低氧環(huán)境下VEGF及其受體的造血調(diào)控作用及機(jī)制研究進(jìn)展*

李治材 肖軍 李翠瑩

低氧是一個常見的不利環(huán)境因素，機(jī)體通過調(diào)節(jié)各種應(yīng)激因子以抵抗這種環(huán)境所帶來的影響。低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factors，HIFs）是最主要感受低氧的轉(zhuǎn)錄因子，主要包括HIF-1α和HIF-2α，通過調(diào)控其下游靶基因EPO（促紅細(xì)胞生成素）、VEGF、血管內(nèi)皮生長因子受體1（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR-1，又稱fms樣酪氨酸激酶1，F(xiàn)lt-1）、血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor2，VEGFR-2，又稱胎肝激酶1，F(xiàn)lk-1，又稱KDR）的表達(dá)，增加紅細(xì)胞生成和血管生成以改善組織缺氧。然而，長期處于低氧環(huán)境，會引起紅細(xì)胞的過度增生，導(dǎo)致血液黏度增加，血液動力學(xué)改變，反而加重低氧。一般認(rèn)為，EPO是調(diào)控低氧環(huán)境下紅細(xì)胞生成的重要因素，其對低氧下紅細(xì)胞過度積累發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。然而，近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)EPO與紅細(xì)胞生成并不完全相關(guān)，EPO也無法解釋所有的紅細(xì)胞生成增加[1]；VEGF是一種與血管生成和造血密切相關(guān)的生長因子，涉及Ras/MAPK、PI3K-AKT、Stat3等與細(xì)胞增殖分化相關(guān)的多條信號通路，VEGF及其受體VEGFR-1、VEGFR-2的過度表達(dá)常常與異常造血有關(guān)[2]。因此，本文對低氧條件下VEGF在造血中的作用進(jìn)行梳理和闡述，以期望對低氧和造血相關(guān)疾病提供更豐富的認(rèn)識和更多的治療思路。

1VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2的結(jié)構(gòu)功能及表達(dá)

1.1VEGF及其受體VEGFR-1、VEGFR-2的結(jié)構(gòu)與功能：VEGF是一類分泌性糖蛋白，包括VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE和胎盤生長因子（plasma placental growth factor，PLGF）等成員。其中，關(guān)于VEGFA的研究是最廣泛的，VEGFA是一個分子質(zhì)量在34-42KD，由反平行多肽構(gòu)成的同源二聚體，中間由兩個二硫鍵連接。VEGFA根據(jù)不同的剪切形式又可形成不同的亞類，如VEGFA121、VEGFA165、VEGFA189、VEGFA206等，其中VEGFA165是人體內(nèi)含量最多分布最廣泛的亞類[3]。研究表明，VEGF主要是通過與其受體結(jié)合后進(jìn)行相應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而發(fā)揮促進(jìn)造血的作用。與VEGFA結(jié)合的主要是VEGFR-1和VEGFR-2，它們同屬于典型的Ⅲ型酪氨酸激酶受體，由一個（Ig）同源結(jié)構(gòu)域組成的胞外區(qū)、一個跨膜結(jié)構(gòu)和一個裂解酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域；VEGFA與其受體Ig樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使受體的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)象發(fā)生改變，受體被激活，底物蛋白發(fā)生磷酸化，激活下游的Ras/MAPK、Stat3、PI3K/AKT等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，影響細(xì)胞增殖、分化，在一些血液系統(tǒng)惡性增殖性疾病中，如淋巴瘤、白血病等，異常腫瘤細(xì)胞VEGF、VEGFR-2表達(dá)升高。此外，VEGFR-1、VEGFR-2在體內(nèi)還存在可溶型（sVEGFR）形式，通過拮抗VEGF，降低VEGF水平，抵抗血管生成和造血[4]。

1.2VEGF及其受體VEGFR-1、VEGFR-2與低氧的關(guān)系：VEGF是公認(rèn)的血管生成因子，其產(chǎn)生主要受HIFs的調(diào)節(jié)。HIFs是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞低氧反應(yīng)的核心氧感受因子，由功能亞基（HIF-1α、HIF-2α）和調(diào)節(jié)亞基（HIF-β）共同參與低氧應(yīng)答。常氧條件下，HIF-α被脯氨酰羥化酶（PHD）羥基化，然后與腫瘤抑制因子（VHL）結(jié)合，最終被泛素化降解；低氧條件下，PHD活性受到抑制，HIF-α進(jìn)入細(xì)胞核與HIF-β形成二聚體，結(jié)合低氧反應(yīng)元件（HRE）調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，HIF-1α與HIF-2α有著部分共同的靶基因，但其在低氧下對這些靶基因的調(diào)控卻又相互獨(dú)立。目前認(rèn)為，VEGF主要受HIF-1α調(diào)控，而VEGFR-1、VEGFR-2則主要受HIF-2α調(diào)控[5-6]。HIF-1α在低氧早期以及嚴(yán)重缺氧時活性最高，通過與靶基因VEGF、EPO轉(zhuǎn)錄相關(guān)區(qū)域結(jié)合啟動最初的低氧反應(yīng)。而在慢性缺氧條件下是由HIF-2α調(diào)節(jié)下游基因EPO、VEGFR-1、VEGFR-2的表達(dá)[7]。

2血管內(nèi)皮生長因子及其受體與造血

2.1骨髓內(nèi)皮細(xì)胞在造血中的作用：骨髓內(nèi)皮細(xì)胞是骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分，骨髓內(nèi)皮細(xì)胞和血管周圍細(xì)胞共同構(gòu)成血管周生態(tài)位，通過表達(dá)白細(xì)胞介素-6（interleukin6，IL-6）、干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）等因子調(diào)控造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs）、造血祖細(xì)胞（hematopoietic progenitor cells，HPC）的自我更新和分化[8]。研究證明造血重建與內(nèi)皮細(xì)胞的再生有關(guān)，骨髓內(nèi)皮細(xì)胞可以產(chǎn)生多種細(xì)胞因子并支持人體外CD34陽性細(xì)胞的增殖和分化，注射自體或者異源的內(nèi)皮細(xì)胞可以促進(jìn)放射清髓后的造血干細(xì)胞恢復(fù)和重建[9]。在體內(nèi)，骨髓內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)HSC維持和再生所需的生長因子，包括SCF、趨化因子CXCL12和多效生長因子（pleiotrophin）[10]，從內(nèi)皮細(xì)胞中條件性敲除這些因子會使骨髓中的HSC明顯減少，在慢性骨髓增生性腫瘤中發(fā)現(xiàn)攜帶JAK2V617F基因突變的內(nèi)皮細(xì)胞與異常造血相關(guān)，并能增加患者骨髓HSPC對輻射的耐受性[11]。VEGFR-2存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞，對內(nèi)皮細(xì)胞功能的發(fā)揮非常重要，VEGFR-2陽性的血竇內(nèi)皮細(xì)胞被認(rèn)為是放療后造血干細(xì)胞恢復(fù)所必需的，HOOPER等發(fā)現(xiàn)骨髓血竇內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VEGFR-2，內(nèi)皮VEGFR-2缺失的小鼠在接受全身輻照后骨髓血管再生和造血恢復(fù)受到明顯抑制，注射VEGFR-2抗體也可以抑制造血干細(xì)胞的恢復(fù)[12]。此外，骨髓的內(nèi)皮功能也會受到其他因素的影響，進(jìn)而影響造血；心血管方面的疾病如高血壓、動脈粥樣硬化、心肌梗死等會引起骨髓內(nèi)皮功能障礙、滲漏，重塑血管骨髓生態(tài)位，刺激造血和炎性白細(xì)胞的產(chǎn)生[13-14]，HEYDE等也同樣發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化患者HSC、髓系共同祖細(xì)胞增殖率明顯升高[15]。以上研究表明，骨髓內(nèi)皮細(xì)胞對造血的維持是必不可少的，內(nèi)皮細(xì)胞影響骨髓造血。

2.2血管內(nèi)皮生長因子及其受體在胚胎造血中的作用：胚胎造血發(fā)生在氧濃度為1%～5%的子宮內(nèi)，子代通過胎盤屏障獲得的氧氣較少，子宮中的生理性低氧環(huán)境對胚胎期造血的發(fā)育起到?jīng)Q定性作用。低氧環(huán)境下，HIF控制著對下游靶基因VEGF、VEGFR-2、TGF-β的表達(dá)，敲除HIF-1α基因的小鼠，在胚胎發(fā)育E9.5～E12.5會出現(xiàn)心血管、造血系統(tǒng)發(fā)育不全而死亡[16]。VEGF及其受體對胚胎造血發(fā)育也發(fā)揮著重要作用，敲除小鼠VEGF或受體VEGFR-2都會導(dǎo)致胚胎致死，同時伴隨著造血發(fā)育的異常，VEGF缺乏一個等位基因的小鼠在11 d～12 d之間的胚胎發(fā)育過程中缺乏足夠的內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞而死亡；純合VEGFR-2的缺失小鼠在胚胎8.5 d～9.5 d之間死亡，伴隨著中胚層造血細(xì)胞分化的阻滯，不能遷移形成血島[17]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，中胚層前體階段內(nèi)皮和造血發(fā)育需要VEGF，外源性VEGF有利于造血和內(nèi)皮標(biāo)志物的表達(dá)[18]。另外，VEGF在胚胎干細(xì)胞紅系分化方面也有一些發(fā)現(xiàn)，CERDAN等誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hESCs）分化的研究顯示，VEGF的添加特異性增加了紅系集落形成單位（erythroid colony forming units，CFU-E）的數(shù)量，并促進(jìn)了SCL/TAL-1基因的表達(dá)，在誘導(dǎo)7 d時，表達(dá)血型糖蛋白A（CD235a）和CD34的細(xì)胞數(shù)量高出對照3倍[19]。LIANG等在斑馬魚胚胎發(fā)育中觀察到，注射VEGF mRNA的斑馬魚胚胎中，VEGFR-2、SCL、GATA1轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生明顯增加，血紅蛋白染色明顯增強(qiáng)[20]。上述研究表明，低氧是胚胎造血發(fā)育的重要環(huán)境因素，低氧下VEGF促進(jìn)胚胎干細(xì)胞來源的早期紅細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)以及紅系祖細(xì)胞的自我更新。

2.3血管內(nèi)皮生長因子及其受體在成體造血中的作用：骨髓是成體造血的主要器官，由骨髓造血細(xì)胞和骨髓微環(huán)境構(gòu)成。骨髓微環(huán)境最大的特點(diǎn)就是低氧，其氧濃度僅為1%～6%，低氧環(huán)境下細(xì)胞HIFs水平增加，有利于骨髓細(xì)胞表達(dá)VEGF和VEGFR-2，骨髓微環(huán)境中VEGF濃度明顯高于外周血[21]。VEGF與造血細(xì)胞表面的VEGFR結(jié)合，直接參與造血調(diào)控[22]。在骨髓造血細(xì)胞中，CD34陽性造血干/祖細(xì)胞表面均表達(dá)VEGFR-1和VEGFR-2，而向各系分化后，VEGFR-2表達(dá)迅速減少，而VEGFR-1廣泛表達(dá)于紅系前體細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞以及巨核細(xì)胞表面[23]。目前認(rèn)為，VEGF內(nèi)分泌途徑對調(diào)節(jié)HSC存活也有重要作用，VEGF基因敲除后小鼠HSCs的存活率、集落形成能力和增殖率降低，并且使用可溶性VEGFR-1（sVEGFR-1）拮抗VEGF后對HSCs存活率僅有較小的影響，表明內(nèi)分泌途徑能夠促進(jìn)HSCs的存活[24]。在慢性高原病中研究發(fā)現(xiàn)，慢性高原病患者骨髓細(xì)胞HIF-2α顯著升高，骨髓組織和血漿中VEGF的濃度也顯著升高，且VEGF與氧飽和度（SaO2）呈負(fù)相關(guān)，與血紅蛋白（Hb）濃度呈正相關(guān)[25-26]。SU等研究證實，HIF-2α與骨髓組織VEGF、骨髓單個核細(xì)胞（BMMNCs）VEGFR-2的表達(dá)呈正相關(guān)，VEGFR-2的表達(dá)有利于紅細(xì)胞生成和骨髓微血管形成[21]。

關(guān)于VEGF受體的研究表明，VEGFR-1主要與造血干細(xì)胞動員、遷移有關(guān)，并參與造血重建，藥物阻斷VEGFR-1表達(dá)后，骨髓表現(xiàn)為造血干細(xì)胞增殖、分化受抑制，骨髓造血重建失敗[27]。小鼠體內(nèi)實驗證實，VEGF缺陷的造血干細(xì)胞移植無法重建受到輻射破壞的造血系統(tǒng)，而在體內(nèi)刺激VEGFR-1完全逆轉(zhuǎn)了這種現(xiàn)象[28-29]。因此，VEGFR-1因此也被證實可參與調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的細(xì)胞周期和分化，是促進(jìn)造血干細(xì)胞動員的重要分子。VEGFR-2是VEGF發(fā)揮功能的主要受體，在促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，成年鼠VEGF缺乏導(dǎo)致HSC數(shù)量的大量減少，用VEGF突變體特異性激活VEGFR-2能夠提高HSC的存活率，促進(jìn)其自我更新[30]；近年來有觀點(diǎn)認(rèn)為，VEGFR-2可能是HSC的一個關(guān)鍵性標(biāo)志，不僅是因為造血細(xì)胞起源于造血內(nèi)皮，更重要的是它具有長期增殖和多向分化的能力[31-32]。已有研究發(fā)現(xiàn)表明成體中的內(nèi)皮祖細(xì)胞亦可來源于CD34+VEGFR-2+的細(xì)胞群，體外誘導(dǎo)實驗表明，CD34+VEGFR-2+細(xì)胞群不但能在單細(xì)胞水平上產(chǎn)生造血克隆和內(nèi)皮細(xì)胞克隆，而且該細(xì)胞群具有長期擴(kuò)增能力，顯示出原始干細(xì)胞的典型特征[33]。ZIEGLER等人研究發(fā)現(xiàn)，CD34+VEGFR-2+的骨髓細(xì)胞是造血干細(xì)胞的重要來源，CD34+VEGFR-2陰性的細(xì)胞群往往只具有短期造血的功能，VEGFR-2是HSC長期再增殖的關(guān)鍵標(biāo)志物，因而提出將VEGFR-2作為造血干細(xì)胞的重要鑒定指標(biāo)之一[34]。在造血分化方面，VEGF-A超等位基因雜合小鼠骨髓培養(yǎng)物中觀察到CFU-E數(shù)量顯著升高，并且這種升高能夠被VEGFR-2的中和抗體阻斷，且VEGF僅對CFU-E的數(shù)量和大小有直接的促進(jìn)作用[35]；在巨核細(xì)胞中的研究也證實，VEGFR-2抑制劑可導(dǎo)致巨核細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的顯著減少，減少了巨核細(xì)胞的分化[30]。以上研究表明，低氧是造血細(xì)胞表達(dá)VEGF和VEGFR的必要環(huán)境，VEGFR對造血干、祖細(xì)胞存活、增殖以及造血細(xì)胞分化方面產(chǎn)生重要的影響。

2.4血管內(nèi)皮生長因子及其受體對惡性腫瘤性疾病造血功能的影響：低氧是腫瘤微環(huán)境十分常見的現(xiàn)象，低氧環(huán)境有利于白細(xì)胞介素6、轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）、血管內(nèi)皮生長因子等細(xì)胞因子分泌，在非小細(xì)胞肺癌患者癌組織中HIF-2α、VEGF均明顯高于癌旁組織，并且HIF-2α與VEGF之間呈明顯的正相關(guān)[36]。另有研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤中均有高表達(dá)，腫瘤衍生的VEGF進(jìn)入循環(huán)并作用于內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞以調(diào)節(jié)血管生成和造血，循環(huán)VEGF促進(jìn)骨髓中VEGFR-1陽性的HSC動員到外周血，并進(jìn)入脾臟造血，導(dǎo)致腫瘤患者常常伴隨著脾大[37]；同時，由于骨髓HSC的數(shù)量減少，骨髓造血功能減弱，機(jī)體處于貧血狀態(tài)，而使用抗VEGF藥物可顯著改善患者的骨髓造血和貧血狀況。小鼠中的研究有著同樣的結(jié)果，在給小鼠植入能產(chǎn)生VEGF的腫瘤細(xì)胞14 d后，小鼠骨髓造血細(xì)胞減少，外周血VEGF升高并伴隨著嚴(yán)重貧血，外周血分析顯示血細(xì)胞比容顯著降低，外周血血紅蛋白和紅細(xì)胞數(shù)量顯著降低，髓外造血旺盛，肝脾腫大，含有高密度的成紅細(xì)胞和網(wǎng)織紅細(xì)胞[38]。此外，VEGF及其受體的過表達(dá)常見于血液系統(tǒng)惡性腫瘤[39]，VEGFR-2在紅白血病細(xì)胞中表達(dá)升高，同時脾臟基質(zhì)細(xì)胞分泌的VEGF顯著增加，體外實驗表明，VEGF增加了小鼠紅白血病細(xì)胞的增殖率[35]，用針對VEGF的中和抗體治療的紅白血病小鼠生存期更長[40]，在人紅白血病細(xì)胞（TF1）中的研究證實，外源性VEGF刺激VEGFR-2能夠誘導(dǎo)細(xì)胞增 殖和存活[30]。近期的臨床研究發(fā)現(xiàn)VEGF及其受體與淋巴瘤的發(fā)展存在相關(guān)性，淋巴瘤診斷初期血清VEGF較低，經(jīng)治療后，血清VEGF顯著升高[41]。上述研究表明，VEGF及其受體在惡性腫瘤性疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，同時可能對造血系統(tǒng)產(chǎn)生影響。

3結(jié)語與展望 通過以上研究可以看出，低氧環(huán)境對VEGF及其受體的表達(dá)至關(guān)重要，而后者參與對造血發(fā)育的調(diào)控，通過誘導(dǎo)與造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)胚胎早期造血；通過細(xì)胞表面受體VEGFR-1和VEGFR-2參與HSC的動員、造血重建，調(diào)控造血細(xì)胞的增殖、分化，而VEGF及其受體的異常往往會對造血產(chǎn)生不良結(jié)局。同時，VEGF內(nèi)分泌途徑影響造血干細(xì)胞存活的研究提示我們，VEGF發(fā)揮作用既有內(nèi)部途徑，又有外部途徑，體現(xiàn)了VEGF及其信號通路調(diào)控細(xì)胞增殖分化功能的廣泛性與復(fù)雜性。從多個角度思考VEGF信號對細(xì)胞的影響將是我們研究與之相關(guān)腫瘤性疾病發(fā)生的重要出發(fā)點(diǎn)，并為治療這些疾病帶來新的靶點(diǎn)和更有效的方式。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突