HIF-1α和SDF-1在糖尿病足大鼠創(chuàng)面中的表達(dá)及前列地爾的干預(yù)研究

萬 倩，周 華，王脈桃

(郴州市第一人民醫(yī)院 內(nèi)分泌糖尿病科，湖南 郴州 423000)

糖尿病足是指由于糖尿病患者長期血糖異常而導(dǎo)致的患者微循環(huán)障礙及末梢神經(jīng)病變，繼而在細(xì)菌等微生物的多種作用下導(dǎo)致糖尿病患者足部感染，潰瘍面遷延不愈，如不及時(shí)干預(yù)，糖尿病足患者面臨截肢的危險(xiǎn)，甚至危及生命[1-2]。目前臨床中對(duì)于糖尿病足的治療尚未有療效確切的藥物，只能依靠控制血糖、抗感染等多種對(duì)癥治療手段維持治療，所以，對(duì)于糖尿病足治療藥物的研發(fā)是目前的臨床工作重點(diǎn)之一。HIF-1α/SDF-1通路與糖尿病足創(chuàng)面潰瘍的發(fā)生及傷口愈合密切相關(guān)，研究表明[3-4]，HIF-1α及SDF-1水平的降低是導(dǎo)致糖尿病足發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。前列地爾作為具有改善微循環(huán)等藥理作用的藥物，近年來研究發(fā)現(xiàn)其在糖尿病足的治療中起到關(guān)鍵作用[5-6]，但其對(duì)于糖尿病足創(chuàng)面的愈合促進(jìn)作用及對(duì)HIF-1α/SDF-1通路的調(diào)節(jié)作用目前尚不清楚。本文通過研究前列地爾對(duì)糖尿病足模型大鼠的創(chuàng)面愈合及HIF-1α/SDF-1通路的影響，為前列地爾的藥理作用研究提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 H1850R高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)(上海賽弗生物科技有限公司)；GelDoc XR Biorad凝膠成像儀(美國Bio-rad公司)；DP73熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；ELx808酶標(biāo)儀(瑞士lonza公司)；7500 Fast RealTime PCR儀(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 藥品及試劑 前列地爾(北京泰德制藥股份有限公司，批號(hào)1908021)；二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)1911021)；大鼠bFGF ELISA檢測試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司，貨號(hào)CSB-E08002r-1)；PDGF-BB ELISA檢測試劑盒(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，貨號(hào)YM-SZ1557)；大鼠IL-1 ELISA檢測試劑盒(上海延慕實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)FK-QX1582)；HIF-1α(貨號(hào)ab82832)、SDF-1(貨號(hào)ab9797)及GAPDH(貨號(hào)ab9485)兔多克隆抗體(艾博抗貿(mào)易有限公司)；RNA提取試劑盒(貨號(hào)R1200)、HE染色試劑盒(貨號(hào)G1120)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(貨號(hào)PC0020)、大鼠ICAM(貨號(hào)SEKR-0030)、CRP(貨號(hào)SEKR-0017)、TNF-α(貨號(hào)SEKR-0009)、IL-6(貨號(hào)SEKR-0005)ELISA檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；cDNA合成試劑盒(武漢塞維爾生物科技有限公司，貨號(hào)G3330)；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(碧云天生物科技有限公司，貨號(hào)A0208)；PCR引物設(shè)計(jì)及合成由賽默飛世爾科技有限公司完成。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠72只，購自廈門萬泰滄海生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(閩)2018-0002，健康清潔級(jí)，6～8周齡，體重180～220 g，飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，溫度22～26℃，相對(duì)濕度50%～70%的飼養(yǎng)條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，自然光照，本實(shí)驗(yàn)所有動(dòng)物的使用及處理均已通過郴州市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4 造模、分組及給藥 72只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、糖尿病足模型組、前列地爾低、中、高劑量組及二甲雙胍組，12只/組，除空白對(duì)照組，其余大鼠參照文獻(xiàn)[7]方法建立糖尿病足大鼠模型，具體方法為，以高糖高脂飼料喂養(yǎng)大鼠4周后，按照50 mg/kg腹腔注射一次性給予大鼠STZ，3 d后對(duì)大鼠進(jìn)行尾靜脈取血，使用血糖儀測定大鼠空腹血糖，以大鼠空腹血糖>16.7 mmol/L視為糖尿病大鼠造模成功，空白對(duì)照組使用普通飼料喂養(yǎng)且不注射STZ。然后使用印章在所有大鼠足背部剪下一2 mm×5 mm大小的矩形切口，建立糖尿病足大鼠模型，將此時(shí)傷口面積記為W0。前列地爾低、中、高劑量組分別按照5、10、20 μg/kg[8]的劑量腹腔注射給予大鼠前列地爾注射液，二甲雙胍組按照200 mg/kg[9]灌胃給予二甲雙胍，空白對(duì)照組及糖尿病足模型組腹腔注射給予大鼠生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥28 d[9]，并分別于給藥第14、28天再次測定大鼠傷口面積，記為Wt，并按照以下公式計(jì)算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=(W0-Wt)/W0×100%。末次給藥結(jié)束24 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 大鼠血清ICAM、CRP、TNF-α、IL-1及IL-6水平的測定 大鼠麻醉后取仰臥位，腹主動(dòng)脈取血至干凈離心管中，室溫靜置1 h后，于4 ℃條件下8 000 r/min，離心10 min，取上清液，按照ICAM、CRP、TNF-α、IL-1及IL-6 ELISA試劑盒說明書方法測定大鼠血清ICAM、CRP、TNF-α、IL-1及IL-6水平。

1.6 大鼠創(chuàng)面組織bFGF及PDGF-BB水平的測定 每組取6只大鼠，頸椎脫臼法處死大鼠后，分離創(chuàng)面組織，置于組織勻漿器中，加入4℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液，研磨勻漿后，在4 ℃離心機(jī)中，12 000 r/min，離心10 min，取上清液，按照大鼠bFGF及PDGF-BB ELISA試劑盒說明書方法測定創(chuàng)面組織bFGF及PDGF-BB水平。

1.7 大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)檢查 每組取6只大鼠，頸椎脫臼法處死大鼠后，分離大鼠創(chuàng)面組織，置于4%中性甲醛中固定24 h后，在石蠟中包埋，進(jìn)行5 μm切片，切片經(jīng)脫蠟、水化后，進(jìn)行常規(guī)HE染色，并按照盲法在顯微鏡下以400倍鏡下觀察拍照。

1.8 大鼠創(chuàng)面組織HIF-1α及SDF-1 mRNA水平的測定 頸椎脫臼法處死大鼠后，每組取6只大鼠創(chuàng)面組織，使用RNA提取試劑盒從大鼠創(chuàng)面組織中提取總 RNA，并使用cDNA試劑盒通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在梯度PCR儀中進(jìn)行RTq-PCR反應(yīng)，結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)水平。用于PCR的引物序列如表1所示。

表1 用于PCR反應(yīng)的基因引物序列

1.9 大鼠創(chuàng)面組織HIF-1α及SDF-1蛋白水平的測定 取大鼠創(chuàng)面組織，在組織勻漿器中加入磷酸化酶抑制劑和蛋白酶抑制劑，使用組織裂解液研磨勻漿后，置于4℃離心機(jī)中，12 000 r/min，離心15 min，取上清液，使用BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒檢測所得上清液的蛋白質(zhì)含量。取相當(dāng)于40 μg蛋白的上清液，在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，并降其轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，在室溫下用封閉液封閉1 h，分別經(jīng)HIF-1α、SDF-1及GAPDH兔多克隆抗體(1∶1 000稀釋)在4℃冰箱中孵育過夜，TBST清洗3次，5 min/次，經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG室溫孵育2 h，再次用TBST清洗后，置于凝膠成像儀中，滴加化學(xué)發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)成像拍照后，使用ImageJ 1.4.0軟件進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 前列地爾對(duì)糖尿病足大鼠創(chuàng)面愈合率的影響 如表2～3所示，糖尿病足模型組大鼠14、28 d創(chuàng)面面積顯著大于空白對(duì)照組(P<0.05)，與糖尿病足模型組比較，前列地爾各劑量組及二甲雙胍組大鼠14、28 d創(chuàng)面面積顯著縮小(P<0.05)；與空白對(duì)照組比較，糖尿病足模型組大鼠14、28 d創(chuàng)面愈合率均顯著降低(P<0.05)；與糖尿病足模型組比較，前列地爾各劑量組及二甲雙胍組大鼠14、28 d創(chuàng)面愈合率均顯著升高(P<0.05)，且大鼠創(chuàng)面愈合率隨前列地爾劑量的增加而逐漸升高。

表2 大鼠創(chuàng)面面積比較

表3 大鼠14、28 d創(chuàng)面愈合率比較

2.2 前列地爾對(duì)糖尿病足大鼠血清ICAM、CRP、TNF-α、IL-1及IL-6水平的影響 如表4所示，與空白對(duì)照組比較，糖尿病足模型組大鼠血清ICAM、CRP、TNF-α、IL-1及IL-6水平均顯著升高(P<0.05)；與糖尿病足模型組比較，前列地爾各劑量組及二甲雙胍組大鼠血清ICAM、CRP、TNF-α、IL-1及IL-6水平均顯著降低(P<0.05)，且隨著前列地爾劑量的增加，大鼠血清ICAM、CRP、TNF-α、IL-1及IL-6水平逐漸降低。

表4 大鼠血清ICAM、CRP、TNF-α、IL-1及IL-6水平比較

2.3 前列地爾對(duì)糖尿病足大鼠創(chuàng)面組織bFGF及PDGF-BB水平的影響 如表5所示，與空白對(duì)照組比較，糖尿病足模型組大鼠創(chuàng)面組織bFGF及PDGF-BB水平均顯著降低(P<0.05)；與糖尿病足模型組比較，前列地爾各劑量組及二甲雙胍組大鼠創(chuàng)面組織bFGF及PDGF-BB水平均顯著升高(P<0.05)，且大鼠創(chuàng)面組織bFGF及PDGF-BB水平隨前列地爾劑量的增加而逐漸升高。

表5 大鼠創(chuàng)面組織bFGF及PDGF-BB水平比較

2.4 前列地爾對(duì)糖尿病足大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)的影響 如圖1所示，空白對(duì)照組大鼠細(xì)胞形態(tài)正常，皮下肌層結(jié)構(gòu)完整，表皮恢復(fù)良好；與空白對(duì)照組比較，糖尿病足模型組炎癥細(xì)胞浸潤，皮下肌層壞死，皮下毛囊等皮膚附屬器消失；與糖尿病足模型組比較，前列地爾各劑量組及二甲雙胍組大鼠新生毛細(xì)血管生成，炎癥細(xì)胞浸潤減輕，皮下肌層結(jié)構(gòu)較完整，皮下毛囊等皮膚附屬器有所恢復(fù)。

A：空白對(duì)照組；B：糖尿病足模型組；C：前列地爾低劑量組；D：前列地爾中劑量組；E：前列地爾高劑量組；F：二甲雙胍組。圖1 大鼠創(chuàng)面組織病理檢查結(jié)果(HE×400)

2.5 前列地爾對(duì)糖尿病足大鼠創(chuàng)面組織HIF-1α及SDF-1 mRNA水平的影響 如表6所示，與空白對(duì)照組比較，糖尿病足模型組大鼠創(chuàng)面組織HIF-1α及SDF-1 mRNA水平顯著降低(P<0.05)；與糖尿病足模型組比較，前列地爾各劑量組及二甲雙胍組大鼠創(chuàng)面組織HIF-1α及SDF-1 mRNA水平顯著升高(P<0.05)，且大鼠創(chuàng)面組織HIF-1α及SDF-1 mRNA水平隨前列地爾劑量的增加而逐漸升高。

表6 大鼠創(chuàng)面組織HIF-1α及SDF-1 mRNA水平比較

2.6 前列地爾對(duì)糖尿病足大鼠創(chuàng)面組織HIF-1α及SDF-1蛋白水平的影響 如圖2所示，與空白對(duì)照組比較，糖尿病足模型組大鼠創(chuàng)面組織HIF-1α及SDF-1蛋白水平顯著降低(P<0.05)；與糖尿病足模型組比較，前列地爾各劑量組及二甲雙胍組大鼠創(chuàng)面組織HIF-1α及SDF-1蛋白水平顯著升高(P<0.05)，且大鼠創(chuàng)面組織HIF-1α及SDF-1蛋白水平隨前列地爾劑量的增加而逐漸升高。

A:空白對(duì)照組；B:糖尿病足模型組；C:前列地爾低劑量組；D:前列地爾中劑量組；E:前列地爾高劑量組；F:二甲雙胍組；a：與空白對(duì)照組比較， P<0.05；b：與糖尿病足模型組比較， P<0.05；c：與前列地爾低劑量組比較， P<0.05；d：與前列地爾中劑量組比較， P<0.05。圖2 大鼠創(chuàng)面組織HIF-1α及SDF-1蛋白水平比較

3 討論

糖尿病足是由于長期血糖升高未予以控制，致使患者出現(xiàn)下肢神經(jīng)感覺障礙及血管病變，進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病患者足部皮膚感染后出現(xiàn)潰瘍且長期不能愈合。糖尿病足患者如不及時(shí)進(jìn)行干預(yù)，會(huì)導(dǎo)致患者下肢大面積感染，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，甚至可能危及生命[10]。目前臨床中對(duì)于糖尿病足的治療手段有限，主要采用控制血糖、控制感染等維持治療及外科治療手段。由于目前臨床中缺乏治療糖尿病足的特效藥物，所以對(duì)于糖尿病足治療藥物的開發(fā)是當(dāng)前的迫切需求。二甲雙胍作為控制血糖常用藥物，在糖尿病足治療中廣泛應(yīng)用，所以本實(shí)驗(yàn)用其作為陽性對(duì)照藥物。

前列地爾在臨床中用于治療血栓性脈管炎、心肌梗死及閉塞性動(dòng)脈硬化等疾病，近年來研究發(fā)現(xiàn)其在糖尿病足的臨床治療中具有一定的作用，張亮[11]研究發(fā)現(xiàn)前列地爾聯(lián)合依帕司他使用較單獨(dú)使用依帕司他能夠顯著降低糖尿病足患者創(chuàng)面組織TNF-α及IL-6水平，改善足部微循環(huán)，促進(jìn)創(chuàng)面恢復(fù)；游敏等[12]研究表明，前列地爾聯(lián)合硫辛酸較單獨(dú)使用硫辛酸能夠通過提高糖尿病足患者血清VEGF、bFGF、IGF-1水平，進(jìn)而改善患者足背部血流動(dòng)力學(xué)及臨床癥狀。由此可見，前列地爾在治療糖尿病足方面具有較大潛力。

血清ICAM、CRP、TNF-α、IL-1及IL-6水平與糖尿病足的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)。樂暾等[13]研究報(bào)道，血清ICAM、CRP、TNF-α、IL-1及IL-6水平升高會(huì)影響糖尿病足大鼠傷口愈合，而抑制血清ICAM、CRP、TNF-α、IL-1及IL-6水平則能夠顯著改善糖尿病足大鼠下肢血供，促進(jìn)創(chuàng)面愈合；韓強(qiáng)等[14]報(bào)道血清CRP及IL-6水平升高會(huì)影響糖尿病足大鼠創(chuàng)面血管新生，抑制大鼠CRP及IL-6水平能夠促進(jìn)大鼠創(chuàng)面組織愈合；由此可見，TNF-α、IL-1及IL-6等炎癥因子水平的升高是影響創(chuàng)面愈合的重要因素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，糖尿病足模型組大鼠血清ICAM、CRP、TNF-α、IL-1及IL-6水平顯著升高，給予大鼠前列地爾后，與糖尿病足模型組比較，前列地爾各劑量組大鼠血清ICAM、CRP、TNF-α、IL-1及IL-6水平呈劑量依賴性明顯降低，提示前列地爾能夠呈劑量依賴性顯著抑制糖尿病足大鼠體內(nèi)炎癥因子水平，進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。創(chuàng)面組織bFGF及PDGF-BB水平則同樣與大鼠創(chuàng)面愈合的速度和進(jìn)展有關(guān)，鄭月月等[15]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病足大鼠的發(fā)生及進(jìn)展與bFGF及PDGF-BB水平降低有關(guān)，提高bFGF及PDGF-BB水平能夠促進(jìn)大鼠創(chuàng)面愈合；王景等[16]研究報(bào)道糖尿病大鼠bFGF水平降低會(huì)降低創(chuàng)面愈合率，提高bFGF水平能夠改善血管功能，促進(jìn)肉芽組織生長及創(chuàng)面愈合。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，糖尿病足模型組大鼠創(chuàng)面組織bFGF及PDGF-BB水平明顯降低，與糖尿病足模型組比較，前列地爾各劑量組能夠顯著升高創(chuàng)面組織bFGF及PDGF-BB水平，提示前列地爾能夠呈劑量依賴性顯著升高大鼠創(chuàng)面bFGF及PDGF-BB水平，進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面肉芽組織生成，加速創(chuàng)面愈合。

近年來，研究表明HIF-1α/SDF-1通路與糖尿病足的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。林楚佳等[17]通過臨床研究表明，糖尿病足患者創(chuàng)面組織HIF-1α水平顯著降低，而提高HIF-1α水平則能夠顯著改善糖尿病足患者皮膚微循環(huán)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提高創(chuàng)面愈合率；蔡亮等[18]報(bào)道HIF-1α水平降低會(huì)抑制糖尿病患者創(chuàng)面修復(fù)。提高大鼠HIF-1α水平則能夠促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)，由此可見，調(diào)節(jié)HIF-1α/SDF-1通路可能是治療糖尿病足的有效途徑之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，糖尿病足模型組大鼠HIF-1α及SDF-1 mRNA及蛋白水平顯著降低，而前列地爾各劑量組大鼠HIF-1α及SDF-1 mRNA及蛋白水平呈劑量依賴性顯著升高，提示前列地爾能夠呈劑量依賴性激活糖尿病足大鼠HIF-1α/SDF-1通路，抑制大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)大鼠創(chuàng)面愈合。

綜上所述，前列地爾能夠抑制糖尿病足大鼠炎癥反應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)口愈合，改善創(chuàng)面病理學(xué)改變，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)HIF-1α/SDF-1通路有關(guān)。