn)物可經(jīng)門(mén)靜脈進(jìn)入肝臟，腸道菌群為NAFLD的隱藏“器官”，在內(nèi)環(huán)境平衡或NAFLD發(fā)病方面發(fā)揮作用[31]。腸道生態(tài)失調(diào)系益生菌耗盡、病原菌增加、短鏈脂肪酸減少致腸上皮細(xì)胞屏障通透性增加、膽汁酸合成改變、肝臟次級(jí)膽汁酸滯留、促膽堿代謝形成氧化三甲胺，促進(jìn)NAFLD進(jìn)展。炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-8和IL-1)增加，觸發(fā)Toll樣受體(TLR)-4/9激活，介導(dǎo)由TNF-α和前列腺素E2引起的炎癥，脂質(zhì)堆積促進(jìn)細(xì)胞凋亡，激活干細(xì)胞產(chǎn)生纖維化成分，促進(jìn)NAFLD相關(guān)性肝硬化和肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的發(fā)生。益生菌有抗HBV和HCV活性，有益于減肥和防范NAFLD/ NASH風(fēng)險(xiǎn)，可上調(diào)抑癌基因和下調(diào)癌基因表達(dá)，降解膳食代謝物，減輕肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)。

5 ncRNA調(diào)控NAFLD

在NAFLD相關(guān)HCC，涉及抑癌基因失活或癌基因激活ncRNA過(guò)表達(dá)，且與HBV、HCV和脂肪堆積等因素相關(guān)。與DNA、RNA或蛋白相互作用的ncRNA包括miRNA、小干擾RNA(siRNA)、小核RNA(snRNA)、長(zhǎng)鏈ncRNA (lncRNA)和環(huán)狀RNA (circRNA)等。脂肪細(xì)胞外囊泡外泌體攜帶脂質(zhì)、蛋白、核糖核酸和ncRNA等，傳遞生物學(xué)信息，維持胞間通訊，調(diào)節(jié)脂代謝。HCC細(xì)胞、免疫細(xì)胞和肝細(xì)胞分泌外泌體，在胞間轉(zhuǎn)運(yùn)DNA、mRNA、lncRNA、miRNA和蛋白等方面參與肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，相關(guān)調(diào)控機(jī)制仍是目前研究的新領(lǐng)域，高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄后ncRNA起關(guān)鍵的調(diào)控作用。

臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ncRNA具有調(diào)控作用。NAFLD患者血mir-29a低表達(dá)，其受試者工作曲線下面積(AUC)、敏感性和特異性分別為0.68、60.9%和82.4%，而mir-122高表達(dá)，其AUC、敏感性和特異性分別為0.83、75.0%和82.4%。在高脂(HF)或低脂(LF)喂養(yǎng)的C57Bl/6j小鼠，血清膽固醇、LDL和HDL、TG和ALT升高，肝腫大，肝組織脂肪變性、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和肝纖維化，約20% HF小鼠見(jiàn)癌變的特征。癌組織15種miRNAs差異表達(dá)，含NAFLD相關(guān)肝病未見(jiàn)的mir-340-5p、mir-484、mir-574-3p和mir-720異常。在肝損傷早期，mir-125a-5p下調(diào)，而mir-182上調(diào)。外泌體miR-122、miR-192、miR-27a-3p和miR-27b-3p異常。miR-122致膽固醇和脂肪酸升高，促進(jìn)肝纖維化，占肝組織miRNA的70%以上的miR-122是NAFLD或相關(guān)HCC診斷的有用標(biāo)志物。干預(yù)mir-223可下調(diào)CXCL10表達(dá)，抑制脂肪變性，可能成為治療NASH的靶點(diǎn)。

lncRNA是NAFLD重要的調(diào)控分子，比較NAFLD模型lncRNA和mRNA顯示，89個(gè)mRNA水平上調(diào)，177個(gè)下調(diào)，291個(gè)lncRNA下調(diào)，涉及花生四烯酸、晝夜節(jié)律、亞油酸、過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體(PPAR)信號(hào)途徑、鞘脂、類(lèi)固醇合成、色氨酸和酪氨酸代謝等。在NAFLD相關(guān)9個(gè)mRNA和8個(gè)lncRNA (FLRL)中，F(xiàn)LRL1、FLRL6和FLRL2分別調(diào)控晝夜節(jié)律，定位周期生物鐘3(PER3)、PER2和芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)(ARNTL)，而FLRL8、FLRL3和FLRL7分別與脂肪酸結(jié)合蛋白5、脂蛋白脂酶和脂肪酸去飽和酶2結(jié)合發(fā)揮作用，干擾FLRL2后ARNTL下調(diào)，推測(cè)可能與NAFLD發(fā)病機(jī)制有關(guān)。閉環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)狀RNA高度穩(wěn)定，而circ_0046366和circ_0046367缺失是NAFLD的特征。circ_0067934促進(jìn)HCC侵襲轉(zhuǎn)移，circMTO1抑制HCC進(jìn)展。環(huán)狀RNA與NAFLD分子機(jī)制仍在探討之中，期待高通量生物信息學(xué)分析能夠開(kāi)發(fā)診斷和治療的方法。

6 展望

NAFLD(或MAFLD)發(fā)病率逐年增長(zhǎng)，已是除HBV或HCV感染以外誘發(fā)HCC的主要致病因素，引起基礎(chǔ)和臨床研究的廣泛關(guān)注。隨著基因組、蛋白質(zhì)組、代謝組等系統(tǒng)組學(xué)的興起，伴隨脂質(zhì)(脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、固醇脂、孕烯醇酮脂、糖脂和多聚乙烯等)及其代謝產(chǎn)物、功能與代謝關(guān)鍵基因/蛋白/酶調(diào)控、代謝途徑和網(wǎng)絡(luò)信息等分析技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)現(xiàn)肝組織脂質(zhì)堆積、線粒體損傷、遺傳不穩(wěn)定、脂代謝受損、氧化應(yīng)激增加、炎癥與凋亡、纖維化和相關(guān)通路激活等協(xié)同作用，促進(jìn)了NAFLD/NASH相關(guān)的肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。然而，尚無(wú)法確定哪些NAFLD患者易發(fā)生HCC。篩選與發(fā)現(xiàn)監(jiān)測(cè)NASH向HCC轉(zhuǎn)變特異性標(biāo)志物仍在探索中。同時(shí)，免疫調(diào)節(jié)與NAFLD的關(guān)系也逐漸被重視，探討其發(fā)病機(jī)制，單獨(dú)或聯(lián)合抗纖維化、抗糖尿病、抗炎、抗生素/益生菌和降脂等綜合措施都有益于NAFLD/NASH的治療。然而，早期有效干預(yù)、預(yù)防或監(jiān)測(cè)肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化更至關(guān)重要。