牦牛發(fā)情期與妊娠期轉(zhuǎn)錄本及剪切事件研究

王進(jìn)娥，麻俊淵，陳舟，李書(shū)元，李洋，霍生東，楊艷梅，扎西英派

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

牦牛生活在青藏高原及其毗鄰的高山、亞高山地區(qū)，具有極強(qiáng)的高原適應(yīng)性和耐粗飼等特點(diǎn)，有“高原之舟”的美譽(yù)，是寶貴的遺傳基因庫(kù)［1］。發(fā)情季節(jié)主要集中在氣候溫暖、牧草豐盛的暖季（7 月～10月），發(fā)情周期為16～25 d，妊娠期為250～260 d，產(chǎn)犢期在每年的4～7 月份［2-3］。由于受光照、群體、氣溫、海拔、營(yíng)養(yǎng)、基因等影響，牦牛性成熟較慢，生殖能力低下。一頭成年牦牛的平均繁殖率僅為48.61%，其中超過(guò)一半為兩年一胎或三年兩胎［4］。一般情況下，雌性牦牛發(fā)情起止時(shí)間平均為36 h，變動(dòng)范圍為24～48 h［5］。妊娠期牦牛的卵巢通常不規(guī)則，卵巢表面出現(xiàn)妊娠黃體維持妊娠［6］。卵巢黃體從妊娠中期的36 個(gè)月開(kāi)始下降，但組織結(jié)構(gòu)仍相對(duì)緊密［7］。

牛津納米孔（nanopore）技術(shù)是基于納米孔單分子實(shí)時(shí)電信號(hào)的第三代測(cè)序技術(shù)，其原理是納米孔內(nèi)有共價(jià)結(jié)合的分子接頭，當(dāng)單個(gè)堿基或DNA分子通過(guò)納米孔通道時(shí)，會(huì)使電荷發(fā)生變化，從而短暫地影響流過(guò)納米孔的電流強(qiáng)度。由于化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異，A、C、G、T這4種不同堿基通過(guò)納米孔時(shí)會(huì)產(chǎn)生不同強(qiáng)度的電流，通過(guò)靈敏的電子設(shè)備可以檢測(cè)到電流變化，進(jìn)而可以識(shí)別DNA 鏈上的堿基完成測(cè)序［8］。自2012 年牦牛全基因組序列測(cè)定［9］，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在牦牛繁殖調(diào)控領(lǐng)域已經(jīng)取得了較多突破性的研究成果。蘭道亮等［10］基于RNA-Seq 技術(shù)對(duì)牦牛卵巢進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)：6321個(gè)新轉(zhuǎn)錄本，預(yù)測(cè)2267 個(gè)新轉(zhuǎn)錄本具有編碼蛋白能力，新轉(zhuǎn)錄本GO分類(lèi)注釋顯示與繁殖性狀相關(guān)的新轉(zhuǎn)錄本最多。為深入了解牦牛繁殖機(jī)能提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)；字向東等［11］為探明不同發(fā)育階段牦牛胚胎的轉(zhuǎn)錄組差異，對(duì)IVF 生產(chǎn)的牦牛2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞、桑椹胚和囊胚5 個(gè)發(fā)育階段的胚胎進(jìn)行RNA-Seq 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，比較分析發(fā)現(xiàn)：胚胎轉(zhuǎn)錄本中轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域可變剪接和轉(zhuǎn)錄結(jié)束區(qū)域可變剪接所占比例最大；蒲思穎等［12］利用RNA-seq 技術(shù)分析了囊胚玻璃化冷凍前后轉(zhuǎn)錄組變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在冷凍前后牦牛囊胚中分別檢測(cè)到9827 和13567 個(gè)轉(zhuǎn)錄本，這些研究揭示了牦牛胚胎細(xì)胞不同發(fā)育階段差異表達(dá)基因狀況，為牦牛發(fā)育分子調(diào)控機(jī)制及完善胚胎體外培養(yǎng)技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。然而，目前利用第三代測(cè)序技術(shù)對(duì)牦牛妊娠期方面尚未見(jiàn)研究成果，本研究填補(bǔ)了該技術(shù)在牦牛妊娠期的研究空白。

在牦牛的發(fā)情周期中，機(jī)體在發(fā)情期和妊娠期的調(diào)控是不同的，但都處于一個(gè)完整的發(fā)情周期內(nèi)，在時(shí)間進(jìn)程上是有聯(lián)系的，因此利用第三代測(cè)序技術(shù)，對(duì)牦牛發(fā)情期與妊娠期卵巢組織的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序和分析，揭示牦牛發(fā)情期與妊娠期卵巢組織差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本及發(fā)生的AS 和APA 的數(shù)量，獲得差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的功能、分類(lèi)和相關(guān)信號(hào)通路，對(duì)現(xiàn)有的牦?；蚪M和轉(zhuǎn)錄組注釋信息進(jìn)行完善，為開(kāi)展牦牛發(fā)情期與妊娠期相關(guān)基因的研究及分子調(diào)控機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

2019年9月，在青海省海鹽縣牧民牦牛群中（海拔約3 200 m）選取16 頭6 歲左右母牦牛，在自然放牧條件下每天早、晚2次跟群觀察母牦牛發(fā)情表現(xiàn)，每次3 h以上。每次跟群觀察期間，母牦牛會(huì)出現(xiàn)2次及以上試情公牛爬跨時(shí)呆立不動(dòng)的“靜立反射”發(fā)情現(xiàn)象。同時(shí)母牦牛小便頻繁，陰道流出的粘液較多，甚至有少量血液流出，有以上現(xiàn)象的牦牛確定處于發(fā)情期。以發(fā)情牦牛為對(duì)照組，直到2019 年10月，連續(xù)兩次直腸檢查后，卵巢表面不規(guī)則，一側(cè)有妊娠黃體出現(xiàn)，確定為妊娠期。選擇發(fā)情期和妊娠期牦牛各3頭，屠宰前精神、營(yíng)養(yǎng)狀況良好，經(jīng)臨床常規(guī)檢查，確認(rèn)沒(méi)有可見(jiàn)疾病，屠宰后，迅速取出2側(cè)卵巢，用生理鹽水清洗，且發(fā)情期與妊娠期3頭牦牛卵巢分開(kāi)標(biāo)記，并儲(chǔ)存在液氮中，送北京百邁克生物科技有限公司測(cè)序，公司將發(fā)情期與妊娠期每頭牦牛的2 側(cè)卵巢混合提取RNA，然后將每頭牦牛提取的RNA進(jìn)行單獨(dú)測(cè)序。

1.2 差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本（DET）篩選

在差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本檢測(cè)過(guò)程中，將發(fā)情期和妊娠期樣品轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行兩兩比較，通過(guò)對(duì)差異顯著性P值進(jìn)行校正獲得錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）。兩組樣品轉(zhuǎn)錄本表達(dá)差異倍數(shù)大于等于2（FC≥2），且FDR<0.01視為差異轉(zhuǎn)錄本篩選標(biāo)準(zhǔn)。篩選得到的差異轉(zhuǎn)錄本采用GO（gene ontology）和KEGG（kyoto encyclo-pedia of genes and genomes）進(jìn)行深入分析。

1.3 基因的AS分析

可變剪切（alternative splicing，AS）是指一個(gè)基因轉(zhuǎn)錄形成的前體mRNA（pre-mRNA）通過(guò)不同的剪切方式產(chǎn)生不同成熟mRNA 的過(guò)程［13］。AS的類(lèi)型主要包括可變轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)（alternative3’splicesite，A3），可變轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（alternative 5’splicesite，A5），外顯子跳躍（skipping exon，SE），內(nèi)含子保留（retained intron，RI），可變外顯子（mutually exclu?sive exons，MEE）。利用Astalavista 軟件鑒定牦牛發(fā)情期與妊娠期基因的AS 類(lèi)型，采用軟件默認(rèn)參數(shù)。

1.4 基因的可變多聚腺苷酸化分析

可變多聚腺苷酸化（alternative polyadenylation，APA）是指通過(guò)poly-A尾巴的AS，源于同一基因的不同轉(zhuǎn)錄本含有不同長(zhǎng)度的3’非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）。通過(guò)TAPIS pipeline 對(duì)牦牛發(fā)情期與妊娠期基因的APA位點(diǎn)進(jìn)行鑒定，采用默認(rèn)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異基因的鑒定

與發(fā)情期相比，妊娠期牦牛卵巢組織中共鑒定得到差異表達(dá)基因有1 636個(gè)，妊娠期較發(fā)情期上調(diào)基因有746個(gè)，下調(diào)基因有890個(gè)（圖1）。

圖1 牦牛妊娠期卵巢差異表達(dá)基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)Figure 1 Statistical result of the number of differentially expressed genes in the ovary of yak during pregnancy

2.2 差異轉(zhuǎn)錄本分析

與發(fā)情期相比，妊娠期牦牛卵巢組織中共鑒定得到差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本3 562個(gè)，妊娠期較發(fā)情期上調(diào)轉(zhuǎn)錄本有1 693個(gè)，下調(diào)轉(zhuǎn)錄本有1 896個(gè)（圖2）。

圖2 牦牛妊娠期卵巢差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本數(shù)目統(tǒng)計(jì)Figure 2 Statistical result of the number of differentially expressed transcripts in the ovaries of yaks during pregnancy

2.2.1 差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本GO 注釋及富集 根據(jù)比較分析牦牛發(fā)情期和妊娠期差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量，對(duì)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了GO注釋分析。注釋到GO 數(shù)據(jù)庫(kù)共有56 個(gè)功能條目，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本在生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分及分子功能三大類(lèi)中的較多GO類(lèi)別上均有注釋。在生物過(guò)程的分類(lèi)中共有21 個(gè)功能條目在GO類(lèi)別出現(xiàn)富集。注釋數(shù)量最多的是細(xì)胞過(guò)程（cellular process）、單一組織過(guò)程（single-organism process）和 生 物 調(diào) 節(jié)（biological regulation）。在牦牛繁殖方面，187 個(gè)DETs與繁殖、繁殖過(guò)程和節(jié)律過(guò)程有關(guān)。繁殖與繁殖過(guò)程均包括88個(gè)DETs，其中60個(gè)上調(diào)，28個(gè)下調(diào)；節(jié)律過(guò)程中有11個(gè)DETs，其中7個(gè)上調(diào)，4個(gè)下調(diào)（圖3-A）。在細(xì)胞組分（cellular component）分類(lèi)中共有18個(gè)功能條目在GO 類(lèi)別出現(xiàn)富集。主要集中于細(xì)胞（cell）、細(xì)胞組件（cell part）和細(xì)胞器（organelle）（圖3-B）；在分子功能（molecular function）分類(lèi)中共有17 個(gè)功能條目在GO類(lèi)別出現(xiàn)富集。有1419 個(gè)DETs與結(jié)合（binding）分子功能類(lèi)別相關(guān)，其中858 個(gè)上調(diào)，561 個(gè)下調(diào)；有774 個(gè)DETs 與催化活性（ catalytic activity）相關(guān)，其中450 個(gè)上調(diào)，324 個(gè)下調(diào)（圖3-C）。

圖3 牦牛發(fā)情期與妊娠期差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本GO注釋Figure 3 Go annotation of the transcript differentially expressed during estrus and pregnancy in yak

2.2.2 差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本KEGG 注釋及富集 由圖4 可知，在KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定到1 558 個(gè)DETs。在牦牛發(fā)情期和妊娠期卵巢中203 條通路注釋到KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)，主要與細(xì)胞過(guò)程、環(huán)境信息加工、遺傳信息處理、代謝和生物系統(tǒng)有關(guān)。其中代謝類(lèi)最多（11 個(gè)亞類(lèi)），其次是生物系統(tǒng)類(lèi)（10 個(gè)亞類(lèi)）。相比之下，與遺傳信息處理相關(guān)的較少（6個(gè)亞類(lèi)）。細(xì)胞過(guò)程類(lèi)包括4 個(gè)亞類(lèi)。此外，環(huán)境信息過(guò)程的3 個(gè)亞類(lèi)途徑相關(guān)。其中PI3K-Akt信號(hào)通路、細(xì)胞內(nèi)吞作用、剪切體和氧化磷酸化是關(guān)鍵通路（表1）。牦牛繁殖相關(guān)通路還有MAPK信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路（estrogen signaling pathway）、孕酮介導(dǎo)卵母細(xì) 胞 成 熟 （progesterone-mediated oocyte maturation）、細(xì)胞周期（cell cycle）、催產(chǎn)素信號(hào)通路（oxytocin signaling pathway）和卵母細(xì)胞減數(shù)分裂（oocyte meiosis）等。

表1 部分差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本富集KEGG通路Table 1 Section of enriched KEGG pathways of DETs

圖4 牦牛發(fā)情期與妊娠期差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本KEGG注釋圖Figure 4 KEGG annotation of the transcript differentially expressed during estrus and pregnancy in yak

2.3 牦牛發(fā)情期與妊娠期基因的AS數(shù)量及類(lèi)型

通過(guò)對(duì)牦牛發(fā)情期與妊娠期卵巢樣品進(jìn)行AS事件比較，在發(fā)情期中共鑒定到2 479次AS事件，包括1 214（48.97%）次SE，433（17.47%） 次A3，401（16.18%） 次RI，358（14.44%）次A5 和73（2.94%）次MEE（圖5-A）。在妊娠期中共鑒定到2 053 次AS事件，包括853（41.55%） 次SE，528（25.72%） 次RI，341（16.61%） 次A3，289（14.08%） 次A5 和42（2.04%） 次MEE。SE 為主要剪切類(lèi)型，MEE 為稀有剪切類(lèi)型（圖5-B）。

圖5 牦牛發(fā)情期與妊娠期AS事件類(lèi)型Figure 5 Pie chart of variable splice event types

2.4 牦牛發(fā)情期與妊娠期基因的APA位點(diǎn)數(shù)量及特征

牦牛發(fā)情期共鑒定到9 189 個(gè)基因含有1 個(gè)及以上的APA位點(diǎn)，其中1 個(gè)APA位點(diǎn)的基因數(shù)量最多，達(dá)到3 701（39.9%）個(gè)；2和3 個(gè)APA位點(diǎn)的基因數(shù)量次之，分別為1 873（20.33%）個(gè)和1 166（12.67%）個(gè)；另有1 218（13.25%） 個(gè)基因有5 個(gè)以上的APA位點(diǎn)（圖6-A）；牦牛妊娠期共鑒定到8 924個(gè)基因1個(gè)及以上的APA位點(diǎn)，其中1個(gè)APA位點(diǎn)的基因數(shù)量最多，達(dá)到3 908（43.73%）個(gè)；2 和3 個(gè)APA 位點(diǎn)的基因數(shù)量次之，分別為2 006（22.43%）個(gè)和1 077（12.03%）個(gè)；另有829（9.29%）個(gè)基因有5個(gè)以上的APA位點(diǎn)（圖6-B）。

圖6 牦牛發(fā)情期與妊娠期基因APA位點(diǎn)個(gè)數(shù)分布Figure 6 Number distribution of APA loci

3 討論

目前，基于第3 代測(cè)序技術(shù)AS 和APA 研究少且主要集中在人類(lèi)和少數(shù)模式物種［14］。對(duì)于牦牛發(fā)情期與妊娠期基因AS 和APA 的相關(guān)信息幾乎空白。本研究結(jié)果表明，牦牛發(fā)情期與妊娠期AS類(lèi)型均以SE 為主，其次為A3 和RI，MEE 最少。這與John Wiley等［15］研究結(jié)果AS事件中，植物中多以RI為主導(dǎo)，動(dòng)物中多以SE 占主導(dǎo)是一致的。本研究中，在牦牛發(fā)情期基因中鑒定到的AS 事件數(shù)量（2 479 次）多于妊娠期基因中的AS事件數(shù)量（2 053次），此外牦牛發(fā)情期基因中發(fā)生APA 的基因數(shù)量（9 189 個(gè)）稍多于妊娠期基因中發(fā)生APA的基因數(shù)量（8 924 個(gè)），說(shuō)明牦牛發(fā)情期中基因的AS和APA更為活躍。鑒定到的AS事件和APA位點(diǎn)信息可進(jìn)一步完善牦牛發(fā)情期和妊娠期基因組和轉(zhuǎn)錄組注釋信息，也為其他動(dòng)物的相關(guān)研究提供可參考信息。

3.1 周期節(jié)律與繁殖過(guò)程

在本研究中，GO 分析結(jié)果顯示，節(jié)律過(guò)程涉及由NRIP1 上調(diào)的DETs，由SOD 下調(diào)的DETs。核受體相互作用蛋白1（NRIP1），也稱(chēng)為受體相互作用蛋白140（RIP140），是通過(guò)與核受體、轉(zhuǎn)錄因子和其他輔助調(diào)節(jié)因子相互作用調(diào)節(jié)基因表達(dá)的關(guān)鍵因子［16］。RIP140 通過(guò)與RORS 的相互作用參與生物鐘基因的調(diào)節(jié)［17］。趙夢(mèng)靜等［18］發(fā)現(xiàn)肝臟RIP140 的晝夜節(jié)律性，RIP140上調(diào)Cyp2b10在小鼠和AML-12 細(xì)胞中的表達(dá)，并減弱其節(jié)律。超氧化物歧化酶（SOD）在體內(nèi)主要是清除超氧陰離子自由基。有研究發(fā)現(xiàn)，成年人24 h血漿SOD參數(shù)變化呈現(xiàn)明顯的近日節(jié)律特征，其峰值分別出現(xiàn)在晚上和下午［19］。這都進(jìn)一步為NRIP1、SOD分別參與牦牛發(fā)情期與妊娠期節(jié)律上調(diào)與下調(diào)提供了依據(jù)，但其調(diào)控機(jī)制尚未清楚，需進(jìn)一步探究。周期節(jié)律的變化對(duì)牦牛的繁殖過(guò)程有重要影響［20］。光照季節(jié)性變化決定動(dòng)物是否發(fā)情，由此將季節(jié)性繁殖動(dòng)物分為長(zhǎng)日照和短日照動(dòng)物［21］。光照周期的模式、光照周期變化的趨勢(shì)以及光照周期信號(hào)表達(dá)的節(jié)律的周期性都影響著動(dòng)物的繁殖活動(dòng)［22-23］。

3.2 激素與繁殖過(guò)程

牦牛是季節(jié)性繁殖動(dòng)物。發(fā)情季節(jié)主要集中在7月～10月［2］。本研究中，GO分析結(jié)果顯示，在生物過(guò)程組分中，繁殖與繁殖過(guò)程均有88 個(gè)DETs，其中60 個(gè)上調(diào)，28 個(gè)下調(diào)。熱休克蛋白（heat shock pro?tein，HSP）是ATP 依賴(lài)的高度保守的分子伴侶，能利用ATP水解產(chǎn)生的能量參與蛋白質(zhì)的正確折疊，從而在細(xì)胞周期運(yùn)行，細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等過(guò)程發(fā)揮重要作用。HSP90能與醛固酮、雄激素、雌激素和孕激素等類(lèi)固醇激素的受體結(jié)合，在促性腺激素活性的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，HSP90參與胚胎的發(fā)育過(guò)程，核移植時(shí)胚胎的低生存率與HSP90的低表達(dá)有關(guān)系，將HSP90基因?qū)氲胶艘浦才咛ブ锌商岣吲咛サ纳媛剩?4］。在本研究生殖過(guò)程中，HSP90基因上調(diào)，且牦牛妊娠期表達(dá)含量高于發(fā)情期，提示HSP90 上調(diào)可提高胚胎生存率。在KEGG 分析中，HSP90 在PI3K/Akt信號(hào)通路、孕酮介導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟和雌激素信號(hào)通路中上調(diào)，這與GO分析結(jié)果一致。HSP70首先是在胚胎發(fā)生中被鑒定且起負(fù)調(diào)節(jié)維持激素-受體的平衡。有研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)量的HSP70對(duì)胚胎發(fā)生產(chǎn)生不利影響。據(jù)報(bào)道妊娠早期外周血淋巴細(xì)胞中HSP70 的細(xì)胞內(nèi)濃度與自然流產(chǎn)或胎兒死亡等不良妊娠結(jié)局直接相關(guān)［25］。本研究中HSP70在雌激素信號(hào)通路中下調(diào)，表明有利于維持妊娠。P38在MAPK信號(hào)通路中上調(diào)，p38MAPK的磷酸化現(xiàn)象存在于大多數(shù)哺乳動(dòng)物的整個(gè)妊娠階段，且隨著妊娠的進(jìn)展這種現(xiàn)象逐漸加強(qiáng)［26］。PI3K/Akt 信號(hào)通路成分和一些下游效應(yīng)分子存在于卵泡中，在形成、生長(zhǎng)、排卵和黃體化過(guò)程中發(fā)生變化［27］。cAMP可以抑制卵母細(xì)胞囊泡破裂（oocyte vesicle rupture，GVBD）的發(fā)生，維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的停止，而維持減數(shù)分裂停止所需要的cAMP 是由卵母細(xì)胞自身產(chǎn)生的［28］。Cdc2 在孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中上調(diào)。細(xì)胞分裂周期基因（cell division cycle，cdc基因）控制著細(xì)胞周期的啟動(dòng)及各時(shí)相的轉(zhuǎn)換，其中以Cdc2 基因最重要，該基因是唯一在兩個(gè)控制點(diǎn)Gl→S、G2→M 均起作用的cdc 基因［29］。P34Cdc2激酶的活化是細(xì)胞分裂的增殖信號(hào)，它具有啟動(dòng)DNA復(fù)制和誘發(fā)有絲分裂的雙重作用，在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中起重要作用［29］。

3.3 氧化磷酸化與牦牛繁殖過(guò)程

氧化磷酸化是線粒體中的物質(zhì)在氧化時(shí)釋放能量供給ADP 和無(wú)機(jī)磷合成ATP 的偶聯(lián)反應(yīng)，是機(jī)體重要的能量代謝途徑。本研究氧化磷酸化通路中的多個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，主要集中在NADH脫氫酶亞基 家 族 成 員（NADH，ND1，ND2，ND5，ND6，Ndufa7，Ndufb2，Ndufb5）和細(xì)胞色素c 氧化酶家族成員（cytochrome c oxidase，COX1，COX2，COX3，COX7A）。目前這些基因家族在牦牛發(fā)情期與妊娠期卵母細(xì)胞發(fā)育成熟過(guò)程中的相關(guān)作用未見(jiàn)報(bào)道，這些基因家族均為線粒體氧化磷酸化通路中的關(guān)鍵基因，本身發(fā)揮能量代謝作用，這些基因在氧化磷酸化通路中的下調(diào)，推測(cè)其功能可能與降低相關(guān)能量代謝，阻止進(jìn)一步發(fā)育，維持發(fā)情期的分裂阻滯狀態(tài)，同時(shí)減小氧化磷酸化供能反應(yīng)給細(xì)胞帶來(lái)的氧化損傷起作用。

3.4 AS事件與牦牛卵巢發(fā)育

KEGG 通路分析還發(fā)現(xiàn)，剪接體通路富集程度較高，進(jìn)一步證明了牦牛發(fā)情期與妊娠期轉(zhuǎn)錄本發(fā)生了大量AS 事件。在剪接體通路中表達(dá)上調(diào)最為顯著的DETs 是mRNA 前體剪接因子（pre-mRNA processing factor，Prp）19 和43 為 代 表 的 大 部 分mRNA 前體剪接因子。李昂等［30］研究發(fā)現(xiàn)，Prp19對(duì)HeLa 等細(xì)胞產(chǎn)生不良反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，并會(huì)激活前體RNA 剪接體，因而出現(xiàn)DNA 損傷效應(yīng)。Prp43 及其輔助因子突變抑制剪接體激活缺陷的剪接因子突變，通過(guò)影響一些基因的表達(dá)，間接使其內(nèi)含子剪切效率降低，引起DNA 突變［31］，內(nèi)含子剪切效率的降低，使得mRNA 降解，蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低，從而影響蛋白質(zhì)的功能。所以，從牦牛發(fā)情期與妊娠期檢測(cè)出大量AS 事件，以及通過(guò)KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)剪接體通路的顯著富集，這些結(jié)果都表明，牦牛在發(fā)情與妊娠期間發(fā)生了大量AS事件，而一些Prp的上調(diào)可能會(huì)對(duì)卵巢發(fā)育產(chǎn)生不利影響。

4 結(jié)論

綜上所述，基于第3代測(cè)序技術(shù)對(duì)牦牛發(fā)情期與妊娠期卵巢組織的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序和分析，揭示出牦牛不同生理狀態(tài)下卵巢組織差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量，獲得了差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的功能、分類(lèi)和相關(guān)信號(hào)通路。為豐富牦牛卵巢組織轉(zhuǎn)錄組信息，展牦牛發(fā)情期與妊娠期相關(guān)基因的研究及分子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。