蒙藥植物耬斗菜總生物堿的提取與鑒定

寶彩虹，敖恩寶力格

（內(nèi)蒙古師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010022）

耬斗菜（Aquilegia viridifloraPall）為毛茛科耬斗菜屬植物，生長(zhǎng)于海拔200～2 000 m 的山地或潮濕草地。在我國(guó)主要分布于華北、東北及陜西、寧夏、甘肅、內(nèi)蒙古和青海等地［1］。耬斗菜全草入藥，中藥里主要作用為調(diào)經(jīng)止血、清熱解毒，用于治療月經(jīng)不調(diào)、功能性子宮出血、痢疾、腹痛等［2］；作蒙藥用的時(shí)候能調(diào)經(jīng)、治傷、燥“協(xié)日烏素”、止痛，主治婦科疾病、死胎、胎衣不下、骨折等［3］。耬斗菜屬植物主要有效成分為生物堿類(lèi)化合物，有木蘭花堿、紫堇塊莖堿及黃連堿等［4］。耬斗菜生物堿具有抗菌、抗病毒和抗腫瘤等作用［5-6］。本研究提取耬斗菜的總生物堿，并對(duì)其進(jìn)行定性檢測(cè)與結(jié)構(gòu)鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器設(shè)備

耬斗菜采摘于內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市大青山小井溝（111°50'34″E，40°58'34″N）。采摘全草后清洗晾干，用植物組織粉碎機(jī)破碎，過(guò)100 目的篩子，用PEP 膜密封包裝后低溫保存。

鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于中國(guó)生物檢定所；碘化泌鉀試劑、改良碘化泌鉀試劑、硅鎢酸試劑、Frobde 試劑、溴甲酚綠、碘化泌鉀、硅鎢酸、鉬酸銨、溴甲酚綠、冰乙酸、濃硫酸、乙醇、乙酸乙酯、濃鹽酸、三氯甲烷等試劑均購(gòu)于南京建成生物有限公司。主要儀器設(shè)備有TQ0804 CG-MS（島津有限責(zé)任公司）、超聲波破碎器（上海冠特超聲儀器有限公司）、UV-2000 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美析儀器有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）等。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

稱(chēng)取5.0 mg 鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容至50 mL 得到原溶液，分別吸取1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、7 mL、9mL 原溶液于試管中，分別用甲醇稀釋至10.0 mL，以甲醇為空白對(duì)照測(cè)定408 nm 處的吸光值，以鹽酸小檗堿濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算回歸方程。

1.3 總生物堿的提取方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取耬斗菜干粉100 g 浸泡在2 500 mL 80% 的乙醇中，浸提24 h 后超聲波提取2 h，振幅為80 Hz，脈沖為20 s。過(guò)濾收集濾液，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得乙醇浸膏，用10 mL 1% 的鹽酸進(jìn)行溶解后再過(guò)濾，收集濾液，用濃氨水調(diào)pH 至9～10，用3 倍體積的氯仿進(jìn)行3 次萃取，合并氯仿層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用10 mL 的乙酸乙酯溶解，測(cè)定410 nm 處的吸光度，代入回歸方程，計(jì)算總生物堿含量。

1.4 生物堿的定性檢測(cè)方法

取4 支試管，加入耬斗菜乙醇提取液各3 mL，依次滴加改良碘化鉍鉀試劑、硅鎢酸試劑、溴甲酚綠試劑和Frobde 試劑各6 mL，搖勻靜置觀(guān)察，同時(shí)做3 個(gè)平行樣。

1.5 生物堿的結(jié)構(gòu)鑒定方法

采用CG-MS 對(duì)耬斗菜生物堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定［7-8］。GC-MS 檢測(cè)條件為：進(jìn)樣口溫度270 ℃；分流比為50∶1；初始溫度120 ℃保留2 min，以20 ℃/min 升溫至280 ℃保持15 min；柱流量為1.8 mL/min 不分流方式進(jìn)樣；離子源溫度為230 ℃；傳輸線(xiàn)溫度為280 ℃；EI 源電離方式；電子能量為70 eV；電子倍增氣電壓為1800 V。

2 結(jié)果

2.1 生物堿的含量及定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以鹽酸小檗堿濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（如圖1），得到回歸方程：y=9.932 8x-0.005 9，R2=0.998 8。根據(jù)回歸方程計(jì)算出總生物堿濃度為0.124 mg/mL，1 g 耬斗菜干粉中的總生物堿含量為0.155 mg，提取率為0.016%。

圖1 鹽酸小檗堿吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Absorbance standard curve of berberine hydrochloride

生物堿定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1 所示。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，耬斗菜提取液對(duì)生物堿定性試劑均有沉淀反應(yīng)。因此，可以確定耬斗菜乙醇提取液含有生物堿類(lèi)化合物。

表1 耬斗菜總生物堿提取液的定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Qualitative testing results of alkaloid extraction liquid

2.2 生物堿的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

通過(guò)CG-MS 鑒定出2 種希夫堿類(lèi)化合物，均首次從耬斗菜中發(fā)現(xiàn)。分別為酰腙類(lèi)希夫堿2，6-二甲氧基苯甲醛氨甲酰腙（化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖2 所示）和酰肼類(lèi)希夫堿2-（3-對(duì)氯苯氧）N-（2，4-二甲氧基芐叉）乙酰肼（化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖3 所示）。

圖2 2，6-二甲氧基苯甲醛氨甲酰腙Fig.2 2，6-Dimethoxybenzaldehyde carbamoylhydrazone

圖3 2-（3-對(duì)氯苯氧）-N'-（2，4-二甲氧基芐叉）乙酰肼Fig.3 2-（3-Chlorophenoxy）-N'-（2，4-dimethoxybenzylidene）acethydrazide

3 結(jié)論

在酸性條件下生物堿會(huì)解離成為離子，與生物堿沉淀劑發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，生成復(fù)鹽或絡(luò)鹽。沉淀反應(yīng)可適用于鑒別生物堿。因生物堿對(duì)各種生物堿沉淀劑的靈敏度不一樣，每種生物堿的鑒別都需要3 種或3 種以上的沉淀劑［9］。本研究發(fā)現(xiàn)耬斗菜總生物堿提取液對(duì)4 種生物堿定性試劑均有陽(yáng)性反應(yīng)，可以確定耬斗菜乙醇提取液含有生物堿類(lèi)化合物。本實(shí)驗(yàn)條件下，耬斗菜生物堿含量為0.155 mg/g，提取率為0.016%。通過(guò)CG-MS 首次鑒定出兩種希夫堿類(lèi)化合物，分別是酰腙類(lèi)希夫堿2，6-二甲氧基苯甲醛氨甲酰腙和酰肼類(lèi)希夫堿2-（3-對(duì)氯苯氧）N-（2，4-二甲氧基芐叉）乙酰肼。根據(jù)相關(guān)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，從耬斗菜提取分離得到的兩種希夫堿都具有良好的生物活性［4，6］。席夫堿及其配合物具有抑菌、殺菌、抗病毒、抗腫瘤、消除自由基等獨(dú)特藥用價(jià)值［10-12］，其中很多酰腙類(lèi)希夫堿具有很好的生物活性，在醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域有著潛在應(yīng)用性能［10］。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為耬斗菜有效成分的研究及開(kāi)發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。