基于ITS2 序列及二級結(jié)構(gòu)對連錢草與其地方習(xí)用品及易混品的鑒別研究

鄭夢迪，張 彥，張 寒，汪興軍

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

根據(jù)2020 年版《中國藥典》（一部）規(guī)定，唇形科植物活血丹Glechoma longituba（Nakai）Kupr 為中藥連錢草Glechomae Herba 的唯一正品基原[1]，用藥部位是其干燥的地上部分，是我國民間常用中藥[2-3]。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為連錢草具有利濕通淋、清熱解毒、散瘀消腫之功。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，連錢草具有降糖、降脂溶石、利尿利膽、活血消腫等藥用價值[4-7]。植物活血丹在不同地區(qū)別名眾多，如：連錢草、破銅錢、遍地金錢、金錢草、透骨消、銅錢草、遍地香等[2]。另外，中藥材連錢草作為藥材使用由來已久，但由于同物異名、同名異物和地方習(xí)用品混淆現(xiàn)象復(fù)雜，造成在臨床上連錢草的基原混亂?！斑B錢草”名最早出現(xiàn)在《唐本草》中“積雪草”的注文，“葉圓如錢，有蔓延地”引自本草《徐儀藥圖》，所載“積雪草”泛指傘形科積雪草屬植物，并非植物活血丹[8]。另活血丹在華東地區(qū)多以“金錢草”冠名[2]，而藥材金錢草Lysimachiae Herba 的正品基原是報春花科植物過路黃Lysimachia christinaeHance 的干燥全草，具有利濕退黃、利尿通淋、解毒消腫的功效[1]；民間用藥也常有將活血丹與金錢草相混淆的現(xiàn)象[9]。此外由于同名異物現(xiàn)象和地方俗稱差異，豆科植物金錢草Desmodium styracifoliumMerr.、玄參科植物羊膜草Hemiphragma heterophyllumWall.、毛茛科植物盾葉唐松草Thalictrum ichangenseLecoy.ex Oliv.、唇形科植物寶蓋草Lamium amplexicauleL.、傘形科植物積雪草Centella asiatica（L.）Urban.及天胡荽Hydrocotle sibthorpioiedsLam.等，也常與活血丹混淆[10]。

上述植物品種間性狀多有相似，且中藥材幾乎都需要經(jīng)過炮制才可作為飲片銷售，加工過后鑒別特征常常消失，且易受采收時間和環(huán)境因素等影響，為傳統(tǒng)的鑒定方法帶來了極大的挑戰(zhàn)。隨著中藥材貿(mào)易流通的便捷，不同省份的藥材品種流通增多。不同“連錢草”或“金錢草”基原物種的主要活性成分和含量均有一定的差異，若不做區(qū)分應(yīng)用，對臨床用藥的安全性和有效性具有一定的隱患。因此，亟需開發(fā)一種能夠快速準(zhǔn)確鑒別藥用正品、地方習(xí)用品及其常見混淆品的技術(shù)。而DNA 條形碼技術(shù)具有簡便、微量、特異性強(qiáng)的特點，為活血丹及其地方習(xí)用品的鑒別提供了新的方法和思路[11-13]。近年來基于ITS2 基因條形碼可迅速準(zhǔn)確對多種植物進(jìn)行物種鑒定，驗證了其條形碼的適用性和穩(wěn)定性[14-16]。ITS2 rDNA 的二級結(jié)構(gòu)是由ITS 一級結(jié)構(gòu)自身回折而形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)[17]，ITS2 二級結(jié)構(gòu)對RNA 的功能具有重要影響，既包含系統(tǒng)發(fā)育信息，又可以避免或排除旁系同源或假基因?qū)τ谙到y(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建的誤導(dǎo)。在物種鑒定研究時，ITS2 二級結(jié)構(gòu)信息是對一級結(jié)構(gòu)的有效補充[18-19]。本研究基于ITS2 的一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)對活血丹及其易混淆品種進(jìn)行分子鑒別，旨在探討DNA 條形碼在中藥材連錢草與其地方習(xí)用品及易混品鑒別中的應(yīng)用，為連錢草正品與易混品的鑒別提供準(zhǔn)確有效的標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究材料來源見表 1，包括植物樣本和GenBank中的ITS2 序列，本研究包含活血丹、金錢草、盾葉唐松草、羊膜草、寶蓋草、積雪草、過路黃和天胡荽，共8 個物種的51 條ITS 序列。其中，活血丹9 個植物樣本、4 條GenBank 序列，共13 條序列；金錢草、盾葉唐松草、羊膜草、寶蓋草、積雪草、過路黃、天胡荽分別為：6、6、6、6、7、4、3 條序列。實驗樣本由西安醫(yī)學(xué)院生藥教研室張彥副教授鑒定，樣本保存于藥學(xué)綜合實驗室-80℃冰箱。

表1 本研究中活血丹及其易混品的樣本及GenBank 數(shù)據(jù)庫中ITS2 序列信息Tab.1 Samples and ITS2 GenBank sequences included in this study among Glechoma longituba and its adulterants

1.2 基因組總DNA 的提取

取經(jīng)干燥處理的植物葉片約2 g，在液氮環(huán)境中快速研磨成粉狀，使用高效植物基因組DNA 提取試劑盒DP350-02 提取總DNA，按說明書進(jìn)行操作。

1.3 PCR 體系的建立與測序

擴(kuò)增ITS2 序列的引物：ITS2F: 5’-ATCGATGCG ATACTTGGTGTGAAT-3’、ITS3R：5’-ATCGGACG CTTCTCCAGACTACAAT-3’。PCR 反應(yīng)按25 μL 擴(kuò)增體系進(jìn)行：2 × Taq PCR Mix 12.5 μL，通用引物ITS2F 和ITS3R 均選用濃度10 μmol/L 各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增程序為：94 ℃變性2 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40 個循環(huán)；72 ℃延伸2 min；16 ℃ forever。PCR 產(chǎn)物送往西安擎科創(chuàng)新生物科技有限公司進(jìn)行Sanger雙向測序。

1.4 ITS2 序列的獲得和比對

采用CodonCode Aligner V 3.0.1（CodonCode Co.，USA）軟件校對拼接測序后所得序列峰圖[20]；另外，從GenBank 下載8 個分類群，即活血丹、金錢草、盾葉唐松草、羊膜草、寶蓋草、積雪草、過路黃和天胡荽的ITS 序列，并利用其Blast 功能排除可疑序列。而后應(yīng)用ITS2 Database（http://its2.bioapps.Biozen trum.uni-wuerzburg.de/）基于隱馬爾可夫模型HMMer[21]注釋方法分析并去除兩端5.8S 和28S rDNA 區(qū)段，獲得ITS2 片段。利用ClustalW 軟件比對所有ITS2 序列。利用ITS2 Database 預(yù)測獲得各物種的ITS2 二級結(jié)構(gòu)。

1.5 遺傳距離計算和一級結(jié)構(gòu)進(jìn)化樹構(gòu)建

采用MEGA7 軟件[22]分析比對所有ITS2 序列，基于K2P（Kimura 2-parameter）算法計算種內(nèi)、種間遺傳距離，構(gòu)建NJ 聚類樹，Bootstrap 1 000 次重復(fù)檢驗分支系統(tǒng)發(fā)育的可靠性。統(tǒng)計GC 含量、變異位點和簡約信息位點等特征信息。

1.6 一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用ITS2 Database[23]獲得核酸序列和二級結(jié)構(gòu)的聯(lián)合矩陣，將所有樣本的聯(lián)合矩陣輸入4Sale 軟件[24]中進(jìn)行比對，將比對好的結(jié)果導(dǎo)入ProfDIstS 軟件[25]構(gòu)建剖面鄰接PNJ（Profile neighbor joining）系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap1 000 次檢驗各分支置信度。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴(kuò)增效率及測序成功率

對植物樣本（活血丹）的 ITS2 序列分析發(fā)現(xiàn)，PCR 擴(kuò)增及測序成功率均為100%，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳得到PCR 擴(kuò)增電泳圖，擴(kuò)增效果較好，條帶較亮，沒有拖尾現(xiàn)象。擴(kuò)增序列長度范圍在300 ～500 bp，見圖 1。

圖1 ITS2 序列的電泳圖譜Fig.1 Electrophoretogram of ITS2 sequences of samples

2.2 ITS2 序列特征及差異

本研究對活血丹及其易混品種的ITS2 序列特征進(jìn)行分析，見表2。實驗中51 條序列的ITS2 序列長度為213 ～ 237 bp，GC 含量為57.36% ～ 73.1%。MEGA7.0 多重序列比對后序列長254 bp。12 個活血丹樣本的ITS2 序列長度為213 bp，GC 含量為67.6%，種內(nèi)無變異位點。7 個積雪草樣本的ITS2 序列長234 bp，種內(nèi)存在2 個變異位點，GC 含量為71.7%，種內(nèi)存在1 個簡約信息位點。6 個盾葉唐松草樣本種內(nèi)存在4 個變異位點。6 個羊膜草和6 個樣本寶蓋草種內(nèi)變異位點分別為3 個和1 個，簡約信息位點均為1 個。過路黃、金錢草和天胡荽序列GC 含量分別為57.6%、57.8%和63.6%，種內(nèi)變異位點個數(shù)分比為3 個、0 個和1 個。

表2 活血丹及其易混淆品的ITS2 序列特性Tab.2 ITS2 sequences characteristics of Glechoma longituba and its adulterants

2.3 種內(nèi)和種間K2P 遺傳距離分析

本實驗通過MEGA7 軟件，基于K2P 模型分析各樣本的種內(nèi)種間遺傳距離，見表3。所有樣本種內(nèi)遺傳距離0 ～ 0.017，活血丹種內(nèi)遺傳距離0，過路黃種內(nèi)遺傳距離最大為0.017，活血丹、盾葉唐松草、羊膜草、寶蓋草、積雪草、過路黃、金錢草、天胡荽的種內(nèi)平均遺傳距離分別是0.000、0.004、0.005、0.003、0.005、0.009、0.000、0.004?；钛づc盾葉唐松草、羊膜草、寶蓋草、積雪草、過路黃、金錢草、天胡荽的種間遺傳距離分別是0.522、0.315、0.269、0.377、0.527、0.758、0.499。種間最小遺傳距離是活血丹和羊膜草0.315。種間最小距離（0.315）大于種內(nèi)最大遺傳距離（0.017），不同種植物之間存在一個明顯的“Barcoding Gap”。因此ITS2 一級序列可以區(qū)分開藥材連錢草正品和其它易混品種。

表3 本研究中樣本種內(nèi)和種間遺傳距離Tab.3 Genetic distances of all samples

2.4 聚類分析

基于ITS2 序列（一級結(jié)構(gòu)）和基于ITS2 一級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)聯(lián)合矩陣，分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，所得拓?fù)潢P(guān)系基本一致?；贗TS2序列構(gòu)建的NJ鄰接樹，見圖2A，活血丹、盾葉唐松草、羊膜草、寶蓋草、積雪草、過路黃、金錢草、天胡荽分別聚為一支，自展支持率均達(dá)99%，8 種植物可明顯區(qū)分開?；贗TS2一級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)聯(lián)合矩陣所構(gòu)建的PNJ 進(jìn)化樹所得分支拓?fù)浣Y(jié)果與NJ 樹一致，即各物種各自聚為一個分支，呈現(xiàn)出良好的單系性，而且末端分支分類水平的準(zhǔn)確率有所提高，見圖2B。因此，二級結(jié)構(gòu)信息位點的加入可以對一級信息進(jìn)行補充和驗證。

圖2 所有分類群的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of all taxa

2.5 ITS2 二級結(jié)構(gòu)分析

活血丹及其易混品種植物的ITS2 二級結(jié)構(gòu)，見圖3。所有物種ITS2 二級結(jié)構(gòu)均呈“一環(huán)四臂”形態(tài)，其中，臂III 最長；但同時，各種間ITS2 二級結(jié)構(gòu)均有較大差異，差異主要體現(xiàn)在主環(huán)大小、旋臂長度、旋臂間夾角、莖環(huán)數(shù)目大小及位置等方面?；钛ぐ? 個內(nèi)環(huán)、1 個多分支環(huán)、4 個發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)；與其關(guān)系最近的羊膜草在臂I 和臂IV 之間有一段單鏈結(jié)構(gòu)，中間的主環(huán)相對較大且富含嘌呤，共有5 個內(nèi)環(huán)、1 個多分支環(huán)和4 個發(fā)卡環(huán)。寶蓋草、盾葉唐松草、過路黃、天胡荽的臂I 和臂IV 之間均有單鏈結(jié)構(gòu)但大小不同、臂的長度和位置及環(huán)的數(shù)量各有差異。金錢草的主環(huán)最大，而臂IV 的長度明顯小于積雪草，且內(nèi)環(huán)的數(shù)量、位置及臂的夾角均不同。因此，通過ITS2 二級結(jié)構(gòu)的分子形態(tài)差異也可以準(zhǔn)確地鑒別連錢草與其易混品種。

圖3 所有分類群的ITS2 二級結(jié)構(gòu)圖Fig.3 ITS2 secondary structure of all taxa

3 討論

連錢草在我國用藥歷史悠久，但作為一種典型的同名異物藥材，其基原的品種混淆現(xiàn)象長期存在。傳統(tǒng)的以植物表型為基礎(chǔ)的鑒別方法受到多因素的影響，且對鑒定者的植物學(xué)知識及實踐工作經(jīng)驗要求高，獲得的結(jié)果容易引起爭議。而DNA 條形碼技術(shù)不依賴于中藥材基原的表型特征，ITS2 是藥用植物鑒定中常用的DNA 條形碼之一，對屬以下級別同樣具有較高的鑒定效率[13]。因此，本研究比較了藥材連錢草的正品基原——活血丹與其常見易混品的K2P 遺傳距離，結(jié)果顯示：活血丹與金錢草這兩種植物常被當(dāng)做藥材金錢草在華東地區(qū)使用，二者種間遺傳距離最大，其次分別是過路黃、盾葉唐松草、天胡荽、積雪草、羊膜草，與寶蓋草的種間遺傳距離最??；寶蓋草與活血丹同屬于唇形科植物，因此二者遺傳距離最相近與植物的分類相符。由ITS2一級序列構(gòu)建的NJ 樹，可以觀察到不同物種均獨立分支，呈現(xiàn)出良好的單系性，即ITS2 一級序列可將連錢草與本研究中的易混品區(qū)分開。在細(xì)胞中，ITS2 一級序列經(jīng)過折疊形成二級結(jié)構(gòu)后才具備生物學(xué)功能，在參與生命過程中發(fā)揮重要作用，其二級結(jié)構(gòu)若發(fā)生變化，將直接影響核糖體轉(zhuǎn)錄過程[26]。大量研究表明，盡管ITS2 的一級核酸序列變化迅速，但其二級結(jié)構(gòu)在整個真核生物群中高度保守[27]。二級結(jié)構(gòu)有助于指導(dǎo)一級核酸序列的比對，并在本研究中起到校正作用。因此，本研究在ITS2 核酸序列的基礎(chǔ)上，對活血丹及其混淆品種的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測，并且構(gòu)建了ITS2 一級序列和二級結(jié)構(gòu)聯(lián)合矩陣的PNJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，活血丹與其混淆品種的ITS2 二級結(jié)構(gòu)在旋臂長度、旋臂間夾角、頸環(huán)大小、數(shù)目和位置等方面存在較大差異；此外，ITS2 一級序列和二級結(jié)構(gòu)聯(lián)合矩陣構(gòu)建的PNJ 發(fā)育樹展示出各物種的拓?fù)潢P(guān)系與NJ 樹一致，并且各分支的支持率進(jìn)一步提高。

4 結(jié)論

本研究從分子水平探討了中藥連錢草與其易混淆品及地方習(xí)用品的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，表明ITS2 可用于準(zhǔn)確快速鑒別中藥材連錢草與其地方習(xí)用品及易混淆品種，為連錢草用藥的準(zhǔn)確性和有效性提供了一定保障，為連錢草藥材市場的規(guī)范化提供了參考。同時也為連錢草的科學(xué)研究、藥品研發(fā)和健康產(chǎn)品開發(fā)等提供了一定參考依據(jù)；并從DNA 水平探索不同品種的親緣關(guān)系，從而為發(fā)現(xiàn)可以替代連錢草的植物資源提供了新思路和方法，為擴(kuò)大藥源和選育新品種等方面的研究提供了理論依據(jù)。