Mimics轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞條件的優(yōu)化

任 靜，郝琴琴，成俊麗，李鵬飛

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801）

將外源基因?qū)胝婧思?xì)胞內(nèi)并使其表達(dá)的技術(shù)稱為細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，該技術(shù)是研究基因表達(dá)調(diào)控的重要手段。常用的轉(zhuǎn)染方法包括化學(xué)轉(zhuǎn)染法，如陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀法等；生物轉(zhuǎn)染法如病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染；物理轉(zhuǎn)染法如電穿孔法、顯微注射法等。根據(jù)轉(zhuǎn)染載體不同又可分為病毒載體轉(zhuǎn)染和非病毒載體轉(zhuǎn)染[1]。因細(xì)胞類型和試驗(yàn)結(jié)果要求的不同，選擇轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小的轉(zhuǎn)染方法至關(guān)重要。PC12是源于大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤的一種細(xì)胞株，可在神經(jīng)生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)下發(fā)生形態(tài)及生理功能的變化[2]，在多種疾病研究中被廣泛使用[3]。PC12是一類較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，研究中普遍采用病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染[4-6]，該方法轉(zhuǎn)染效率較高且能夠使目的基因在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)[7]，但存在無(wú)法攜帶大片段、具有一定危險(xiǎn)性和成本較高等缺點(diǎn)[8]。為解決這些問題，許多研究人員采用非病毒載體作為替代的轉(zhuǎn)染方法以達(dá)到瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞的目的，非病毒載體主要包括陽(yáng)離子聚合物載體和陽(yáng)離子脂質(zhì)體載體[9]。因此，在不影響PC12細(xì)胞活性及分化能力的基礎(chǔ)上，選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑及最佳轉(zhuǎn)染量，提高PC12細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，是后續(xù)研究基因功能的重要前提。

本試驗(yàn)選取了陽(yáng)離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑RFect、D-Portal、TransIntroTMEL和陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000、Lipofectamine 2000共5種，通過比較各類轉(zhuǎn)染試劑在相同條件下對(duì)PC12轉(zhuǎn)染NC-FAM mimics的效果，選擇最佳轉(zhuǎn)染試劑，后續(xù)優(yōu)化轉(zhuǎn)染PC12的最佳NC-FAM mimics轉(zhuǎn)染量，以確定適合PC12細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑及轉(zhuǎn)染條件，旨在為PC12細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞株購(gòu)自上海中橋新舟生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

FAM標(biāo)記的microRNA NC mimics由上海吉瑪公司合成；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone公司；RFect購(gòu)自常州百代生物科技股份有限公司；D-Portal購(gòu)自天津美瑞特疫療科技有限公司；TransIntroTMEL購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine 3000、Lipofectamine2000均購(gòu)自Thermo公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng) 以RPMI-1640完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、1%雙抗）于37℃在5%CO2條件下培養(yǎng)PC12細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到80%以上時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3.2 不同轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞 用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5.0×105個(gè)/mL，接種至6孔板，并于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照每種轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書的要求進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作（依照說(shuō)明書中6孔板最大規(guī)格添加試劑及樣品），轉(zhuǎn)染試劑添加量分別為RFect 10μL、D-Portal 10μL、TransIntroTMEL 12.5μL、Lipofectamine 3000 10μL、Lipofectamine 2000 12.5μL；與之相對(duì)應(yīng)的NC-FAM mimics添加量分別為4、4、3、5、5μg。

1.3.3 不同轉(zhuǎn)染量轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞 設(shè)置6個(gè)NCFAM mimics轉(zhuǎn)染濃度梯度，分別為50、60、70、80、90、100 nmol/L，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。先用無(wú)血清培養(yǎng)基Opti-MEM分別預(yù)孵育轉(zhuǎn)染試劑和NCFAM mimics 5 min，再混合孵育20 min后轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞。根據(jù)轉(zhuǎn)染濃度分別加入6孔板后，添加RPMI-1640培養(yǎng)液至3 mL。細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后更換無(wú)血清培養(yǎng)基。

1.3.4 轉(zhuǎn)染效率測(cè)定及細(xì)胞計(jì)數(shù) 轉(zhuǎn)染后，陽(yáng)性細(xì)胞能夠發(fā)出綠色熒光，在倒置熒光顯微鏡下觀察每組細(xì)胞熒光信號(hào)并采集圖像。每個(gè)試驗(yàn)組中隨機(jī)選取3個(gè)有代表性的視野進(jìn)行觀察計(jì)算，采用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行處理，統(tǒng)計(jì)熒光強(qiáng)度和細(xì)胞數(shù)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析使用GraphPad Prism 9.0軟件，采用單因素方差分析（One-Wat ANOVA）進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 PC12細(xì)胞正常狀態(tài)下形態(tài)特征

熒光顯微鏡下觀察正常狀態(tài)下PC12細(xì)胞形態(tài)可知（圖1），高分化狀態(tài)下的PC12細(xì)胞為圓形，出現(xiàn)聚集成團(tuán)生長(zhǎng)的現(xiàn)象，且細(xì)胞間突觸形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好。

2.2 不同轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染效果及細(xì)胞損傷情況

由圖2可知，5種轉(zhuǎn)染試劑中RFect熒光強(qiáng)度最低，轉(zhuǎn)染效果最差；D-Portal、Lipofectamine 3000和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染效果優(yōu)于RFect，但仍未達(dá)到最佳轉(zhuǎn)染效果；TransIntroTMEL轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光強(qiáng)度最高，轉(zhuǎn)染效果最好。此外，不同轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞損傷結(jié)果如圖3所示，5種轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞后，各組細(xì)胞數(shù)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明本試驗(yàn)選擇的5種轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞損傷的影響無(wú)明顯差別。

2.3 不同NC-FAM mimics轉(zhuǎn)染量轉(zhuǎn)染效果及細(xì)胞損傷情況

為確定轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞的最佳mimics轉(zhuǎn)染量，選擇轉(zhuǎn)染效果最好的TransIntroTMEL轉(zhuǎn)染試劑對(duì)不同濃度的NC-FAM mimics進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分析每組熒光強(qiáng)度。從圖4-A可以看出，當(dāng)轉(zhuǎn)染量在50~100 nmol/L濃度梯度時(shí)，隨著NC-FAM mimics轉(zhuǎn)染量的增加，熒光強(qiáng)度呈先增高隨后逐漸下降的趨勢(shì)，轉(zhuǎn)染效果隨之先升高隨后逐漸降低；進(jìn)一步分析細(xì)胞熒光平均光密度，結(jié)果顯示（圖4-B），平均光密度在轉(zhuǎn)染濃度達(dá)到70 nmol/L前逐漸升高，之后逐漸降低。以上結(jié)果表明，當(dāng)NC-FAM mimics濃度為70 nmol/L時(shí)，熒光信號(hào)最強(qiáng)，轉(zhuǎn)染效果最好。

進(jìn)一步研究不同濃度NC-FAM mimics對(duì)細(xì)胞損傷的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同轉(zhuǎn)染濃度組的細(xì)胞數(shù)量間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖5），說(shuō)明本試驗(yàn)選取的6個(gè)濃度梯度對(duì)細(xì)胞損傷的影響無(wú)明顯差別。

3 結(jié)論與討論

PC12由于細(xì)胞體積較小，生長(zhǎng)緩慢，未分化狀態(tài)下不易貼壁，轉(zhuǎn)染較為困難[10-11]。前人采用物理轉(zhuǎn)染法的電穿孔技術(shù)對(duì)PC12進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率較低，約為10%~20%[12]；而生物轉(zhuǎn)染法如慢病毒載體轉(zhuǎn)染，雖能達(dá)到較高的轉(zhuǎn)染效率，但是靶向特異性差且操作困難[13]。本試驗(yàn)采用化學(xué)轉(zhuǎn)染法，選用了陽(yáng)離子脂質(zhì)體（Lipofectamine 3000和Lipofectamine 2000）和陽(yáng)離子聚合物（RFect、D-Portal和TransIntroTMEL）2類轉(zhuǎn)染試劑，其主要差別在于攜帶質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞的載體不同。已有研究證實(shí)，陽(yáng)離子脂質(zhì)體和陽(yáng)離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑在PC12細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效果均高于物理轉(zhuǎn)染方法和病毒載體轉(zhuǎn)染[14]。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑TransIntroTMEL的轉(zhuǎn)染效果最好，可能是由于脂質(zhì)體會(huì)抑制磷酸激酶C、ATP酶等活性[15-16]，作為siRNA載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)會(huì)導(dǎo)致脫靶效應(yīng)[17]，此外脂質(zhì)體進(jìn)入細(xì)胞后易產(chǎn)生細(xì)胞毒性[18]，而陽(yáng)離子聚合物是一類線性高分子聚合物，攜帶大量活性較高的功能基團(tuán)，能夠與細(xì)胞膜親和形成氫鍵，以傳遞外源基因[19]，產(chǎn)生的細(xì)胞毒性較脂質(zhì)體更小。目前，許多研究者選擇缺乏免疫原性、包裝核酸方面具有靈活性且更易降解的陽(yáng)離子聚合物作為載體進(jìn)行試驗(yàn)。LIU等[20]采用聚乙二醇-聚乙烯亞胺（PEG-PEI）作為載體轉(zhuǎn)染siRNA降低PC12細(xì)胞中SNCA的表達(dá)，證明PEG-PEI載體具有較高的轉(zhuǎn)染效率及較低的細(xì)胞毒性。由于化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑原料及研發(fā)手段的不同，轉(zhuǎn)染同種細(xì)胞時(shí)選擇不同的轉(zhuǎn)染試劑會(huì)產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)染效果，因此，對(duì)于培養(yǎng)條件嚴(yán)格、轉(zhuǎn)染困難的PC12細(xì)胞，必須通過進(jìn)一步的優(yōu)化來(lái)提高轉(zhuǎn)染效率。

轉(zhuǎn)染效果受到細(xì)胞狀態(tài)、傳代次數(shù)、轉(zhuǎn)染濃度和質(zhì)粒大小等的影響，其中轉(zhuǎn)染濃度的影響尤為重要。俞曉煒等[21]用TransIntroTMEL對(duì)食管鱗癌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)當(dāng)質(zhì)粒質(zhì)量濃度為4 ng/μL時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高。陳鳳婷[22]用TransIntroTMEL對(duì)MDAMB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染CY 3標(biāo)記的NC mimics，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，發(fā)現(xiàn)當(dāng)NC mimics濃度為40、50、100 nmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)染效率均可達(dá)到80%以上。而本試驗(yàn)中，用TransIntroTMEL轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，最佳的轉(zhuǎn)染濃度為70 nmol/L，與前人研究結(jié)果不同，這說(shuō)明同一轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染不同類型細(xì)胞時(shí)，最佳轉(zhuǎn)染濃度存在差異。本試驗(yàn)中設(shè)置的不同轉(zhuǎn)染條件之間PC12細(xì)胞損傷無(wú)明顯差異，不同試劑及不同轉(zhuǎn)染濃度對(duì)細(xì)胞造成的損傷均在試驗(yàn)允許范圍內(nèi)。

本試驗(yàn)選用5種試劑對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示，非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑TransIntroTMEL的轉(zhuǎn)染效果最好；進(jìn)一步對(duì)NC-FAM mimics轉(zhuǎn)染濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染濃度為70 nmol/L條件下TransIntroTMEL對(duì)PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染后熒光信號(hào)最強(qiáng)，且各濃度處理間的細(xì)胞損傷無(wú)顯著差異，能夠在保證細(xì)胞存活率的前提下獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。