梨F1代枝干輪紋病抗性分析

張艷杰,歐春青,王 斐,馬 力,姜淑苓

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹(shù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧興城 125100)

輪紋病是威脅中國(guó)梨樹(shù)生產(chǎn)的重要病害之一，又稱為粗皮病、瘤皮病等，主要危害梨樹(shù)枝干和果實(shí)，也可危害葉片，每年造成的減產(chǎn)約25%，嚴(yán)重時(shí)爛果率高達(dá)80%[1]。目前鑒定的梨輪紋病病原菌僅為葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)，該菌具有潛伏侵染特征，侵染枝干后以皮孔為中心隆起形成圓形或橢圓形的瘤狀物，邊緣龜裂，枝干受害嚴(yán)重時(shí)，病斑可密集連片，導(dǎo)致樹(shù)勢(shì)早衰，嚴(yán)重影響產(chǎn)量[2]。

培育抗性品種是防治輪紋病、有效降低輪紋病對(duì)產(chǎn)量影響的重要措施，由于梨樹(shù)是多年生自交不親和植物，遺傳背景復(fù)雜，基因高度雜合，抗病性遺傳規(guī)律研究較少，其輪紋病抗性遺傳規(guī)律不明，抗性品種選育進(jìn)展緩慢。在梨輪紋病抗性遺傳規(guī)律方面，田間自然發(fā)病調(diào)查顯示，不同梨系對(duì)枝干輪紋病的抗性不同，由強(qiáng)到弱的順序?yàn)榍镒永妗袊?guó)砂梨→白梨→日本砂梨→西洋梨[3]；通過(guò)室內(nèi)接種試驗(yàn)鑒定，不同梨系果實(shí)對(duì)輪紋病的抗性強(qiáng)弱順序?yàn)椋荷袄妗桌妗镒永妗N間雜交梨→西洋梨→新疆梨[4]。李曉剛等[5]通過(guò)對(duì)10個(gè)雜交組合827個(gè)單株的枝干輪紋病的田間調(diào)查和分析，認(rèn)為梨對(duì)輪紋病的抗性是由多基因控制的數(shù)量性狀，親本均為感病品種時(shí)，后代感病單株比例高，親本之一為抗病親本，可提高抗病單株比例，抗病親本作母本可獲得更高比例的抗病后代。當(dāng)前對(duì)梨樹(shù)抗輪紋病的遺傳規(guī)律仍沒(méi)有統(tǒng)一定論，本研究擬通過(guò)田間自然發(fā)病調(diào)查法，評(píng)價(jià)7個(gè)雜交組合1652個(gè)F1代單株對(duì)枝干輪紋病的抗性，篩選抗病和感病種質(zhì)材料，分析輪紋病抗性的遺傳規(guī)律，旨在為梨樹(shù)抗輪紋病相關(guān)基因的鑒定和基因定位奠定基礎(chǔ)，為梨樹(shù)抗輪紋病新品種選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

7個(gè)梨雜交組合(‘八月紅×紅香酥’‘蘋果梨×八月紅’‘蘋果梨×紅香酥’‘早酥×黃冠’‘錦豐×黃冠’‘錦豐×中梨1號(hào)’‘中矮1號(hào)×早酥’等)的F1代單株定植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所(興城)梨育種試驗(yàn)園，定植時(shí)間均在10 a以上，行株距為3 m × 1 m。離體抗病性鑒定的‘中梨1號(hào)’枝條由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所國(guó)家園藝種質(zhì)資源庫(kù)提供，其余7個(gè)品種均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所梨育種課題組保存?？共⌒澡b定中接種用的葡萄座腔菌(B.dothidea)菌株為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所梨育種課題組分離保存的菌株，編號(hào)為L(zhǎng)W1-1。

1.2 病原菌鑒定

采集中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所(興城)梨育種試驗(yàn)園的梨樹(shù)枝干輪紋病病瘤，無(wú)菌水清洗干凈，采用常規(guī)組織分離法，分離純化病原菌。

具體方法如下：將病組織置于75%乙醇消毒30 s，無(wú)菌水清洗1次，再用75%乙醇消毒30 s，無(wú)菌水清洗3次，置于無(wú)菌濾紙晾干，剪取病健交界處組織塊，置于PDA培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng) 5 d后，挑取組織塊邊緣菌落置于PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)5 d，挑取菌落邊緣菌絲分離純化，將純化菌株接種于PDA培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，挑取適量菌絲，采用Chelex-100法提取菌絲DNA[6]。

主要通過(guò)分子鑒定方法，對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，采用真菌鑒定通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[6]；PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中DNA模板溶液2 μL，10 ×Taq10 buffer(Mg2+plus) 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs溶液0.5 μL，10 μmol/L的上下游引物各1 μL，Taq10 DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL；PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，產(chǎn)物片段單一、純度高則送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果上傳于NCBI進(jìn)行BLASTn比對(duì)，根據(jù)片段同源性大小，獲得ITS分子鑒定結(jié)果。

1.3 梨品種抗病性鑒定

采用離體枝條創(chuàng)傷接種法，鑒定各雜交組合親本，包括‘蘋果梨’‘八月紅’‘紅香酥’‘早酥’‘黃冠’‘錦豐’‘中梨1號(hào)’和‘中矮1號(hào)’等8個(gè)品種的枝干輪紋病抗性，參考翟立峰[7]的方法并稍加改動(dòng)，具體方法如下：選取梨當(dāng)年生休眠枝條，剪成150 mm左右的枝段，枝段兩端以石蠟封口，75%酒精表面消毒后，用解剖刀在枝條中間切開(kāi)直徑約5 mm的創(chuàng)傷孔口，接種經(jīng)活化培養(yǎng)的供試菌株菌絲塊，以空白PDA 培養(yǎng)基為對(duì)照，每處理5次重復(fù)，之后用封口膜纏裹保濕，置于25 ℃濕潤(rùn)條件下培養(yǎng)，14 d后觀察并記錄其發(fā)病情況。根據(jù)病斑直徑占枝段比例進(jìn)行抗病性分級(jí)，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：0級(jí)，高抗，無(wú)病斑；1級(jí)，抗病，有病班，但病斑直徑占枝段的10%以下；2級(jí)，感病，病斑直徑占枝段的10%及以上，20%以下；3級(jí)，中感，病斑直徑占枝段的20%及以上，60%以下；4級(jí)，高感，病斑直徑占枝段的60%及以上。

1.4 F1代枝干輪紋病抗性調(diào)查

2017-2020年，每年進(jìn)行7個(gè)雜交組合 1 652株雜種F1代的枝干輪紋病田間調(diào)查，根據(jù)病斑面積記錄單株發(fā)病程度，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考蘋果枝干輪紋病[8]，具體為：0級(jí)，高抗，樹(shù)體無(wú)輪紋病瘤；1級(jí)，抗病，樹(shù)體分布有零星散生的輪紋病瘤；2級(jí)，感病，主干、骨干枝輪紋病瘤較為密集或有少量連片的輪紋病斑；3級(jí)，中感，主干、骨干枝上有較多連片的輪紋病斑，主干病斑面積達(dá)20%以上；4級(jí)，高感，主干、骨干枝上有大量連片的輪紋病斑，主干病斑面積達(dá)60%以上。

1.5 數(shù)據(jù)處理

從NCBI中下載包含模式菌株在內(nèi)的葡萄座腔菌屬真菌的ITS序列，以毛色二孢屬(Lasiodiplodia)真菌為外群，采用MEGA6軟件，以鄰接法(Neighbor-joining, NJ)構(gòu)建基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自舉法(Bootstrap)進(jìn)行1 000次重復(fù)檢驗(yàn)。

將數(shù)據(jù)輸入Excel軟件，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及圖表制作，并計(jì)算雜交F1代的抗感分離比、變異系數(shù)(CV)、遺傳傳遞力(Ta)、優(yōu)勢(shì)率(H)等[6]。

抗感分離比 = 抗性植株(0級(jí)+1級(jí))數(shù)量/感病植株(2級(jí)+3級(jí)+4級(jí))數(shù)量∶1，變異系數(shù)(CV)= 標(biāo)準(zhǔn)差/F×100%；遺傳傳遞力(Ta)=F/MP×100%；優(yōu)勢(shì)率(H)=(F-MP)/[0.5(P1+P2)]×100%；超低親率(LL)= 低于低病級(jí)親本的F1代數(shù)量/F1代總數(shù)量×100%。其中，F(xiàn)為F1代病級(jí)的平均值，MP為中親值，P1為母本病級(jí)，P2為父本病級(jí)。

2 結(jié)果與分析

2.1 梨樹(shù)枝干輪紋病病原菌的鑒定

經(jīng)分離獲得3株梨枝干輪紋病的病原菌，編號(hào)分別為L(zhǎng)W1-1、LW1-2和LW1-3，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落初為白色，培養(yǎng)7 d后，菌落表面逐漸變?yōu)榛液谏钏山q毛狀，背面呈灰黑色(圖1)；經(jīng)測(cè)序，獲得546 bp序列， BLASTn比對(duì)分析，與砂梨上分離的輪紋病菌Botryosphaeriadothidea(GenBank: MG595271)同源性達(dá)100%，通過(guò)構(gòu)建基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知，3個(gè)菌株均與Botryosphaeriadothidea(GenBank: MG595271、AY236949、KF766151)聚在同一分支(圖2)。根據(jù)分子鑒定結(jié)果，將梨樹(shù)枝干輪紋病的病原菌定為葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)的葡萄座腔菌(B.dothidea)。

圖1 梨樹(shù)枝干輪紋病病原菌Fig.1 Pathogen of pear ring rot

圖2 基于ITS序列構(gòu)建的梨樹(shù)枝干輪紋病病原菌及相關(guān)真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS sequences of pathogen of pear ring rot and related fungi

2.2 F1代枝干輪紋病的發(fā)病情況

2017年的田間調(diào)查結(jié)果顯示，1 652個(gè)F1代單株的枝干輪紋病發(fā)病率為21.07%，各雜交組合后代發(fā)病率為7.16%～40.15%，其中發(fā)病率最高的組合為‘蘋果梨×八月紅’，其次為‘八月紅×紅香酥’，發(fā)病率為33.54%；實(shí)生后代感病植株最多的組合為‘蘋果梨×八月紅’，感病植株達(dá)到41株，但是實(shí)生后代感病植株比例最高的組合為‘八月紅×紅香酥’，感病植株比例為 10.22%；發(fā)病率最低的組合為‘錦豐×黃冠’，其感病植株比例也最低，僅為0.57%(表1)。

表1 7個(gè)梨雜交組合F1代輪紋病不同等級(jí)植株數(shù)量和比例(2017年)Table 1 Number and proportion of different disease severities in F1 generation of seven pear cross combinations in 2017

2018-2020年，F(xiàn)1代的枝干輪紋病發(fā)病率分別為21.97%、22.52%和23.31%，雖逐年增加，但是與2017年相比，僅增加37株患病植株，其中1級(jí)增加33株，2級(jí)增加3株，3級(jí)增加1株，各級(jí)別病情基本維持穩(wěn)定(表2)。

至2020年，7個(gè)雜交組合F1代單株發(fā)病率為8.31%～42.89%，其中‘蘋果梨×八月紅’組合F1代發(fā)病率最高，其次為‘八月紅×紅香酥’，F(xiàn)1代發(fā)病率為37.20%；感病單株最多的組合為‘蘋果梨×八月紅’，感病植株達(dá)到44株，F(xiàn)1代感病單株比例最高的組合為仍為‘八月紅×紅香酥’，感病比例為15.86%；發(fā)病率最低的組合為‘錦豐×黃冠’，其感病比例也最低，僅為 0.57%。各組合F1代抗病比例均在80%以上，‘錦豐×黃冠’組合F1代抗病比例達(dá)到99.03%(表2)。

表2 7個(gè)梨雜交組合后代輪紋病不同等級(jí)植株數(shù)量和比例(2020年)Table 2 Number and proportion of different disease severities in F1 generation of seven pear cross combinations in 2020

2.3 梨輪紋病抗性的遺傳分析

通過(guò)室內(nèi)離體接種鑒定，8個(gè)親本品種中‘蘋果梨’‘早酥’‘黃冠’‘中梨1號(hào)’和‘中矮1號(hào)’均表現(xiàn)抗病，病害級(jí)別為1級(jí)，而‘八月紅’‘紅香酥’和‘錦豐’表現(xiàn)感病，其中‘八月紅’和‘錦豐’的病害級(jí)別為3級(jí)，‘紅香酥’的病害級(jí)別達(dá)到4級(jí)(表3)。

表3 8個(gè)梨品種的輪紋病抗性Table 3 Resistanse of eight pear cultivars to ring rot

根據(jù)病級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，0級(jí)(高抗)和1級(jí)(抗病)均為對(duì)枝干輪紋病表現(xiàn)抗病的植株，而2級(jí)(感病)、3級(jí)(中感)和4級(jí)(高感)均為對(duì)枝干輪紋病表現(xiàn)感病的植株，7個(gè)雜交組合F1代的抗感分離比在5.31∶1～173.5∶1，其中不同抗性親本雜交，F(xiàn)1代抗感分離比在8.11∶1～173.5∶1。各雜交組合中抗感分離比最高的是‘錦豐×黃冠’，為173.5∶1，其親本抗性類型為“感病×抗病”，同樣‘錦豐’作為感病母本，與抗病父本‘中梨1號(hào)’雜交后，其F1代群體的抗感分離比也較高，為61.4∶1。兩個(gè)抗病親本‘早酥’與‘黃冠’雜交，其F1代抗感分離比為44.6∶1，‘早酥’作為父本，與抗病的‘中矮1號(hào)’雜交，其抗感分離比則為32.0∶1。以抗病的‘蘋果梨’為母本，分別以感病的‘八月紅’和‘紅香酥’為父本，F(xiàn)1代群體的抗感分離比分別為8.11∶1和12.2∶1。以感病親本‘八月紅’為母本，以感病親本‘紅香酥’為父本，F(xiàn)1代抗感分離比最低，為5.31∶1(表4)。

表4 7個(gè)雜交組合后代的抗感分離比Table 4 Resistance separation ratio of seven hybrid combinations

以上結(jié)果表明，梨樹(shù)雜交后代對(duì)枝干輪紋病的抗性是復(fù)雜的多基因控制的數(shù)量性狀；以抗病品種為母本，當(dāng)父本為抗病品種時(shí)，抗感比較高，當(dāng)父本為感病品種時(shí)，抗感比較低；同樣以感病品種為母本，當(dāng)父本為抗病品種時(shí)，抗感比也較高，當(dāng)父本為感病品種時(shí)，抗感比較低；即無(wú)論母本為抗病品種還是感病品種，當(dāng)父本為抗病品種時(shí)，F(xiàn)1代的抗感比較高，而當(dāng)父本為感病品種時(shí)，抗感比較低，表明父本的抗性對(duì)雜交后代影響較大。

通過(guò)遺傳傾向分析，7個(gè)雜交組合F1代的變異系數(shù)均較大，大于或等于145.00%，甚至達(dá)到 333.33%，說(shuō)明F1代中枝干輪紋病抗性分離極其廣泛，F(xiàn)1代均值均低于中親值，超低親率大于或等于57.11%，甚至達(dá)到92.07%，表現(xiàn)出低低親遺傳傾向，即F1代更趨向于抗枝干輪紋病的遺傳 (表5)。

表5 7個(gè)雜交組合后代的遺傳傾向Table 5 Genetic tendency of resistance of seven hybrid combinationsto ring rot

3 討論與結(jié)論

3.1 梨與蘋果枝干輪紋病病原菌的差異

本研究鑒定的梨樹(shù)枝干輪紋病病原菌為葡萄座腔菌(B.dothidea)，與呂剛[2]、汪來(lái)寶等[9]的鑒定結(jié)果相同。梨枝干輪紋病與蘋果枝干輪紋病癥狀相似，前期認(rèn)為二者病原菌相同，均為葡萄座腔菌(B.dothidea)[10]，但是Xu等[11]采用形態(tài)學(xué)和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析研究認(rèn)為：蘋果枝干輪紋病菌有2個(gè)種，葡萄座腔菌(B.dothidea)和粗皮葡萄座腔菌(B.kuwatsukai)，其中葡萄座腔菌在枝干上引起的病瘤直徑較小，一般小于1 mm，而粗皮葡萄座腔菌引起的病瘤直徑較大，并造成粗皮，他們還發(fā)現(xiàn)離體接種梨枝條時(shí)，葡萄座腔菌不產(chǎn)生病瘤，而粗皮葡萄座腔菌則能產(chǎn)生病瘤。本研究并未采用多基因系統(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)行菌株的鑒定，采集的樣本病瘤有大有小，但是通過(guò)真菌ITS通用分子鑒定方法，將采集分離的菌株鑒定為葡萄座腔菌，且在梨品種抗病性離體鑒定中發(fā)現(xiàn)，葡萄座腔菌可以致病。

3.2 梨樹(shù)對(duì)枝干輪紋病的抗性為多基因控制的數(shù)量性狀

親本及其F1代的抗病性分析是挖掘輪紋病抗性基因的基礎(chǔ)，本研究對(duì)8個(gè)親本品種進(jìn)行離體抗病性鑒定，發(fā)現(xiàn)‘蘋果梨’‘早酥’‘黃冠’‘中梨1號(hào)’和‘中矮1號(hào)’均表現(xiàn)抗病，而‘八月紅’‘紅香酥’和‘錦豐’表現(xiàn)感病，鑒定結(jié)果與李樹(shù)玲等[3]、李曉剛等[5]、姜淑苓[12]、魏樹(shù)偉等[13]的鑒定結(jié)果基本一致?？梢云錇橐罁?jù)進(jìn)行F1代抗病性的遺傳分析。

通過(guò)對(duì)F1代進(jìn)行田間自然發(fā)病調(diào)查和遺傳分析，發(fā)現(xiàn)F1代性狀分離十分廣泛，抗感比在 5.31∶1～173.5∶1，表明梨樹(shù)對(duì)輪紋病的抗性表現(xiàn)為多基因控制的數(shù)量性狀，這與李曉剛等[5]、朱紅艷等[14]的研究結(jié)果相似，然而是否存在主效基因，是否為多個(gè)微效基因控制，仍不清楚。另外，李曉剛等[5]分析發(fā)現(xiàn)以抗病品種作母本較其作父本可獲得更高比例的抗病單株，而本研究結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)無(wú)論母本為抗病品種還是感病品種，父本為抗病品種可獲得更高比例的抗病單株，本研究中各雜交組合的F1代中抗病單株比例均高于80%，與李曉剛等[5]的研究結(jié)果不同，這可能與不同的抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)，本研究認(rèn)為發(fā)病級(jí)別為1級(jí)仍為抗病單株，而李曉剛等[5]則認(rèn)為只有0級(jí)為抗病單株。

本研究表明：梨樹(shù)對(duì)輪紋病的抗性表現(xiàn)為多基因控制的數(shù)量性狀，因此，在抗病基因和抗病分子標(biāo)記的挖掘中可運(yùn)用構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、QTL定位和BSA分析等方法。例如在蘋果上，劉志[15]調(diào)查表明蘋果枝干和果實(shí)輪紋病的抗性由核主效基因控制，與細(xì)胞質(zhì)無(wú)明顯相關(guān)；崔鎂沙等[16]運(yùn)用SSR圖譜和蘋果基因組信息，獲得29個(gè)與蘋果果實(shí)輪紋病抗病性相關(guān)的QTL位點(diǎn)。由于本研究中，F(xiàn)1代單株的抗性數(shù)據(jù)是采用病害等級(jí)進(jìn)行記錄和分析的，在遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、QTL分析等方面存在缺陷，未來(lái)應(yīng)該記錄每一個(gè)單株的病斑面積或者病斑面積的占比，從而進(jìn)行較為精確地遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建和QTL分析，較為精確地定位抗性基因或抗性相關(guān)分子標(biāo)記，另外，本研究只進(jìn)行了枝干輪紋病的調(diào)查和鑒定，對(duì)果實(shí)輪紋病和葉片輪紋病未做調(diào)查和鑒定，其發(fā)病情況和抗性遺傳規(guī)律是否如此，還需要在以后的研究中繼續(xù)探索。

通過(guò)遺傳分析，本研究結(jié)果顯示：梨樹(shù)對(duì)枝干輪紋病的抗性是多基因控制的數(shù)量性狀，F(xiàn)1代中枝干輪紋病抗性分離極其廣泛，但是更傾向于抗枝干輪紋病的遺傳方向，盡管如此，當(dāng)雙親為感病品種時(shí)，后代感病單株比例更高，抗病品種作為父本，后代抗病單株比例更高，即父本的抗性對(duì)F1代的影響較大。本研究結(jié)果為進(jìn)一步構(gòu)建梨輪紋病抗性遺傳連鎖圖譜、開(kāi)展梨輪紋病抗性基因的QTL定位、挖掘和分離抗性基因提供了依據(jù)，為分子輔助梨抗病育種奠定了基礎(chǔ)，對(duì)優(yōu)質(zhì)、抗輪紋病梨新品種的選育具有一定意義。