溶血標(biāo)本的CK-MB活性檢測(cè)異常結(jié)果研究

倪軍，顧壽永，汪彥陽，魏雪菲，周遠(yuǎn)洋，彭魯，張葵，柏兵,,5

(1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 檢驗(yàn)科，江蘇 南京 210008；2.江蘇省老年病醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所，江蘇 南京 210024；3.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京 210008；4.南京醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院 檢驗(yàn)科，江蘇 南京 210029；5.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中心，江蘇 南京 210008)

肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase isozyme MB,CK-MB)是臨床上檢測(cè)心肌梗死與心肌炎等心臟損傷的重要指標(biāo)之一。肌酸激酶(creatine kinase,CK)是由腦型(B)與肌型(M)亞單位組成的蛋白二聚體，主要分布在骨骼肌、心肌、平滑肌與腦組織中。其中，在腦組織中主要是BB型，在骨骼肌中主要為MM型，而在心肌中則主要為MB型和MM型。心肌受到損傷時(shí)CK釋放至血清，因其檢測(cè)方便、報(bào)告較快、價(jià)格較低，臨床上通常檢測(cè)CK-MB與總CK的活性，并取兩者的比值作為心肌來源CK的相對(duì)特異性指標(biāo)，以判斷心肌損傷情況以及急性ST段抬高型心肌梗死(ST-segment elevation myocardial infarction,STEMI)患者診斷和一體化溶栓模式治療的臨床效果[1]。

臨床檢測(cè)工作中我們經(jīng)常發(fā)現(xiàn)有CK-MB活性比該標(biāo)本中檢測(cè)到的總CK活性還要高的現(xiàn)象，難以合理解釋，給臨床帶來較大困惑，影響疾病的準(zhǔn)確判斷。實(shí)際上，該現(xiàn)象在其他較多臨床實(shí)驗(yàn)室中常見，并有報(bào)道稱該現(xiàn)象與巨CK-Ⅱ、惡性腫瘤、腦部疾病等有關(guān)[2-4]，但這與出現(xiàn)此類結(jié)果的臨床患者的病情并不吻合。

本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象在溶血標(biāo)本中更為常見，并有隨溶血加重而更加明顯的趨勢(shì)?，F(xiàn)對(duì)此進(jìn)行初步研究和探討，從而為CK-MB活性準(zhǔn)確檢測(cè)和正確判讀，提供更多的實(shí)驗(yàn)與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院健康體檢者的乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血漿和血清標(biāo)本。血常規(guī)、生化32項(xiàng)、腫瘤指標(biāo)、胸部CT等所有檢查結(jié)果均正常，乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎、梅毒、人類免疫缺陷病毒檢查結(jié)果均為陰性。

1.2 儀器

Beckman AU5400全自動(dòng)生化儀、Vitros FS 5.1全自動(dòng)干式生化儀(Ortho Clinical Diagnostics)、奧林巴斯5400全自動(dòng)生化儀、AIA-900全自動(dòng)免疫分析儀(Tosoh Corporation)、羅氏E411全自動(dòng)免疫分析儀、JX-650超聲波細(xì)胞破碎儀、Heraeus Megafuge 8R離心機(jī)(Thermo Fisher)、OLYMPUS CX31顯微鏡。

1.3 試劑

總CK活性檢測(cè)(常規(guī)化學(xué)方法)試劑盒來自于四川邁克生物科技股份有限公司(四川邁克)與南京澳林生物科技有限公司(南京澳林)?？侰K活性檢測(cè)(干化學(xué)方法)試劑盒來自于Ortho Clinical Diagnostics。CK-MB活性常規(guī)化學(xué)與干化學(xué)檢測(cè)試劑分別來自于四川邁克和Ortho Clinical Diagnostics。CK-MB蛋白水平檢測(cè)(質(zhì)量法)試劑盒來自于Roche公司(羅氏)和Tosoh Corporation。

1.4 方法

1.4.1 溶血標(biāo)本配制 1 ml肝素抗凝全血標(biāo)本離心取紅細(xì)胞，生理鹽水洗滌3次至澄清后加1 ml去離子水。因紅細(xì)胞破裂釋放會(huì)補(bǔ)充滲透壓，導(dǎo)致不能全部裂解。因此，用micro-tip頭進(jìn)行超聲(JX-650超聲波細(xì)胞破碎儀，2號(hào)超聲頭，30%能量，超聲5 s，連續(xù)3次)細(xì)胞破碎，并在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞全部破碎?；靹蚝?，用相同個(gè)體來源的血清配制成0、0.1%、0.3%、1%、3%的溶血標(biāo)本。所有檢測(cè)值均按配制體積換算回實(shí)際血清濃度。

1.4.2 樣本檢測(cè) 首先利用Beckman AU5400全自動(dòng)生化儀及四川邁克試劑，對(duì)標(biāo)本分別檢測(cè)總CK活性與CK-MB活性，再在Vitros FS 5.1全自動(dòng)干式生化儀(Ortho Clinical Diagnostics)和奧林巴斯5400全自動(dòng)生化儀上進(jìn)行復(fù)測(cè)比較。用羅氏E411與AIA-900全自動(dòng)免疫分析儀(Tosoh Corporation)檢測(cè)CK-MB蛋白水平(質(zhì)量法)。對(duì)各結(jié)果進(jìn)行分析比較。

1.4.3 抗體抑制實(shí)驗(yàn) 將四川邁克CK-MB試劑中含有CK-M亞單位抗體的試劑A，用總CK試劑盒中的試劑A進(jìn)行稀釋(以避免鹽分差異等實(shí)驗(yàn)干擾因素)，然后加入到溶血程度為1%的標(biāo)本中再測(cè)定各標(biāo)本的總CK活性，以觀察CK-M亞單位抗體對(duì)紅細(xì)胞中釋放的CK成分的抑制作用。

1.4.4 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)與CK活性檢測(cè)結(jié)果的回顧性分析 回顧過去我院全自動(dòng)常規(guī)化學(xué)與干化學(xué)生化分析儀(Beckman AU5400與Vitros FS 5.1)上的臨床生化檢測(cè)數(shù)據(jù)(干化學(xué)：2019年11月至2020年4月，839例；濕化學(xué)：2020年1月至2020年4月，735例)，以LDH為溶血依據(jù)，分析CK-MB與CK的活性比例數(shù)據(jù)，并進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 溶血標(biāo)本的CK和CK- MB活性檢測(cè)結(jié)果

在同一個(gè)臨床個(gè)體來源的0、0.1%、0.3%、1%及3%不同程度溶血的標(biāo)本中總CK活性略有上升，但CK-MB活性升高更加明顯。CK-MB活性與總CK活性的比值在無溶血時(shí)為0.21，但到1%溶血時(shí)開始出現(xiàn)了1.09的比例倒置現(xiàn)象，并持續(xù)升高至3%溶血時(shí)的1.89(圖1A)。在另外9個(gè)臨床個(gè)體的不同程度溶血標(biāo)本中同樣出現(xiàn)CK-MB活性增高，并且出現(xiàn)CK-MB/CK值升高并倒置的現(xiàn)象(圖1B)。

圖1 溶血標(biāo)本中CK-MB和CK檢測(cè)結(jié)果Fig 1 The activity of CK-MB and CK in serum samples with hemolysis

2.2 溶血標(biāo)本的CK和CK- MB活性干化學(xué)方法復(fù)測(cè)結(jié)果

為進(jìn)一步確定該現(xiàn)象，我們用其它檢測(cè)方法對(duì)此進(jìn)行了驗(yàn)證。首先利用同一個(gè)臨床個(gè)體來源的不同程度溶血標(biāo)本，用Vitros FS 5.1全自動(dòng)干式生化儀(Ortho Clinical Diagnostics)及其試劑進(jìn)行了CK和CK-MB活性復(fù)測(cè)。在結(jié)果中雖然總CK活性也同樣升高，但CK-MB活性沒有明顯升高，更沒有CK-MB/CK值倒置現(xiàn)象(圖2A)。再用另外9個(gè)臨床個(gè)體的紅細(xì)胞與血清標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，同樣沒有比例異常增高及倒置的現(xiàn)象(圖2B)。

圖2 干化學(xué)方法檢測(cè)溶血標(biāo)本中CK-MB、總CK活性以及CK-MB/CK結(jié)果Fig 2 Detection of the activity of CK-MB,total CK and CK-MB/CK in hemolysis serum samples by dry chemical method

2.3 溶血標(biāo)本的CK- MB蛋白水平檢測(cè)結(jié)果

為了分析該現(xiàn)象的原因，我們利用質(zhì)量法檢測(cè)了CK-MB的蛋白水平，以明確其是否真性升高。我們對(duì)10個(gè)臨床個(gè)體來源的1%溶血標(biāo)本逐一進(jìn)行檢測(cè)，除CK-MB活性均比總CK活性還要高的比例倒置現(xiàn)象外，并未檢出CK-MB蛋白水平明顯增高(圖3A)，用另外的質(zhì)量法進(jìn)行復(fù)查也未檢出其升高現(xiàn)象(圖3B)。

圖3 1%程度溶血標(biāo)本中的CK-MB蛋白水平檢測(cè)結(jié)果Fig 3 CK-MB level in serum samples with 1% hemolysis

2.4 溶血標(biāo)本的CK- MB活性異常分析

基于抗體抑制法的CK-MB活性測(cè)定原理，是通過抗體抑制CK-M亞單位的活性來檢測(cè)剩余的CK-B亞單位活性，再通過計(jì)算得到CK-MB活性，并非通過直接檢測(cè)得到。因?yàn)檠褐械腃K主要為CK-MM與CK-MB，抑制掉CK-M后主要剩下CK-MB上的B亞單位，只要將剩余B 亞單位活性乘以2就間接得到CK-MB的活性[5-6]。這是臨床CK-MB活性檢測(cè)的一般方法。

如果抗體不能有效抑制CK-M亞單位，那么剩余的CK-M活性就會(huì)被當(dāng)成CK-B亞單位活性并乘以2，從而造成結(jié)果假性增高的現(xiàn)象。因此，我們檢測(cè)了試劑盒中的抗體對(duì)CK-M亞單位抑制的有效性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的抗體均對(duì)1%溶血標(biāo)本的總CK活性無抑制作用(圖4)。

圖4 CK-M亞單位抗體對(duì)溶血標(biāo)本總CK活性的抑制情況Fig 4 The influence of CK-M subunit antibody on total CK activity in serum samples with hemolysis

2.5 回顧性數(shù)據(jù)分析

CK-MB/CK值升高現(xiàn)象可能由標(biāo)本溶血所致。為進(jìn)一步分析溶血可導(dǎo)致CK-MB/CK值升高的現(xiàn)象，以LDH作為提示溶血的指標(biāo)，我們回顧分析了本實(shí)驗(yàn)室的臨床生化檢測(cè)數(shù)據(jù)，包含常規(guī)化學(xué)方法及干化學(xué)方法的檢測(cè)結(jié)果。如果CK-MB/CK值升高是由溶血引起，那么這些標(biāo)本中的LDH有較高的趨勢(shì)。正如預(yù)期，受溶血影響的常規(guī)化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示CK-MB/CK值升高的樣本組的LDH檢測(cè)結(jié)果顯著較高，如活性比值高于0.6的樣本組LDH水平要高于比值低于0.6的樣本組。再以比值為0.7與0.8作為分界值，比值較高的樣本組同樣有LDH升高現(xiàn)象。然而，在受溶血影響不明顯的干化學(xué)檢測(cè)方法下，CK-MB/CK值在這些組間都沒有LDH水平差異的現(xiàn)象。這些結(jié)果都驗(yàn)證了CK-MB/CK值異常升高可由溶血引起，并受具體的檢測(cè)試劑與方法所影響。LDH提示溶血情況，升高時(shí)標(biāo)本溶血的可能性較大。見圖5。

經(jīng)t檢驗(yàn)，* 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，N.S.表示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義圖5 臨床標(biāo)本總CK活性、CK-MB活性及LDH數(shù)據(jù)回顧性分析Fig 5 The retrospective analysis of CK,CK-MB and LDH

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)CK與CK-MB的常規(guī)化學(xué)活性檢測(cè)結(jié)果在溶血標(biāo)本中升高，并且CK-MB升高更明顯，導(dǎo)致兩者活性比值異常升高，甚至比例倒置的現(xiàn)象。然而，該現(xiàn)象并不在干化學(xué)方法檢測(cè)中出現(xiàn)，質(zhì)量法檢測(cè)提示CK-MB的蛋白水平也沒有在溶血標(biāo)本中有明顯升高。通過抗體抑制實(shí)驗(yàn)基本分析出CK-MB與CK活性比值異常升高的原因，是由CK-M亞單位的抗體對(duì)紅細(xì)胞來源的CK無有效抑制作用所致，導(dǎo)致未能被封閉的CK-M活性被當(dāng)成CK-B活性計(jì)算，從而導(dǎo)致了CK-MB活性的假性升高。

實(shí)際上，CK確實(shí)可以在紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板中表達(dá)[7]。在某些罕見遺傳性疾病中出現(xiàn)，如CKBE中，該疾病患者的紅細(xì)胞中表達(dá)CK-B亞單位，并且活性比正常對(duì)照組高達(dá)800倍[8]。另外，在紅細(xì)胞全蛋白組學(xué)研究報(bào)道中，正常紅細(xì)胞的胞漿中就表達(dá)一定豐度的CK，主要為M型[9-11]。紅細(xì)胞中的CK-B亞單位肯定不能被本實(shí)驗(yàn)中的CK-M亞單位抗體所有效結(jié)合與抑制，因此肯定會(huì)造成CK-MB活性結(jié)果假性升高。然而這種情況僅見于罕見病中，與該現(xiàn)象在溶血標(biāo)本中的常見性不符。正常紅細(xì)胞中的CK-MM很可能與肌肉與心肌來源的CK-MM在空間結(jié)構(gòu)與蛋白修飾上有所不同，因此不能被試劑盒中的抗體有效抑制，這可能是本研究中溶血標(biāo)本的CK活性檢測(cè)結(jié)果不受CK-M抑制抗體影響的主要原因。

通過本研究我們基本明確了溶血對(duì)CK-MB與CK活性檢測(cè)的影響，與文獻(xiàn)報(bào)道[12]一致。因此，在碰到它們的可疑結(jié)果時(shí)應(yīng)首先根據(jù)LDH、血清α-羥丁酸脫氫酶(alpha-hydroxybutyric dehydrogenase)等生化檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行溶血情況判斷，并盡可能根據(jù)我們的報(bào)道進(jìn)行校正[13]。另外，我們發(fā)現(xiàn)試劑盒中CK-M抑制抗體不能有效抑制紅細(xì)胞中的CK-M亞單位，是導(dǎo)致CK-MB活性檢測(cè)結(jié)果異常升高的主要原因。這也提示目前臨床實(shí)驗(yàn)室中所有基于CK-M抑制抗體的CK-MB活性檢測(cè)，都要經(jīng)過溶血干擾驗(yàn)證才能明確其結(jié)果的可靠性。同時(shí)，我們也建議在臨床上碰到重要的相關(guān)病情時(shí)，如急性心梗，應(yīng)當(dāng)利用基于質(zhì)量法的CK-MB蛋白水平檢測(cè)進(jìn)行復(fù)查或直接作為首選方法。