LncRNA-PANDAR介導(dǎo)EphA2、TRPM8對OSCC細(xì)胞侵襲、遷移及凋亡的作用機(jī)制

李俊梅，丹 丹，田碧媛，張 邯，李延玲

(1.邯鄲市人民醫(yī)院,河北 邯鄲 056001;2.邯鄲市口腔醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)主要發(fā)生于牙齦、硬腭、舌體、頰粘膜、嘴唇等多種器官，屬于頭頸部惡性程度最高、危害性最大的腫瘤，發(fā)生病例占頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的50%左右[1]。根據(jù)組織來源的不同可以分為頰癌和舌癌等，其中舌癌在臨床上最為常見，約占50%，其活動(dòng)度較高，血運(yùn)豐富，淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)率有所提升，患者預(yù)后效果比較差[2]?？谇击[癌的轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)，可通過淋巴等浸潤周圍組織,另外它可以造成口腔功能的損失，當(dāng)進(jìn)一步發(fā)展時(shí)，還會(huì)導(dǎo)致局部潰爛，影響生活質(zhì)量，危害到患者的生命[3-4]。有關(guān)研究表明長鏈非編碼RNA(LncRNA)對癌細(xì)胞生物學(xué)行為具有一定的影響，LncRNA-PANDAR是其成員之一，定位于第6號染色體上，其長度約為 1 500 bp，研究發(fā)現(xiàn)它能夠調(diào)控多種基因表達(dá)[5]。Eph受體酪氨酸激酶A2(Phospho Tyr930，EphA2)是從人上皮角化細(xì)胞模板DNA文庫中篩選得到的一個(gè)Eph亞家族成員，有研究發(fā)現(xiàn)，在癌細(xì)胞中活化的內(nèi)生型EphA2與其配體結(jié)合，起到抑制細(xì)胞黏附作用，并導(dǎo)致局部黏著斑激酶(Focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)磷酸化水平發(fā)生改變，影響細(xì)胞生物學(xué)行為[6-7]。另有研究發(fā)現(xiàn)，該離子通道瞬時(shí)受體電位(Transient receptor potential，TRP)通過介導(dǎo)鈣離子貫穿腫瘤的始終，TRPM是其亞族，已有研究表明其參與腫瘤產(chǎn)生及發(fā)展過程，TRPM8是其成員之一；研究表明EphA2與TRPM8在膀胱癌中為低表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，miR-21通過抑制EphA2、TRPM8水平可抑制癌細(xì)胞侵襲[8]；已有研究提示，LncRNA-PANDAR可通過調(diào)控基因水平發(fā)揮抑癌作用，但目前關(guān)于LncRNA-PANDAR對EphA2、TRPM8影響的相關(guān)文獻(xiàn)較少，具體作用機(jī)制尚未完全清楚[9]。因此本文研究LncRNA-PANDAR通過靶向降低EphA2、TRPM8活性從而抑制口腔鱗癌細(xì)胞的遷移、侵襲，促進(jìn)其凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 人OSCC 細(xì)胞系(SCC6、SCC9、SCC25)和正常人口腔角質(zhì)形成細(xì)胞(HOK)來自上海子實(shí)公司，于實(shí)驗(yàn)室保存。青霉素(山東康迪公司)、胰酶(江西百盈公司)、結(jié)晶紫溶液(上海如吉公司)、流式細(xì)胞儀(河北慧采公司)、鏈霉素(廣州利晟通公司)、裂解液(福州奧研公司)、酶標(biāo)儀(濟(jì)南歐萊博公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將SCC6、SCC9、SCC25細(xì)胞用含1×105U/L青霉素、0.1 g/L鏈霉素、5 μmol/LPTX 培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)為80%～90%時(shí)胰酶消化，離心，1 250 r/min，共5 min，重懸，傳代，取第四代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 選取PANDAR表達(dá)最高的SCC25細(xì)胞接種于6孔板中，生長至75 %上下時(shí)，按照Lipofectamine 3000的說明轉(zhuǎn)染適量的siRNA及相應(yīng)的對照siRNA。6～8 h后換液，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞并保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)分為口腔癌組(癌細(xì)胞未處理)、對照組(轉(zhuǎn)染不相關(guān)序列組)、轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染PANDAR組)。

1.4 RT-PCR檢測PANDAR mRNA水平 取SCC6、SCC9、SCC25細(xì)胞及HOK細(xì)胞，研磨,用Trizol進(jìn)行總RNA的提取,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,將逆轉(zhuǎn)后所得的cDNA進(jìn)行熒光反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。內(nèi)參為GAPDH，變性2 min 95 ℃,變性5 s 95 ℃；30 s 60 ℃；30 s 70 ℃進(jìn)行45次。計(jì)算方法用2-△△Ct法進(jìn)行分析，見表1。

表1 引物序列

1.5 Transwell小室檢測侵襲能力 于6孔板中接種SCC25細(xì)胞，將50 mg/L的基質(zhì)膠稀釋加入小室上層，37 ℃下呈凝膠狀態(tài)，上室加細(xì)胞懸液，下室加胎牛血清培養(yǎng)基，37.5 ℃，培養(yǎng)2 d，取出培養(yǎng)基，拭去殘留細(xì)胞，現(xiàn)配結(jié)晶紫，每孔500 μL，將小室放入，25 ℃染色30 min，PBS清洗，稍晾干。顯微鏡觀察每個(gè)樣本連續(xù)選5清晰視野進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì)，然后計(jì)算器平均數(shù)。

1.6 Transwell法檢測遷移能力 取各組SCC25細(xì)胞無血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12 h，后調(diào)整為5×105個(gè)細(xì)胞/mL，Transwell 小室下室加入培養(yǎng)基，上室加入細(xì)胞懸液，常溫培養(yǎng)16 h，甲醛固定，結(jié)晶紫溶液(0.1%)染色，將膜上室面細(xì)胞擦拭掉后觀察、拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 流式細(xì)胞儀測凋亡 將0.25%蛋白酶消化的各組SCC25細(xì)胞，接種到無牛血清培養(yǎng)基過夜，24 h后，收集細(xì)胞每組選擇3個(gè)樣本，PBS洗滌1次，100 μL接種于5 mL流式試管中，5 μL的IFITC AnnexinⅤ與5 μL PI 混合后染色，無光孵育15 min后注入400 μL 結(jié)合緩沖液混勻，清洗，流式細(xì)胞儀測凋亡率。

1.8 Western blot檢測EphA2、TRPM8、FAK水平 取各組SCC25細(xì)胞，裂解液裂解并提取蛋白,并對蛋白的濃度進(jìn)行測量,分裝后,保存在零下20oC的環(huán)境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液進(jìn)行混均,然后將其煮沸、變性、電泳，后移至PVDF膜上,加脫脂奶粉封閉1 h。加入EphA2、TRPM8、FAK1抗(1∶150稀釋)4oC度孵育過夜，加入2抗(1∶2 000稀釋),常溫封閉1 h。取出PVDF膜,漂洗，DAB顯色后照相。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告基因 將融合至80%的SCC25細(xì)胞接種于6孔板中，按照LipofectamineTM2000說明將EphA2-3′-UTR-WT、EphA2-3′-UTR-MUT，TRPM8-3′-UTR-WT、TRPM8-3′-UTR-MUT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HOXB5-NC(NC組)，LncRNA-PANDAR mimics(LncRNA-PANDAR組)共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，嚴(yán)格按照說明檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 PANDAR水平檢測結(jié)果 各口腔鱗癌細(xì)胞中PANDAR mRNA表達(dá)水平較HOK組細(xì)胞低(P<0.05)，SCC25組中PANDAR表達(dá)水平高于其他口腔鱗癌細(xì)胞(P<0.05)，因此本文后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用SCC25細(xì)胞進(jìn)行，其余細(xì)胞暫未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(見圖1)。

*：與HOK組比較,P<0.05；a：與SCC6組比較,P<0.05；b：與SCC9組比較,P<0.05。圖1 PANDAR在各細(xì)胞中的表達(dá)

PANDAR mRNA在口腔癌中與對照組中表達(dá)水平接近，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，轉(zhuǎn)染組中PANDAR mRNA水平較對照組低(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染成功(見圖2)。

*：與口腔癌組比較P<0.05；#：與對照組比較，P<0.05。圖2 PANDAR在細(xì)胞中的相對表達(dá)量

2.2 侵襲能力檢測結(jié)果 口腔癌組細(xì)胞侵襲數(shù)量為(812.45±45.22)，與對照組(794.31±47.33)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.512)；轉(zhuǎn)染組細(xì)胞侵襲數(shù)量(432.56±22.15)低于對照組(P<0.001)，見圖3。

A：口腔癌組；B：對照組；C：轉(zhuǎn)染組。圖3 各組細(xì)胞侵襲能力對比(×400)

2.3 遷移能力檢測結(jié)果 口腔癌組細(xì)胞遷移數(shù)量(843.26±65.21)與對照組(812.37±67.13)數(shù)量接近，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.443)；轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移數(shù)量(569.43±42.36)低于對照組(P<0.001)，見圖4。

A：口腔癌組；B：對照組；C：轉(zhuǎn)染組。圖4 各組細(xì)胞遷移能力對比(×400)

2.4 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果 口腔癌組細(xì)胞凋亡率(9.12±1.03)%與對照組細(xì)胞凋亡率(8.94±1.05)%相比，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.775)；轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率(23.52±0.37)%低于對照組(P<0.001，見圖5)。

圖5 各組癌細(xì)胞凋亡情況對比

2.5 EphA2、TRPM8、FAK水平檢測結(jié)果 口腔癌組EphA2、TRPM8、FAK蛋白表達(dá)水平與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，轉(zhuǎn)染組EphA2、TRPM8、FAK蛋白表達(dá)水平較對照組低(P<0.05)，見表2、圖6。

表2 各組EphA2、TRPM8、FAK水平對比

*：與口腔癌組比較，P<0.05；#：與對照組比較，P<0.05。圖6 各組細(xì)胞中EphA2、TRPM8、FAK蛋白的表達(dá)

2.6 雙熒光素酶報(bào)告 轉(zhuǎn)染LncRNA-PANDAR后EphA2、TRPM8及FAK野生型活性下降(P<0.05)，對突變基因無影響(P>0.05)，表明EphA2、TRPM8及FAK是LncRNA-PANDAR的靶基因(見表4)。

表4 雙熒光素酶報(bào)告

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞癌易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，如肺轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移、血運(yùn)轉(zhuǎn)移等，造成口腔功能損失，如長在舌頭上可影響語言、吞咽功能，進(jìn)一步發(fā)展時(shí)，可引起惡臭或者是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致局部潰爛，危害患者生命?？谇击[狀細(xì)胞癌組織發(fā)生部位相對特殊，惡性程度高，浸潤性強(qiáng)，易發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且預(yù)后較差。吸煙、飲酒、無煙煙草以及人乳頭瘤病毒感染均是誘發(fā)口腔鱗狀細(xì)胞癌的危險(xiǎn)因素。有關(guān)研究提出LncRNA-PANDAR、EphA2、TRPM8均可調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)行為，因此本文研究LncRNA-PANDAR、EphA2、TRPM8水平對口腔鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)行為的作用，具體分析如下。

相關(guān)研究表明，lncRNA 可調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，與多種腫瘤的產(chǎn)生及發(fā)展具有一定的相關(guān)性[10]。各口腔鱗癌細(xì)胞中PANDARmRNA表達(dá)水平較HOK組細(xì)胞低，PANDAR具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因水平的能力，其還具有組織特異性，在疾病中具有較高的診斷敏感性[11]。本文PANDAR 在口腔鱗癌中的表達(dá)及功能進(jìn)一步研究后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過轉(zhuǎn)染PANDAR抑制劑后，口腔鱗癌的侵襲、遷移、凋亡均發(fā)生改變，說明LncRNA-PANDAR可抑制口腔鱗癌細(xì)胞的生物活性。殷生良等[12]表明抑制Lncrna-PANDA表達(dá)可加快骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。張超等[13]表明抑制Lncrna-PANDA水平可抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移。聶軍等[14]對非小細(xì)胞肺癌的研究中提出，LncRNA-PANDAR在癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織。方松城等[15]對舌癌的研究中提出，LncRNA-PANDAR在舌癌中為高表達(dá)，降低其表達(dá)可加快癌細(xì)胞凋亡。本文研究與上述醫(yī)學(xué)者研究結(jié)果相一致。

腫瘤的產(chǎn)生與發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的、多樣化的過程。TRP是腫瘤惡化的重要通道，通過調(diào)控鈣離子而加快癌細(xì)胞增殖。TRPM8是最新發(fā)現(xiàn)的前列腺特異性基因，在前列腺癌與口腔癌中的表達(dá)均顯著高于正常組織[16]。RTK(受體酪氨酸激酶)貫穿腫瘤產(chǎn)生與發(fā)展的全過程，對細(xì)胞生物學(xué)行為具有調(diào)控的作用[17]。Eph家族是RTK家族成員之一，Eph受體家族又分為EphA、EphB兩種。EphA2可調(diào)控癌細(xì)胞的增殖及遷移，并在血管的產(chǎn)生中也存在著一定的作用[18]。EphA2在結(jié)腸癌、食管癌等多種癌細(xì)胞中均未高表達(dá)[19-20]。FAK參與黏著斑的形成。當(dāng)黏附分子整合素與其配體或生長因子與其受體結(jié)合時(shí)，將會(huì)激活FAK，介導(dǎo)細(xì)胞增殖及凋亡信號[21-22]。相關(guān)研究表明，癌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白含量較多，可促進(jìn)整合素與其結(jié)合并激活FAK，并與酪氨酸激酶結(jié)合，介導(dǎo)存活信號，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，以及加快血管新生[23]。經(jīng)本文研究發(fā)現(xiàn)，EphA2、TRPM8、FAK表達(dá)水平在經(jīng)過LncRNA-PANDAR干預(yù)后有所降低。曾寧碧等[24]表明TRPM8在口腔鱗癌中為高表達(dá)。陳昌偉等[25]對口腔鱗癌的研究中提出，EphA2、FAK具有正相關(guān)關(guān)系，且FAK受EphA2調(diào)控是其下游靶基因，通過調(diào)控FAK從而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為及粘附作用。王亞輝等[26]對膀胱癌的研究中提出，EphA2、TRPM8為正相關(guān)關(guān)系。本文研究結(jié)果與上述醫(yī)學(xué)者研究結(jié)果相似，因此本文認(rèn)為，經(jīng)過LncRNA-PANDAR干預(yù)后，通過降低EphA2、TRPM8水平，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力，促進(jìn)凋亡，本文通過熒光素酶報(bào)告結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染LncRNA-PANDAR后EphA2、TRPM8及FAK野生型活性下降，對突變基因無影響，表明LncRNA-PANDAR可靶向EphA2、TRPM8及FAK基因。

綜上所述，LncRNA-PANDAR通過靶向降低EphA2、TRPM8活性從而抑制口腔鱗癌細(xì)胞的遷移、侵襲，促進(jìn)其凋亡。