普通青霉D12和羅伊氏乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)物促進(jìn)平邑甜茶幼苗生長和連作土壤生物環(huán)境改善

張 榮，黃君霞，段亞楠，王海燕，王 玫，陳學(xué)森，沈 向，尹承苗，毛志泉

（作物生物學(xué)國家重點(diǎn)試驗(yàn)室/山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018）

我國已成為名副其實(shí)的蘋果生產(chǎn)大國[1]。隨著蘋果產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，尤其是蘋果新品種的不斷更新以及矮化密植技術(shù)的推廣，蘋果連作障礙又稱蘋果再植病，成為我國蘋果產(chǎn)區(qū)重茬栽培時普遍發(fā)生的一種綜合病[2]，具體表現(xiàn)為再植蘋果幼樹的根系不健康、生長慢、植株矮小、病蟲害加重，嚴(yán)重時導(dǎo)致整樹死亡[3]，對蘋果產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展造成非常不利影響[4]。多數(shù)研究認(rèn)為，連作障礙的發(fā)生與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡有密切聯(lián)系，最顯著的表現(xiàn)為連作土壤中有害真菌數(shù)量的增加，有益細(xì)菌數(shù)量減少[3,5–7]。大量研究表明，鐮孢屬(Fusarium)真菌是蘋果連作障礙中最常見的有害菌，在中國、南非、意大利等蘋果產(chǎn)區(qū)普遍存在且生命力強(qiáng)[6,8]。徐文鳳[9]和王功帥[10]分別從環(huán)渤海灣蘋果產(chǎn)區(qū)的老蘋果園以及連作蘋果園土壤中分離到大量鐮孢菌，通過致病性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對蘋果砧木平邑甜茶幼苗有強(qiáng)致病性。因此，抑制病原菌數(shù)量，改善土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)對防控連作障礙具有重要意義[11–12]。

在土壤中引入生防菌來改善微生物環(huán)境，對蘋果連作障礙進(jìn)行生物防治是一種綠色環(huán)保的方式。在蘋果連作障礙研究中，生防菌大多從健康蘋果樹根系及根際土壤中分離獲得，細(xì)菌多為枯草芽胞桿菌和假單胞桿菌，真菌有叢枝菌根真菌、木霉和青霉[13]，放線菌以鏈霉屬為主[14–15]?；旌衔⑸锓乐问且环N生物防治的新思路新熱點(diǎn)[16]，前人研究表明生防菌的混合使用比單一使用效果更好。Hammad等[17]曾報道用放線菌和細(xì)菌聯(lián)合可有效地防治黃瓜枯萎病。Latha等[18]研究表明綠色木霉 (Trichoderma viride)、熒光假單胞菌 (Pseudomonas fluorescens) 和枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)的組合使用在防治土傳病害的根腐病和莖腐病方面效果顯著。

劉錦霞等[19]研究表明互不拮抗的生防菌 2種和土壤改良菌 3種，以一定比例有效結(jié)合于有機(jī)介質(zhì)上制成多效微生物復(fù)合固體制劑，能夠有效改良干旱區(qū)連作馬鈴薯土壤的生態(tài)環(huán)境，防控病害，促進(jìn)植株生長，并提高產(chǎn)量和品質(zhì)。李恩琛等[20]研究表明復(fù)合生防細(xì)菌發(fā)酵液對蘋果主要病原菌抑制作用優(yōu)于單一菌株，并且具有較好的穩(wěn)定性。因此，利用多種微生物防治蘋果連作障礙有巨大的潛力，加上發(fā)酵產(chǎn)物制作工藝簡單，生產(chǎn)成本低，使用混合微生物發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行生物防治具有廣闊的市場前景。

青霉屬真菌和乳桿菌屬細(xì)菌作為生防菌使用的研究較少[21]，蘇前富等[22]研究表明微黃青霉ZF1 可用于防治玉米禾谷鐮孢莖腐病和穗腐病。有研究表明，乳桿菌屬(Lactobacillus)不僅可以抑制灰霉屬和鐮孢屬等真菌菌絲體和孢子的生長，還可以降解真菌毒素[23–24]。本研究將普通青霉D12和羅伊氏乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵，以蘋果常用砧木平邑甜茶為試材，在盆栽試驗(yàn)條件下研究普通青霉D12和羅伊氏乳桿菌及其混合發(fā)酵產(chǎn)物對平邑甜茶幼苗和連作土壤環(huán)境的影響，探討發(fā)酵產(chǎn)物對蘋果連作障礙的防控效果，為生物防控蘋果連作障礙提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

盆栽試驗(yàn)所用土壤取自山東省泰安市滿莊鎮(zhèn) 32年生的蘋果園，從距離蘋果樹干80 cm、深 10—40 cm 的區(qū)域，多點(diǎn)隨機(jī)取土，混勻。土壤質(zhì)地為砂土，有機(jī)質(zhì)含量為8.3 g/kg、硝態(tài)氮含量為11.76 mg/kg、銨態(tài)氮含量為5.76 mg/kg、速效鉀含量為116.6 mg/kg、速效磷含量為 10.4 mg/kg、土壤 pH 5.66。

本研究供試材料為蘋果常用砧木平邑甜茶(Malus hupehensis Rehd.)。2019年 1 月將用水浸泡過的種子與濕潤細(xì)沙混勻，于 4℃左右層積處理 40天，待種子萌動露白后在育苗盤中播種育苗。于四月中旬選取有6片真葉且長勢整齊無病蟲害的幼苗移栽到外徑 29 cm、內(nèi)徑 25 cm、高 18cm 的泥瓦盆中進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，每盆兩株幼苗，統(tǒng)一肥水管理。

普通青霉 D12 (Penicillium commune D12)由蘋果重茬與微生物實(shí)驗(yàn)室提供，其生物保藏號為CGMCC No. 11112。D12在PDA固體培養(yǎng)基接種活化7天，接種至PDA液體培養(yǎng)基，搖床125 r/min 25℃培養(yǎng)5天，即得D12發(fā)酵液，活菌數(shù)≥2×109CFU/mL，8層紗網(wǎng)過濾得上清液即D12發(fā)酵產(chǎn)物，于4℃保存。

羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)購自中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，保藏編號為CICC 6118。羅伊氏乳桿菌活化接入改良MRS培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)5天，即得羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液，活菌數(shù)≥3×109CFU/mL，羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液混勻至無沉淀，8000 r/min離心10 min，取上清液即得羅伊氏乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)物，于4℃保存。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)設(shè)置4個處理：連作土壤對照(CK)、施用D12發(fā)酵產(chǎn)物 (R1)、施用羅伊氏乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)物(R2)、兩個發(fā)酵產(chǎn)物1∶1混合施用 (R3)，每個處理20個重復(fù)。6月中旬按每盆80 mL施入相應(yīng)的發(fā)酵產(chǎn)物，之后進(jìn)行正常的肥水管理。各處理在施加相應(yīng)發(fā)酵產(chǎn)物后第38天(7月23日)、69天(8月23日)、100天(9月23日)取樣并測定相關(guān)指標(biāo)，每個處理隨機(jī)取3盆作為3個重復(fù)。取土樣時，去除表層土，取根圍土，混勻，過0.85 mm篩，制成3份平行樣品，一份自然風(fēng)干，用于測定土壤酶活性；一份用于測定微生物數(shù)量；一份存于 –80℃冰箱，用于提取DNA。取植株樣品時，將根部土壤輕輕抖落，用清水沖洗根部，迅速取白根，放入液氮中，用于測定根系保護(hù)性酶活性。將植株完整帶回，測定根系呼吸速率、株高、地徑、鮮重，烘干至恒重后，測定干重。

1.3 測定指標(biāo)

1.3.1 生物量使用卷尺、游標(biāo)卡尺、天平測量株高、地徑、鮮重及干重。

1.3.2 根系呼吸速率 (活力)參照毛志泉等[25]的方法使用Oxy-Lab 氧電極自動測定系統(tǒng)測定根系呼吸速率。

1.3.3 土壤酶活性脲酶活性測定采用比色法，過氧化氫酶測定采用滴定法，磷酸酶活性測定采用磷酸苯二鈉比色法，蔗糖酶活性測定采用比色法[26]。

1.3.4 根系保護(hù)性酶活性和根系丙二醛含量超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定采用氮藍(lán)四唑(NBT)法，過氧化物酶(POD)活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法，過氧化氫酶(CAT)活性的測定采用紫外吸收法，丙二醛含量的測定采用硫代巴比妥酸法[27]。

1.3.5 土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌真菌數(shù)量細(xì)菌、真菌數(shù)量的測定采用稀釋平板培養(yǎng)計數(shù)法[28]。細(xì)菌用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)1天后計數(shù)，真菌用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)3天后計數(shù)。

1.3.6 土壤微生物測定從處理后第100天的土壤樣品中取 0.25 g，用 MIO-BIO Power Soil DNA Isolation Kit土壤 DNA試劑盒按照試劑盒說明書所述步驟提取和純化土壤微生物DNA。用1.2% 瓊脂糖凝膠電泳對DNA樣品進(jìn)行檢測，檢測合格后進(jìn)行雙向測序，用真菌 ITS 區(qū)通用引物 ITS1-F (5′?CTT GGTCATTTAGAGGAAGTAA?3′) 和 ITS2-R(5′?GCTGCGTTCTTCATCGATGC?3′) 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，設(shè)計目標(biāo)區(qū)域和帶有 “ 5′Miseq 接頭-barcode-測序引物-特異引物-3′ ”的融合引物，并采用兩步 PCR擴(kuò)增的方法構(gòu)建文庫。用 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，采用 AXYGEN 公司 AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。之后用FTC-3000TM real-time PCR 儀進(jìn)行定量，將樣本按照等摩爾比混勻后完成文庫制備，使用Miseq測序儀將文庫進(jìn)行測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù) Barcode 序列和 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物序列從原始序列中分出各樣品數(shù)據(jù)，對其進(jìn)行拼接及質(zhì)控過濾，獲得優(yōu)化序列。利用軟件USEARCH和mothur以 97%的一致性將拼接好的序列聚類為OTU。利用軟件 mothur和QIIME對數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析，利用R語言繪圖。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用WPS 2019進(jìn)行計算和作圖，采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和差異顯著性檢驗(yàn)(鄧肯氏法，α = 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵產(chǎn)物對平邑甜茶幼苗生物量的影響

由表1可以看出，施用普通青霉D12和羅伊氏乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)物后促進(jìn)了平邑甜茶幼苗的生長，具體表現(xiàn)為R3>R1>R2>CK。發(fā)酵產(chǎn)物混合施用處理(R3)在促進(jìn)平邑甜茶幼苗生長方面效果顯著，其幼苗的株高、地徑、鮮重、干重與連作對照相比均差異顯著。施用微生物發(fā)酵產(chǎn)物后第100天，R1處理的幼苗株高、地徑、鮮重、干重與對照相比分別增加了3.9%、14.78%、23.28%、18.96%；R2處理幼苗的地徑、鮮重與干重與對照相比分別增加了14.36%、12.57%、13.75%；R3處理幼苗的株高、地徑、鮮重、干重與對照相比分別增加了7.7%、17.4%、50.82%、37.5%。

表1 施用發(fā)酵產(chǎn)物后不同天數(shù)平邑甜茶幼苗的生物量Table 1 Biomass of Malus hupehensis Rehd. seedlings in different days after application of fermentation products

2.2 不同發(fā)酵產(chǎn)物對平邑甜茶幼苗根系呼吸速率的影響

由圖1可以看出，與連作對照相比，施加發(fā)酵產(chǎn)物的3個處理均促進(jìn)了平邑甜茶幼苗的根系呼吸速率。第69天，R1、R2和R3處理差異不大，第38天和第100天R3處理平邑甜茶幼苗根系呼吸速率最高，與對照相比分別增加了19.20%、17.04%。

圖1 施用發(fā)酵產(chǎn)物后不同天數(shù)平邑甜茶幼苗根系呼吸速率Fig. 1 Root respiration rate of Malus hupehensis Rehd.seedlings in different days after application of fermentation products

2.3 不同發(fā)酵產(chǎn)物對土壤酶活性的影響

由表2可知，與對照相比，施用發(fā)酵產(chǎn)物后土壤酶活性均有不同程度的提高。土壤過氧化氫酶活性，在第38天各處理與連作對照相比無顯著差異；第69天差異顯著，R1和R2顯著高于CK，R3又顯著高于R1和R2；第100天R1顯著高于CK，R2和R3與CK差異不顯著。土壤蔗糖酶活性，在第38天各處理顯著高于連作對照。第38天脲酶活性和磷酸酶活性為R1和R3 處理顯著高于CK；第69天，脲酶活性R1、R2和R3各處理顯著高于CK，R1和R3 的磷酸酶活性顯著高于CK；第100天，各處理脲酶活性、磷酸酶活性和蔗糖酶活性顯著高于CK，其中R3處理與CK相比分別增加了66.67%、34.24%、25.49%。

表2 施用發(fā)酵產(chǎn)物后不同天數(shù)土壤酶活性Table 2 Soil enzyme activities in different days after application of fermentation products

2.4 不同發(fā)酵產(chǎn)物對平邑甜茶幼苗根系保護(hù)性酶活性和根系丙二醛含量的影響

由圖2可知，施用發(fā)酵產(chǎn)物后，平邑甜茶幼苗根系抗氧化酶活性均有不同程度的提高，其中以混合發(fā)酵產(chǎn)物處理(R3)促進(jìn)效果最好。第100天，R1處理的幼苗SOD、POD和CAT活性與連作對照相比分別增加了7.25%、79.61%、27.69%；R2處理的幼苗SOD和POD與連作對照相比分別增加了13.25%、60.81%； R3處理的幼苗的SOD、POD和CAT活性與連作對照相比分別增加了29.19%、92.62%、39.59%，丙二醛含量降低了23.40%。

圖2 施用發(fā)酵產(chǎn)物后不同天數(shù)平邑甜茶幼苗根系保護(hù)酶活性及丙二醛含量Fig. 2 SOD, POD, CAT activities, and MDA content in the roots of Malus hupehensis Rehd. seedling in different days after application of fermentation products

2.5 不同發(fā)酵產(chǎn)物對土壤中可培養(yǎng)微生物數(shù)量的影響

由表3可知，在施加發(fā)酵產(chǎn)物后，與連作對照(CK)相比，土壤中細(xì)菌數(shù)量顯著增加，真菌數(shù)量顯著降低。施用后第38天、69天和100天，普通青霉D12發(fā)酵產(chǎn)物處理(R1)土壤中細(xì)菌數(shù)量分別增加了38.18%、92.72%、94.20%，真菌數(shù)量分別降低了21.31%、29.63%、37.11%。羅伊氏乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)物處理(R2)土壤中細(xì)菌數(shù)量分別增加了50.02%、59.79%、61.17%，真菌數(shù)量分別降低了40.44%、31.48%、28.06%。發(fā)酵產(chǎn)物混合處理(R3)土壤中細(xì)菌數(shù)量分別增加了39.48%、101.24%、81.56%，真菌數(shù)量分別降低了45.58%、32.09%、24.43%。

表3 施用不同發(fā)酵產(chǎn)物后不同天數(shù)土壤中的細(xì)菌和真菌數(shù)量Table 3 Population of bacteria and fungi in soils at different days after application of fermentation products

2.6 不同發(fā)酵產(chǎn)物對土壤微生物環(huán)境的影響

由圖3主坐標(biāo)分析結(jié)果可以看出，沿PC1軸方向，對照與3個發(fā)酵產(chǎn)物處理明顯分開。沿PC2軸方向，單一發(fā)酵產(chǎn)物處理(R1、R2)與混合發(fā)酵產(chǎn)物處理(R3)明顯分開。PCoA分析結(jié)果進(jìn)一步表明，施用發(fā)酵產(chǎn)物對連作土壤真菌群落影響較大，并且單一發(fā)酵產(chǎn)物處理(R1、R2)與混合發(fā)酵產(chǎn)物處理(R3)對連作土壤真菌群落影響不同。

圖3 施用不同發(fā)酵產(chǎn)物后土壤真菌群落主坐標(biāo)分析Fig. 3 Principal coordinate analysis of soil fungi communities after application of different fermentation products

由圖4聚類分析結(jié)果可以看出，連作對照(CK)單獨(dú)一個分支說明施入發(fā)酵產(chǎn)物后土壤微生物群落發(fā)生改變，單一發(fā)酵產(chǎn)物處理(R1、R2)與混合發(fā)酵產(chǎn)物處理(R3)又分別處在不同的分支，說明單一發(fā)酵產(chǎn)物處理(R1、R2)與混合發(fā)酵產(chǎn)物處理(R3)對連作土壤真菌群落影響不同，與主坐標(biāo)分析結(jié)果相一致。

在屬水平，各處理土壤樣品中相對豐度前8的屬為未知Unclassified、腐質(zhì)霉屬Humicola、被孢霉屬M(fèi)ortierella、鐮孢菌屬Fusarium、鏈格孢屬Alternaria、普魯蘭久浩屬Guehomyces、枝孢菌屬Cladosporium、矛束孢屬Doratomyces(圖 4)。與對照相比，施加發(fā)酵產(chǎn)物后，土壤中腐質(zhì)霉屬Humicola、被孢霉屬M(fèi)ortierella的相對豐度增加，鐮孢菌屬Fusarium、鏈格孢屬Alternaria的相對豐度降低(表4)。與對照相比，發(fā)酵產(chǎn)物混合處理(R3)的土壤中腐質(zhì)霉屬Humicola、被孢霉屬M(fèi)ortierella的相對豐度分別增加了73.61%、137.72%，鐮孢菌屬Fusarium、鏈格孢屬Alternaria的相對豐度分別降低了52.48%、73.35%。

表4 施用不同發(fā)酵產(chǎn)物后土壤屬水平相對豐度(%)Table 4 Genus-level relative abundance of soils after application of different fermentation products

圖4 施用不同發(fā)酵產(chǎn)物后土壤聚類分析和屬水平相對豐度Fig. 4 Cluster analysis and genus-level relative abundance of soils after application of different fermentation products

2.7 平邑甜茶幼苗生理指標(biāo)與土壤酶活性、可培養(yǎng)微生物數(shù)量和微生物群落的相關(guān)性

從圖5可以看出，脲酶活性與平邑甜茶幼苗生物量、根系呼吸速率和根系保護(hù)性酶活性極顯著正相關(guān)，細(xì)菌數(shù)量、磷酸酶和蔗糖酶活性與平邑甜茶幼苗生物量、根系呼吸速率和根系保護(hù)性酶活性顯著正相關(guān)。真菌數(shù)量、鐮孢菌屬、鏈格孢屬和枝孢菌屬與平邑甜茶生物量、根系呼吸速率和根系保護(hù)性酶活性顯著負(fù)相關(guān)，其中與平邑甜茶幼苗地徑極顯著負(fù)相關(guān)。被孢霉屬與平邑甜茶幼苗地徑顯著正相關(guān)。普魯蘭久浩屬與根系呼吸速率和根系過氧化物酶活性顯著正相關(guān)。

圖5 Pearson相關(guān)性分析熱圖Fig. 5 Heat map of Pearson correlation analysis

3 討論

連作障礙的發(fā)生是土壤養(yǎng)分失衡、有害微生物增加、土壤性質(zhì)惡化、化感物質(zhì)積累和微生物區(qū)系劣變等因素綜合作用的結(jié)果[29]，并且連作障礙最直觀的表現(xiàn)就是植株的生長受到抑制。連作不僅抑制蘋果根系生長，還影響根系功能。連作土壤中常含有酚酸類物質(zhì)，當(dāng)其積累到一定濃度會對作物根系造成逆境脅迫，根系中積累過多的自由基會導(dǎo)致膜脂過氧化，進(jìn)而影響了膜的功能，降低了根系對營養(yǎng)元素和水分的吸收和運(yùn)輸，進(jìn)而影響根系活力，并且根系受影響程度高于地上部分[30–32]。本研究表明施用發(fā)酵產(chǎn)物能顯著地促進(jìn)平邑甜茶幼苗的生長，其效果表現(xiàn)為：混合發(fā)酵產(chǎn)物處理(R3)>普通青霉D12發(fā)酵產(chǎn)物處理(R1)>羅伊氏乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)物處理(R2)。并且施用發(fā)酵產(chǎn)物后平邑甜茶幼苗根系的呼吸速率顯著提高，抗氧化酶活性均有不同程度的提高，丙二醛含量降低，其中混合發(fā)酵產(chǎn)物處理效果最佳。叢韞喆等[16]研究發(fā)現(xiàn)擬康氏木霉和黑根霉混合發(fā)酵液對蘋果鏈格孢具有良好的抑菌效果，大田試驗(yàn)表明其混合發(fā)酵液能夠提高蘋果葉片防御相關(guān)酶SOD、POD以及PAL的酶活力，進(jìn)而有效防治蘋果斑點(diǎn)落葉病。周登博[33]研究表明，復(fù)合拮抗菌發(fā)酵液能降低香蕉枯萎病的發(fā)病率，且防病效果與酶活性呈正相關(guān)?？梢姲l(fā)酵產(chǎn)物施入土壤后，改善了土壤環(huán)境，使得根系生長環(huán)境變得有利，根系呼吸速率、抗氧化酶活性提高，丙二醛含量降低，植株抗性增強(qiáng)，從而有利于植株的生長，有效地緩解了蘋果連作障礙。

土壤酶參與土壤中復(fù)雜多樣的生物化學(xué)反應(yīng)，脲酶可催化水解土壤中的尿素產(chǎn)生氨，促使有機(jī)氮向植物有效態(tài)氮轉(zhuǎn)化，蔗糖酶通過水解蔗糖提高土壤可溶性營養(yǎng)物質(zhì)含量，在土壤碳素循環(huán)過程中起關(guān)鍵作用。土壤磷酸酶主要是催化水解加速土壤有機(jī)磷轉(zhuǎn)化過程，而過氧化氫酶分解微生物體內(nèi)的過氧化氫，減少毒害作用[34–35]。輕微的環(huán)境改變會使土壤酶活性發(fā)生變化，酶活性高低可以在一定程度上反映土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化能力和土壤供應(yīng)植物根系養(yǎng)分的潛在能力[36–38]。研究表明，隨連作年限增加，土壤中過氧化氫酶、脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性均呈顯著降低趨勢，而施用活的微生物菌劑能夠顯著提高連作土壤中脲酶、磷酸酶、蔗糖酶和過氧化氫酶活性[39]。尤其是在熏蒸劑處理后，加入生物菌肥能夠使土壤酶活性趨于恢復(fù)和提升，從而快速形成更利于植物生長的土壤微環(huán)境[40]。本研究中，施入發(fā)酵產(chǎn)物后，連作土壤中的脲酶、磷酸酶、蔗糖酶和過氧化氫酶活性均有不同程度的提高，這與劉麗英等[41]研究結(jié)果一致。與連作對照處理相比，普通青霉D12 發(fā)酵產(chǎn)物處理(R1)和發(fā)酵產(chǎn)物混合處理(R3)土壤中脲酶、磷酸酶和蔗糖酶的活性在施用發(fā)酵產(chǎn)物后都顯著增加，而羅伊氏乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)物處理(R2)后，蔗糖酶活性、脲酶和磷酸酶活性逐月依次提高。這可能是因?yàn)槠胀ㄇ嗝笵12 和羅伊氏乳桿菌發(fā)酵后發(fā)酵產(chǎn)物施入土壤發(fā)揮的作用不同所導(dǎo)致時效性的差異。其中發(fā)酵產(chǎn)物混合處理(R3)的效果最好，可能是因?yàn)槠胀ㄇ嗝笵12 和羅伊氏乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)物混合后存在某些協(xié)同作用[42–44]。

諸多研究表明青霉菌生命力強(qiáng)，能夠通過競爭營養(yǎng)和空間來限制病原菌的生長[45–47]。并且青霉菌能夠產(chǎn)生豐富的次級代謝產(chǎn)物，包括聚酮類、生物堿類、萜類、大環(huán)內(nèi)酯等，普遍具有抑菌活性[48]。有些青霉菌被證實(shí)具有一定的溶磷特性，且具有一定的促生效果[49]。乳酸菌作為公認(rèn)的有益微生物，其代謝產(chǎn)生的活性物質(zhì)被證明具有抗真菌活性，如有機(jī)酸、過氧化氫和細(xì)菌素，并且細(xì)菌素被認(rèn)為是抗生素最有潛力的替代物，不同的乳酸菌所分泌的活性物質(zhì)存在種類、數(shù)量和濃度上的差異，從而導(dǎo)致抑菌能力的差別[50–52]?，F(xiàn)有研究報道，生防菌對蘋果連作障礙具有一定防治效果。生防菌通過調(diào)節(jié)土壤微生態(tài)環(huán)境對蘋果連作土壤中的病原菌有良好的抑制效果，能夠改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，并且促生效果明顯[53–57]。在本研究中，平邑甜茶幼苗地徑和根系呼吸速率與土壤脲酶、磷酸酶和蔗糖酶活性極顯著正相關(guān)，而與鐮孢菌、鏈格孢菌和枝孢菌屬存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。土壤酶來源于微生物，微生物群落結(jié)構(gòu)對植物生長有重要影響。連作會導(dǎo)致土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)破壞，由于病原菌如鐮孢屬真菌對不同的土壤條件具有高度的適應(yīng)性，所以一旦其成功地在土壤中定殖就會不斷積累，很難被徹底清除，土壤特性就會由細(xì)菌型向真菌型轉(zhuǎn)變[10,58]。鐮孢屬(Fusarium)侵染根部后，會誘導(dǎo)導(dǎo)管堵塞，阻礙水分通過木質(zhì)部的運(yùn)輸，導(dǎo)致蘋果幼苗光系統(tǒng)損傷，還會產(chǎn)生毒素?fù)p害植物組織[59]。由PCoA分析和聚類分析結(jié)果可知，施用發(fā)酵產(chǎn)物對連作土壤真菌群落影響較大，并且單一發(fā)酵產(chǎn)物處理(R1、R2)與混合發(fā)酵產(chǎn)物處理(R3)對連作土壤真菌群落影響是不同的。連作土壤中可培養(yǎng)真菌數(shù)量顯著降低，可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量顯著增加，鐮孢屬、鏈格孢屬、枝孢菌屬相對豐度降低，說明施入發(fā)酵產(chǎn)物100天中，連作土壤正逐步向有利的細(xì)菌型轉(zhuǎn)變，施用發(fā)酵產(chǎn)物可以改善連作土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，使其往有利的方向發(fā)展。

4 結(jié)論

在土壤中添加普通青霉D12 發(fā)酵產(chǎn)物、羅伊氏乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)物及其混合發(fā)酵產(chǎn)物均促進(jìn)平邑甜茶幼苗生長，增強(qiáng)根系活力，提高土壤酶和根系保護(hù)性酶活性，降低丙二醛含量，可培養(yǎng)真菌數(shù)量顯著降低，可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量顯著增加，鐮孢屬相對豐度降低，改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，使其往有利的方向發(fā)展，其中以普通青霉D12 和羅伊氏乳桿菌混合發(fā)酵產(chǎn)物處理效果最佳，可作為防控蘋果連作障礙綠色有效的措施。