筆竹大小孢子發(fā)生及雌雄配子體發(fā)育研究

趙婉琪 國春策 王燕 肖姣 吳正春 劉海文 楊光耀 于芬

摘 要：? 為探討筆竹（Pseudosasa viridula）結(jié)實率低的原因，該文通過采用石蠟切片的方法結(jié)合顯微技術(shù)對筆竹大小孢子發(fā)生及雌雄配子體的發(fā)育過程進(jìn)行研究。結(jié)果表明：（1）筆竹的雄蕊多為3枚，極少有6枚，每枚花藥具有4個花粉囊。（2）花藥壁發(fā)育為基本型，由4層細(xì)胞構(gòu)成，由外向內(nèi)依次為表皮細(xì)胞、藥室內(nèi)壁細(xì)胞、中層細(xì)胞和絨氈層細(xì)胞，絨氈層發(fā)育為腺質(zhì)型。（3）小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂中的胞質(zhì)分裂為連續(xù)型，四分體為左右對稱型。（4）成熟花粉粒為2-細(xì)胞型和3-細(xì)胞型，出現(xiàn)畸形或空腔花粉粒，敗育多發(fā)生在花粉單核期。（5）筆竹的子房1室，胚珠倒生，珠被2層，厚珠心。（6）胚囊為蓼型，成熟胚囊由卵器、極核和3個反足細(xì)胞構(gòu)成。從大小孢子發(fā)生及雌雄配子體發(fā)育的整個過程看，雌蕊結(jié)構(gòu)完整，胚囊發(fā)育正常，而花粉敗育可能是導(dǎo)致結(jié)實率低的主要原因之一。該研究闡明了筆竹大小孢子發(fā)生及雌雄配子體發(fā)育過程，初步揭示了該物種低結(jié)實率的原因，為筆竹雜交育種研究提供了基礎(chǔ)資料。

關(guān)鍵詞： 筆竹， 大孢子發(fā)生， 小孢子發(fā)生， 雌配子體， 雄配子體

中圖分類號：? Q944.57

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2022）01-0143-09

收稿日期：? 2021-03-02

基金項目：? 江西省自然科學(xué)基金青年重點項目（20192ACB21005）;國家自然科學(xué)基金（31960051，31960336）? [Supported by? Natural Science Foundation for Young Scientists of Jiangxi Province （20192ACB21005）; National Natural Science Foundation of China （31960051， 31960336）]。

第一作者： 趙婉琪（1994-），碩士，主要從事竹類植物資源研究，（E-mail） wanqzhao@163.com。

*通信作者：? 于芬，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事竹類資源和竹子發(fā)育生物學(xué)研究，（E-mail） yufen930@163.com。

Sporogenesis and gametogenesis of Pseudosasa viridula

ZHAO Wanqi 1，2， GUO Chunce1，2， WANG Yan1， XIAO Jiao1，2， WU Zhengchun1，2，

LIU Haiwen1，2， YANG Guangyao1，2， YU Fen1，2*

（ 1. Forestry College of Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045， China; 2. Jiangxi Provincial Key

Laboratory for Bamboo Germplasm Resources and Utilization， Nanchang 330045， China ）

Abstract：? To reveal the causes of low seed-setting rate of Pseudosasa viridula， the process of sporogenesis and gametogenesis of? P. viridula were studied using traditional paraffin section and microscopy techniques. The results were as follows： （1） Each flower contained three anthers （rarely 6） and an anther with four pollen sacs. （2） The anther wall belonged to the basic type， which composed of four layers of cells， which were epidermis， endothecium， middle layer and tapetum from outside to inside. （3） The cytokinesis microspore mother cell in meiosis division in successive and the microspore tetrads were medially zygomorphic. （4）? Mature pollen grains were 2-cell type or 3-cell type， and some abortions occurred in the mononuclear stage of microspores. （5） Its ovary was unilocular， with parietal placenta was anatropous， double integument and crassinucellate. （6） The embryo sac was the polygonum type composed of an egg organ， a polar nucleus and three antipodal cells. The pistil structure was complete with embryo sac normal development， and the microspore abortion occurs in the single nuclear pollen stage. It is the typical male sterility and pollen abortion that may be the main reasons for the low seed-setting rate of P. viridula. This study clarified the process of sporogenesis and gametogenesis of P. viridula， and initially revealed the reasons for the low seed-setting rate of this species， which provides basic information for the study of cross breeding of P. viridula.

Key words： Pseudosasa viridula， megaspogenesis， microsporogenesis， female gametophyte， male gametophyte

竹子是禾本科多年生植物，開花是其生活史中的重要階段，大多數(shù)竹種需要經(jīng)過幾十年甚至上百年的營養(yǎng)生長才開花（Janzen，1976）。竹子開花不可預(yù)測，結(jié)實現(xiàn)象罕見，而且很多竹種開花后立即死亡，結(jié)實率極低或幾乎不結(jié)實（武劍等，2005），這些生理特性不僅對竹林生產(chǎn)經(jīng)營、生態(tài)功能產(chǎn)生極大危害，同時也給竹類植物胚胎發(fā)育研究造成嚴(yán)重困難。關(guān)于竹類植物胚胎學(xué)的報道始見于1902年Stapf初步闡述了象鼻竹（Melocanna bambusoides）的果實形態(tài)及解剖結(jié)構(gòu)。隨著科技日新月異的發(fā)展，到1984年，對毛竹（Phyllostachys edulis）胚胎學(xué)特征的首次報道，為國內(nèi)竹類植物胚胎學(xué)研究開辟了新方向（喬士義和廖光廬，1984）。近年來已有寒竹（Chimonobambusa marmorea）、巨龍竹（Dendrocalamus sinicus）、雷竹（Phyllostachys violascens ‘Prevernalis’）、鵝毛竹（Shibataea chinensis）、‘霞早’綠竹（Bambusa oldhami ‘Xia Zao’ ZSX）、元江箭竹（Fargesia yuanjiangensis）等20余種竹種生殖生物學(xué)研究相繼報道（胡成華等，1994;王曙光等，2006;黃堅欽等，2010;林樹燕和丁雨龍，2012;林樹燕等，2019;黃玲等，2020）。多數(shù)研究結(jié)果表明，許多竹類植物的雄蕊、雌蕊在發(fā)育過程中都會出現(xiàn)異常導(dǎo)致敗育，如雷竹受小孢子母細(xì)胞粘連導(dǎo)致減數(shù)分裂受阻，結(jié)實率僅為2%～5%（黃堅欽等，1999）;劉靜（2008）報道月月竹（Chimonobambusa sichuanensis）由于小孢子收縮過度造成結(jié)實率僅為1.39%;李潔（2013）對孝順竹（Bambusa multiplex）的研究結(jié)果表明，其子房、胚珠在發(fā)育早期均發(fā)生敗育且雌蕊結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致低結(jié)實率。此外，綿竹（Lingnania intermedia）受絨氈層過度發(fā)育影響造成花粉空腔，爬竹（Ampelocalamus scandens）和鵝毛竹等竹種也存在相關(guān)現(xiàn)象（王雨珺等，2017;龐延軍等，1994;林樹燕，2009）。

筆竹（Pseudosasa viridula）為禾本科竹亞科矢竹屬（Pseudosasa）竹種（耿伯介和王正平，1996），地下莖復(fù)軸混生，稈型通直，高約5 m，枝葉層次分明，葉寬且細(xì)長，色澤鮮嫩。該種自1993年由浙江移栽至江西農(nóng)業(yè)大學(xué)竹類植物種質(zhì)園。2018年，自然條件下筆竹出現(xiàn)連年開花現(xiàn)象，且花后結(jié)實極少，據(jù)統(tǒng)計結(jié)實率僅為0.12%，其結(jié)實率低的原因尚不明確。本文以筆竹為研究對象，從解剖學(xué)角度觀察其大小孢子發(fā)生及雌雄配子體的發(fā)育過程，探究其結(jié)實率低的原因，以期為竹類植物雜交育種及竹類植物生殖生物學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗樣地概況

試驗地位于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)竹類植物種質(zhì)園內(nèi)的筆竹林，地處江西省中部偏北位置，115°49′11″—115°49′23″ E、28°46′00″—28°46′30″ N，海拔為49.5 m，屬中亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，年均氣溫為17～17.7 ℃，極端最高氣溫為40.9 ℃，極端最低氣溫為-15.2 ℃，年日照時數(shù)為1 772～1 845 h，年平均降水量為1 567.7～1 654.7 mm。地形平坦，土壤類型為黏重紅壤，微酸性。竹林樣地面積約122 m2，共計523株筆竹。

1.2 試驗材料

取不同發(fā)育時期的筆竹小穗和小花，快速投入卡諾固定液內(nèi)并真空抽氣，2 d后置換至70%乙醇中并保存于4 ℃冰箱內(nèi)。

1.3 石蠟制片

（1）材料預(yù)染：制片前將固定好的材料取出，采用Ehrlichs蘇木精染色液將材料整染24～48 h。（2）脫水與透明：系列梯度乙醇脫水，每級15 min;二甲苯對材料進(jìn)行透明，每次20 min。（3）滲蠟和包埋：將石蠟切碎置于存有100%二甲苯的燒杯中，置于38 ℃烘箱內(nèi)過夜。次日將烘箱溫度調(diào)高至60 ℃，逐級將材料置換至100%石蠟中，每次2 h。（4）包埋。（5）材料切片：Leica RM 2235旋轉(zhuǎn)切片機切片，厚度為7～8 μm。（6）展片和烘片。（7）中性樹膠進(jìn)行封片。（8）觀察和拍照：將切片置于Zeiss AX10生物顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 筆竹小孢子的發(fā)生和雄配子體的發(fā)育

2.1.1 小孢子發(fā)生 筆竹大多數(shù)小花具有3枚雄蕊，極少數(shù)為6枚。約1 mm長度的幼嫩筆竹花藥的橫切面上顯示，此階段筆竹花藥還未進(jìn)行分化，花藥細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為簡單，最外層為表皮細(xì)胞，內(nèi)層則是一團(tuán)分生組織細(xì)胞（圖版I：A）;之后，位于筆竹花藥橫切面的4個角隅處的細(xì)胞分裂活動變得活躍，花藥形態(tài)向四個棱角突出，并在表皮下分化出體積大且核仁明顯的孢原細(xì)胞后進(jìn)入造孢細(xì)胞時期，孢原細(xì)胞平周分裂成初生壁細(xì)胞和初生造孢細(xì)胞（圖版I：B，C，D）;當(dāng)幼嫩的筆竹花藥的長度發(fā)育至約2 mm時，小孢子母細(xì)胞分化完成，其具有顯著區(qū)別于周圍其他細(xì)胞的特點為體積大、液泡不明顯、核大且顏色深;小孢子母細(xì)胞時期，花藥壁細(xì)胞層完全分化，由4層細(xì)胞組成，由外向內(nèi)依次為表皮細(xì)胞-藥室內(nèi)壁細(xì)胞-中層細(xì)胞-絨氈層細(xì)胞（圖版I：E，F(xiàn)）;筆竹的花藥為3～4 mm時，小孢子母細(xì)胞逐漸變成近橢圓形，此時開始進(jìn)入第1次減數(shù)分裂。第1次減數(shù)分裂開始到二分體形成，經(jīng)過前期 Ⅰ至末期Ⅰ，期間胞質(zhì)顏色變淡（圖版I：G，H，I，J，K，L）。第1次減數(shù)分裂多為縱向分裂，同源染色體相互分離，移至細(xì)胞兩端，減數(shù)分裂末期Ⅰ，產(chǎn)生細(xì)胞板將小孢子母細(xì)胞分隔為兩個子細(xì)胞，此時為二分體時期（圖版Ⅱ：A）。當(dāng)筆竹花藥長度通常為5 mm左右時，開始進(jìn)行第2次減數(shù)分裂（圖版Ⅱ：B，C），分裂結(jié)束形成了4個左右對稱的小孢子，并在各自周圍沉積形成胼胝質(zhì)壁，被相互分隔開（圖版Ⅱ：D，E）。隨著胼胝質(zhì)壁的降解，小孢子被釋放出來，形成各自獨立的個體。

2.1.2 雄配子體發(fā)育 雄配子體發(fā)育初期，剛被釋放出的小孢子細(xì)胞核居中，為中央期（圖版Ⅱ：F，G）;之后經(jīng)過進(jìn)一步發(fā)育，小孢子的中央大液泡逐漸形成，細(xì)胞核被擠至細(xì)胞邊緣，此階段為單核靠邊期，這一時期筆竹的花藥長度通常為6 mm。隨著小孢子的發(fā)育，絨氈層細(xì)胞開始逐漸自我解體，其原生質(zhì)體始終都保持在同一位置，絨氈層細(xì)胞發(fā)育類型為腺質(zhì)型，通過分泌和自溶為小孢子的發(fā)育供給營養(yǎng)物質(zhì)（圖版Ⅱ：H）。之后，筆竹的小孢子開始有絲分裂，形成2個大小不等的細(xì)胞：貼近細(xì)胞壁一側(cè)的體積較小且呈凸透鏡狀的細(xì)胞為生殖細(xì)胞，位于中央的體積較大的為營養(yǎng)細(xì)胞，彼此之間被細(xì)胞壁隔開，形成2-細(xì)胞花粉，此階段筆竹花藥長度通常為6～7 mm（圖版Ⅱ：I）。此后生殖細(xì)胞逐漸從邊緣移向中央，并進(jìn)行第2次有絲分裂，形成兩個精細(xì)胞，形成3-細(xì)胞花粉（圖版Ⅱ：J）;隨著花粉的發(fā)育，絨氈層在此期間逐步降解并被吸收，并為成熟花粉發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)?；ǚ郯l(fā)育過程中存在不同程度的敗育，部分花粉粒發(fā)生嚴(yán)重皺縮（圖版Ⅱ：K）。此外，存在空腔花粉，形狀較扁，部分花粉腔內(nèi)無內(nèi)含物（圖版Ⅱ：L）。

2.2 筆竹大孢子的發(fā)生和雌配子體的發(fā)育

2.2.1 大孢子發(fā)生 筆竹的子房呈橢圓形，上端由花柱連接3叉羽毛狀柱頭，外壁光滑，子房1室，倒生胚珠，珠被2層，厚珠心。發(fā)育初期，在珠心表皮下形成一個細(xì)胞，其形態(tài)顯著區(qū)別于其他細(xì)胞，細(xì)胞體積大，細(xì)胞核較大且居中，細(xì)胞質(zhì)濃厚，即孢原細(xì)胞;大孢子母細(xì)胞由孢原細(xì)胞直接發(fā)育，其細(xì)胞核增大（圖版Ⅲ：A）;之后，大孢子母細(xì)胞開始進(jìn)入減數(shù)分裂階段（圖版Ⅲ：B）;經(jīng)過第1次減數(shù)分裂，大孢子母細(xì)胞的染色體一分為二，形成二分體（圖版Ⅲ：C）;第2次減數(shù)分裂時二分體的兩個細(xì)胞各自分裂在沿著珠孔下方的珠心形成四分體（圖版Ⅲ：D）。

2.2.2 雌配子體發(fā)育 筆竹的成熟胚囊為蓼型。功能大孢子的發(fā)育是雌配子體形成的起源，隨著功能大孢子發(fā)育，大孢子的細(xì)胞核開始進(jìn)行一次有絲分裂，分裂出的2個細(xì)胞分別向細(xì)胞兩端移動，形成2核胚囊（圖版Ⅲ：E）;第2、第3次有絲分裂過程中，接連發(fā)育出4核胚囊和8核胚囊;珠孔端和合點端各有1個細(xì)胞核向胚囊中央游移，組成極核，靠近合點端的3個細(xì)胞組成反足細(xì)胞（圖版Ⅲ：F）;位于珠孔端的3個細(xì)胞核呈“品”形，包括1個卵細(xì)胞和2個助細(xì)胞共同組成卵器;反足細(xì)胞、中央細(xì)胞核和卵器共同組成成熟胚囊，即表明雌配子體形成。

3 討論與結(jié)論

有性生殖過程正常進(jìn)行對其生命延續(xù)和種群拓展具有關(guān)鍵影響， 被子植物大小孢子發(fā)育及雌雄配子體發(fā)育過程中任一階段發(fā)生異常都可能導(dǎo)致敗育，從而影響授粉受精（邵曉雪，2016）。柳正葳等（2006）對石蒜 （Lycoris radiata）進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，小孢子減數(shù)分裂異常和絨氈層細(xì)胞延遲退化導(dǎo)致石蒜花粉敗育;水稻（Oryza sativa）發(fā)育過程中大小孢子第一次有絲分裂異常造成胚囊退化和花粉敗育（朱曉紅等，1996）;水仙（Narcissus tazetta）花而不實的根本原因是由于小孢子減數(shù)分裂異常及96%的胚囊敗育。許多竹類植物的雄蕊和雌蕊在發(fā)育過程中都會出現(xiàn)異常導(dǎo)致花后少量結(jié)實甚至有部分竹種不結(jié)實，不僅對竹林更新復(fù)壯及竹類植物種植資源多樣性造成嚴(yán)重影響，同時還給竹類植物的胚胎發(fā)育研究工作帶來了極大困難（表1）。

雌配子體的正常發(fā)育是植物成功授粉受精的必要前提，雌蕊發(fā)育異常會導(dǎo)致竹類植物不結(jié)實，雌蕊發(fā)育異常類型主要有以下3種：（1）雌蕊結(jié)構(gòu)缺失;（2）花柱發(fā)育異常，與子房發(fā)生粘連;（3）雌蕊發(fā)育過程中，子房發(fā)育異常（林樹燕，2009）。雌蕊異?，F(xiàn)象常見于叢生竹，如李潔（2013）對孝順竹雌蕊發(fā)育的研究中發(fā)現(xiàn)子房發(fā)育異常、結(jié)構(gòu)缺失，這是影響結(jié)實率的原因;袁金玲等（2004）研究發(fā)現(xiàn)綠竹屬（Bambusa）3個竹種的雌蕊結(jié)構(gòu)退化而難以結(jié)實;雌蕊發(fā)育異常、柱頭可授性弱是水竹（Phyllostachys heteroclada）產(chǎn)生花而不實現(xiàn)象的根本原因（王小紅，2007）。本研究中筆竹的雌蕊結(jié)構(gòu)正常，由柱頭、花柱和子房構(gòu)成，為單心皮單室，胚珠倒生，胚囊為蓼型，與月月竹（劉靜，2008）、麻竹（Dendrocalamus latiflorus）（鐘遠(yuǎn)標(biāo)，2016）、巨龍竹（王曙光等，2006）等竹類植物類型一致。胚囊發(fā)育、結(jié)構(gòu)正常。

花粉與植物遺傳繁育具有緊密聯(lián)系，植物中出現(xiàn)花粉敗育的現(xiàn)象十分普遍，即小孢子發(fā)生異常而產(chǎn)生發(fā)育不良或敗育的花粉，研究報道主要以農(nóng)作物為主，如水稻花粉發(fā)育不同階段存在典型、染敗和圓敗3種形態(tài)的敗育（朱英國，1979）;小麥（Triticum aestivum）等禾本科作物的花粉敗育多出現(xiàn)在減數(shù)分裂前期、小孢子母細(xì)胞增殖期及單核花粉晚期，在這些時期花粉DNA的合成因其新陳代謝旺盛、生理活性強，需要消耗大量營養(yǎng)物質(zhì)，同時易受到內(nèi)在遺傳因素及各種生理條件的影響，從而發(fā)生敗育（利容千，1978）。竹類植物的花粉普遍存在敗育現(xiàn)象，主要有以下2種：（1）花藥壁發(fā)育正常，但花粉發(fā)育異?；驘o花粉粒;（2）花藥壁和小孢子發(fā)育均異常。李娟等（2020）對硬頭黃竹（Bambusa rigida）的花藥結(jié)構(gòu)進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)以上不同形態(tài);劉靜（2008）發(fā)現(xiàn)小孢子異常收縮造成月月竹花粉活性低;黃堅欽等（1999）發(fā)現(xiàn)雷竹小孢子母細(xì)胞發(fā)育粘連和絨氈層發(fā)育停滯造成花粉敗育。筆竹成熟花粉粒同時存在2-細(xì)胞型和3-細(xì)胞型花粉粒，與毛竹（周建梅等，2016）、月月竹（劉靜，2008）的花粉特性相同。筆竹花粉的發(fā)育過程存在不同程度的敗育現(xiàn)象，部分花藥的4個藥囊內(nèi)幾乎都有畸形花粉，存在空腔花粉，僅有少數(shù)正?；ǚ哿！Ｆ渲?，出現(xiàn)敗育多發(fā)生在筆竹花粉單核期，而在此之前，小孢子的發(fā)育正常。此外，花藥壁發(fā)育和絨氈層降解的時間都正常。在巨龍竹、鵝毛竹和麻竹（王曙光等，2006;林樹燕，2009;鐘遠(yuǎn)標(biāo)，2016）等竹種中也發(fā)現(xiàn)類似的花粉敗育現(xiàn)象。福建茶桿竹（Pseudosasa amabilis）結(jié)實率也低，敗育一般以淺染型為主，即空腔、無活力的花粉居多，敗育率為32%。筆竹花粉敗育類型與其一致，但敗育率更高，可達(dá)44%（林樹燕等，2008;趙婉琪等，2019）。因此，花粉敗育是造成筆竹結(jié)實率低的主要原因之一。

竹類植物開花后，竹林的更新主要有有性更新和無性更新兩種方式（林樹燕和毛高喜，2007）。有些竹種開花后從竹鞭形成幼株，進(jìn)而更新;有些竹種花后老的竹株死亡，竹鞭也不在形成新的竹株，竹林更新主要依靠形成的種子繁殖，形成新的竹株，進(jìn)行竹林更新。通過表1來看，大部分以無性更新為主的竹種在有性生殖過程中存在敗育現(xiàn)象，且結(jié)實率普遍較低或不結(jié)實（張家賢等，1992;秦自生和Alan，1995;黃新紅，2008;林新春等，2010;林樹燕和丁雨龍，2013）。有研究表明栽培竹種的結(jié)實率顯著低于野生竹種，杜凡等人統(tǒng)計了云南68種開花竹種，發(fā)現(xiàn)僅10%的野生竹種花后不結(jié)實，而栽培竹種“花而不實”達(dá)到73%，他認(rèn)為這可能是由于栽培品種在經(jīng)歷長期無性繁殖后，其有性繁育機能逐漸退化的結(jié)果（杜凡等，2000）。此外， 蟲害亦是影響竹子結(jié)實率的不可忽視的重要

因素（秦自生和Alan，1995;王小紅等，2009）。而筆竹開花后竹林內(nèi)從竹鞭發(fā)出新的竹株，竹林更新主要依靠竹鞭形成新竹完成。根據(jù)我們先前對筆竹開花特性的觀測結(jié)果來看，筆竹有近50%的花受到蟲害，蟲害也是主要影響結(jié)實率的重要因素（趙婉琪等，2020）。竹類植物結(jié)實率低與竹種開花習(xí)性、花粉和胚囊的發(fā)育是否正常、花粉生活力、傳粉有效性及受精是否親和等多方面因素緊密相關(guān)，敗育可能是影響結(jié)實率的主要原因之一，但竹類植物敗育機制目前仍尚未明確，值得進(jìn)一步深入研究。

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（責(zé)任編輯 李 莉）

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