數(shù)字PCR及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在新冠核酸檢測中的應(yīng)用

許婷 龔建江

【摘要】目的：探究新冠核酸采用數(shù)字PCR與實(shí)時(shí)熒光定量的PCR技術(shù)的檢測效果。方法：對(duì)本院2020年6月-2020年8月3例新冠肺炎（COVID-19）患者20份標(biāo)本進(jìn)行核算檢測研究，分別采用數(shù)字PCR與實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)N基因與ORF1ab基因進(jìn)行檢測。結(jié)果：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果：N基因均呈陽性;有14例ORF1ab基因呈陽性、6例呈陰性，提示N基因檢測呈單陽。以兩種基因Ct值分別為30.38、30.80（P=0.973）。數(shù)字PCR檢測結(jié)果：N基因與ORF1ab基因平均濃度為943016 copies/m L、1143730 copies/m L（P=0.553）;但采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的2份樣本數(shù)字中，通過數(shù)字PCR可檢出。結(jié)論：本文研究的兩種檢測方法在COVID-19患者中具有較高的一致性，其數(shù)字PCR準(zhǔn)確度更高，是實(shí)時(shí)熒光定量的PCR檢測的有效補(bǔ)充。

【關(guān)鍵詞】COVID-19;核酸;數(shù)字PCR;實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）主要是因新型冠狀病毒感染所致，咳嗽、發(fā)熱、呼吸困難及外周白細(xì)胞記數(shù)低下或正常和淋巴計(jì)數(shù)低下等臨床典型癥狀，感染率較高，尤其是今年出現(xiàn)病毒變異傳播速度更快，嚴(yán)重威脅患者生命安全。臨床主要采用新型冠狀病毒的核酸檢測，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測時(shí)間短、靈敏度高，但隨著檢測樣本濃度降低，極易出現(xiàn)假陰性或弱陽性。數(shù)字PCR是一種新型核算定量檢測技術(shù)，可確保擴(kuò)增體系的有效分配，得到精確濃度。本文深入分析新冠核酸采用數(shù)字PCR與實(shí)時(shí)熒光定量的PCR技術(shù)的檢測效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

一般資料

對(duì)本院2020年6月-2020年8月3例新冠肺炎（COVID-19）患者20份標(biāo)本進(jìn)行核算檢測研究，尿液、糞便、血液標(biāo)本分別為6、7、7份，男2例，女1例;年齡32-70歲，平均（51.15±10.21）歲。

方法

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測：采用QIAcuity? One數(shù)字PCR儀（QIAGEN公司）提取本研究患者200μL檢驗(yàn)標(biāo)本，根據(jù)試劑盒說明書完成檢驗(yàn)。陽性判定：Ct值≤38。同時(shí)確保對(duì)N基因與ORF1ab基因陽性Ct值為等值（25.62），并進(jìn)行判讀。數(shù)字PCR檢測：采用Lightcycler 480 II實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Roche公司），根據(jù)試劑盒說明實(shí)施檢測。標(biāo)本濃度=反應(yīng)體系濃度（copies/μL）×40×1000/12。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0計(jì)算，利用SPSS23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)和線性回歸分析，若P<0.05，則兩組數(shù)據(jù)有差異。

2 結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果：檢測發(fā)現(xiàn)，N基因均呈陽性;有14份ORF1ab基因呈陽性、6份呈陰性，提示N基因檢測呈單陽。兩種基因Ct值分別為30.38、30.80（P=0.973）。但ORF1ab基因Ct值大于32的7份樣本中，N基因Ct值更?。≒<0.001）。

數(shù)字PCR檢測結(jié)果：檢測發(fā)現(xiàn)，N基因與ORF1ab基因平均濃度為943016 copies/m L、1143730 copies/m L（P=0.553）;但采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的2份樣本數(shù)字中，通過數(shù)字PCR可檢出。

3 討論

目前，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是檢驗(yàn)COVID-19的重要技術(shù)，但對(duì)技術(shù)要求較高，且試劑不同，檢測靈敏性也有較大區(qū)別。患者在發(fā)病初期，病毒濃度呈降低趨勢，極易出現(xiàn)假陰性。數(shù)字PCR主要采用了微流體技術(shù)，敏感性相對(duì)較高，檢測范圍較廣。本研究發(fā)現(xiàn)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測時(shí)，若ORF1ab基因Ct>32，且濃度較低的樣本，ORF1ab基因較N基因Ct值大，可能是與N基因含量相對(duì)較高相關(guān)。同時(shí)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 2份樣本N基因Ct值分別為37.57、37.92，與陽性判斷值較為接近，ORF1ab基因?yàn)殛幮?。表明若病毒載量較低時(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù)很難檢測。本研究中采用的兩種檢測方法中，數(shù)字PCR的N基因、ORF1ab基因濃度值與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的2個(gè)基因Ct值密切相關(guān)，提示兩種檢測方法具有較高的一致性，其中數(shù)字PCR方法檢測有更為準(zhǔn)確的N基因、ORF1ab基因濃度值，可見在低拷貝數(shù)SARS-Co V-2核酸檢測時(shí)，數(shù)字PCR價(jià)值更高。

綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)數(shù)字PCR方法檢測價(jià)值更高，可作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的有效補(bǔ)充，提高敏感性，減少假陰性。對(duì)于初期感染患者，臨床治療后可采用數(shù)字PCR檢測，判定結(jié)果有較高的準(zhǔn)確度。

參考文獻(xiàn)：

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